專利名稱：一種誘導抗腫瘤免疫的方法及其在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種誘導抗腫瘤免疫的方法，本發明還涉及該方法在制藥中的應用。
背景技術：
隨著基因轉移技術的發展[1，2]，人們發現了癌基因的存在[3]，這為我們闡明了腫瘤來源于正常細胞但又不同于正常細胞的關系。腫瘤的發生包含許多級聯事件，比如無限增殖、持續的血管生成和組織侵入等[4]。腫瘤細胞通常表達腫瘤特異性抗原或是腫瘤相關抗原，這構成了宿主免疫系統攻擊的標靶。抗體可以通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒活性和補體依賴的細胞毒活性攻擊腫瘤。而免疫細胞，例如自然殺傷細胞和細胞毒T細胞則可以通過細胞間相互作用裂解腫瘤細胞。同時，T輔助細胞分泌的細胞因子可以調節上述反應。盡管機體的免疫系統對細胞的異常進行著嚴密的監控，但是腫瘤的發生和生長并不能被完全禁止。一系列的機理已經被提出來解釋免疫監視的失敗，比如，腫瘤抗原的丟失，主要組織相容性分子和共刺激分子表達的下調，抑制性細胞因子的過量表達等等[5，6，7，8]。經過一個世紀的努力，科學家們在不斷的嘗試彌補腫瘤患者免疫系統的漏洞。
自從William Cloey第一次利用大腸桿菌裂解物成功地在腫瘤患者身上誘導了系統性的抗腫瘤免疫以后，許多策略被發展出來喚醒癌癥患者的免疫系統[9]。在對Coley毒素作用機理了解的基礎之上，淋巴因子被引入腫瘤治療，其中IL-2展現了針對腫瘤的突出療效，盡管它存在著劑量相關的毒性[10，11，12]。腫瘤裂解物也被用來嘗試誘導抗腫瘤活性，并展現出了令人鼓舞的結果[13，14]。它包含了腫瘤細胞所有的抗原，并且可以引起多克隆反應。但是，由于在裂解物中腫瘤抗原的含量有限，因此所引起的免疫反應并不強烈。用射線照射過的腫瘤細胞是另一種提供所有腫瘤抗原的方式，它可以提供全部的腫瘤抗原庫[15，16，17]。但是，盡管處理過的腫瘤細胞可以在細胞膜上遞呈抗原并誘導細胞免疫，但是由輻射引起的細胞完整性和細胞膜流動性的損失會減少腫瘤細胞疫苗的免疫原性[18，19，20，21]。在此基礎上，利用基因工程令腫瘤細胞表達細胞因子和共刺激分子改善腫瘤細胞免疫原性也被嘗試[22，23，24，25]。在腫瘤抗原鑒定工作取得突破進展的基礎上，利用腫瘤相關抗原和腫瘤特異性抗原制備的腫瘤疫苗的方式也被嘗試[26，27，28]。一系列的腫瘤抗原，比如黑色素瘤的MART-1，gp100和TRP2等被陸續鑒定出來。作為最強大的抗原遞呈細胞，樹突細胞近年來成為被關注的焦點。由于樹突細胞表面表達大量的MHC分子和共刺激分子，用腫瘤抗原肽刺激樹突細胞、向樹突細胞中轉染腫瘤抗原cDNA或是將樹突細胞與腫瘤細胞融合制成的疫苗都可以激發抗腫瘤免疫[29，30，31]。但是，我們應當看到的是樹突細胞的制備和樹突細胞與腫瘤細胞融合疫苗的制備仍然離臨床應用有一段距離。
利用活腫瘤細胞誘導免疫反應已經在不同的腫瘤細胞系中進行了嘗試[32，33，34]。GM-CSF在其它抗腫瘤免疫方式的增強作用也已經被探索[33]。
腫瘤組織的生長需要消耗大量營養，這些營養的運輸又需要血管的支持，這使得腫瘤具有血管依賴性。針對腫瘤血管的抗腫瘤研究也是攻克腫瘤的方向之一。該方法具有以下優點(1)血管是藥物很容易到達的作用靶點；(2)殺傷腫瘤血管可以間接的殺傷更多數量的腫瘤細胞；(3)相對于不同腫瘤細胞間的差異，腫瘤血管有較高的同源性，針對腫瘤血管的治療可以適用于多個腫瘤類型；(4)針對腫瘤血管內皮細胞的免疫可以導致腫瘤血管的栓塞，從而使腫瘤細胞失去營養支持。目前已有采用固定后的原代臍靜脈血管內皮細胞誘導抗腫瘤免疫[41，42]，但沒有利用活原代臍靜脈血管內皮細胞和腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白提取物誘導抗腫瘤免疫的方法。

發明內容
本發明的目的是針對上述問題提供一種利用活細胞、細胞凍干粉、活原代臍靜脈血管內皮細胞或腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白提取物誘導抗腫瘤免疫的方法。
本發明另一個目的是提供上述方法在制備抗腫瘤藥中的應用。
本發明的目的是通過下列技術措施實現的一種誘導抗腫瘤免疫的方法，該方法是利用103～104劑量活骨髓瘤FO細胞誘導抗腫瘤免疫；或者，利用GM-CSF轉染的骨髓瘤FO細胞凍干粉誘導抗腫瘤免疫；或者，利用原代人臍靜脈血管內皮細胞誘導抗腫瘤免疫；或者，利用腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白提取物誘導抗腫瘤免疫的方法。
所述的方法，其中利用103～104數量級的活骨髓瘤FO細胞誘導抗腫瘤免疫的方法的步驟是a.培養活骨髓瘤FO細胞；
b.通過最大安全劑量的試驗來保留其免疫原性并降低致瘤性，c.采取確定的最大安全劑量誘導抗腫瘤免疫，d.對其所誘導的體液免疫與細胞免疫效果進行測量。
所述的方法，其中利用GM-CSF轉染的骨髓瘤凍干粉誘導抗腫瘤免疫的方法，包括通過利用重組GM-CSF基因的腺病毒制備分泌GM-CSF的骨髓瘤，該細胞直接凍干為凍干粉，利用該凍干粉誘導抗腫瘤免疫，對所誘導的體液免疫與細胞免疫效果進行測量。
所述的方法，其中利用活原代臍靜脈血管內皮細胞誘導抗腫瘤免疫的方法包括活原代臍靜脈血管內皮細胞的制備，利用該細胞誘導抗腫瘤免疫，對所誘導的細胞免疫與體液免疫效果進行測量。
所述的方法，其中利用腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白提取物誘導抗腫瘤免疫的方法，包括利用生物素標記腫瘤血管內皮細胞，將腫瘤血管內皮細胞破碎勻漿，采用單體親和素親和層析柱收集腫瘤血管內皮細胞膜蛋白，利用該蛋白誘導抗腫瘤免疫，對誘導的細胞免疫與體液免疫效果進行測量。
上述任一方法在制備抗腫瘤藥物中的應用。
本發明的有益效果1.本發明第一次提出了采用低劑量(103-104)活骨髓瘤FO細胞誘導自身抗腫瘤免疫，且活骨髓瘤FO細胞與樹突-骨髓瘤融合細胞均顯著地提高了小鼠的生存率。因為沒有諸如抗原遞呈細胞、細胞因子、共刺激分子等外來調節因素涉及，所以該保護性反應展現的是自體抗腫瘤機制。我們進一步的實驗證明了供體免疫小鼠的淋巴細胞在過繼免疫實驗中可以抑制骨髓瘤的生長，而血清則未見明顯效果。同時，體外CTL實驗也證明了免疫小鼠的T細胞具有裂解骨髓瘤的能力。在免疫小鼠T細胞體外激活時，其分泌的IFN-γ也上升了10倍之多，表明細胞免疫在抑制腫瘤生長過程中起著關鍵作用。本發明通過低劑量活骨髓瘤誘導了強大的細胞免疫，并且該免疫反應可以充分的預防和抑制骨髓瘤生長。
2.與前人發現樹突腫瘤融合細胞疫苗沒有致瘤性不一致的是[30]，本發明發現BALB/c小鼠注射106樹突-骨髓瘤FO細胞可以導致小鼠腫瘤生長。雖然樹突-骨髓瘤融合疫苗的致瘤性可通過照射γ射線得到了抑制，但是其所激發的保護性免疫也有所減弱。為了避免腫瘤發生并能夠達到較好的抗腫瘤免疫效果，本發明提供了活骨髓瘤FO細胞和樹突-骨髓瘤融合細胞的安全注射劑量。
3.由于腫瘤細胞的免疫原性很差，所以將機體的免疫耐受轉變為保護性的免疫反應存在著一定難度。本發明則展示了活的骨髓瘤FO細胞誘導出與活樹突-骨髓瘤融合細胞一樣強大的抗腫瘤免疫。這是由于骨髓瘤FO細胞保留了部分免疫原性并減少了部分致瘤性所致。首先，作為骨髓瘤特殊性之一，免疫球蛋白被表達于細胞表面，其互補決定區是宿主攻擊的絕佳標靶[35，36]。其次，骨髓瘤FO細胞衍生于骨髓細胞，這是一群高表達共刺激分子的細胞群，骨髓瘤FO細胞也保留了表達ICAM-1的能力[37，38]。第三，骨髓瘤FO細胞具有異質性，并且只有其中一小部分具有強烈的致瘤性[39，40]。因此，強致瘤性腫瘤的移植可以通過降低骨髓瘤的注射劑量來避免。我們的實驗證明了骨髓瘤的致瘤性在低劑量注射時有所下降。因此，本發明從免疫原性的保留和致瘤性的降低兩方面使得利用低劑量骨髓瘤誘導保護性的免疫反應成為可能。
4.本發明采用直接凍干的方法制備腫瘤裂解物，與傳統的制備方法有所不同。經典的腫瘤裂解物是將腫瘤細胞機械破碎或反復凍融再凍干獲得，其蛋白抗原會因降解為小分子而導致免疫原性下降。但是本文所采用的直接凍干的方法，不但避免了這種風險而且還保持了蛋白質相互交聯的結構，有利于更好的激活宿主的免疫系統。本發明采用轉染GM-CSF的骨髓瘤FO細胞凍干粉免疫小鼠，產生了較好的抗腫瘤效果，并證明針對骨髓瘤的抗體在其中發揮了關鍵作用。
5.在發現腫瘤的血管生成在腫瘤的發展中起著重要作用后，包括單克隆抗體在內的多種血管生成抑制因子被用于抑制腫瘤的生長和轉移。但是，誘導針對血管內皮細胞的細胞免疫反應的方案則少見報導。前人采用3％多聚甲醛固定的血管內皮細胞誘導了針對腫瘤血管的體液免疫，并取得了一定的療效[41]。也有科研工作者利用0.025％戊二醛固定的血管內皮細胞誘導抗腫瘤免疫，發現細胞免疫也被激活[42]。這樣的差別可能是由于固定帶來的免疫原性及細胞活性的變化引起的。本發明所描述的利用活血管內皮細胞誘導的抗腫瘤免疫中，細胞免疫與體液免疫均被激活。
6.本發明提供了利用腫瘤血管膜表面蛋白誘導抗腫瘤免疫的方法。本方案不涉及細胞的培養，周期更短。相對于全細胞蛋白，膜表面蛋白中可誘導抗腫瘤免疫的有效抗原含量更高，效果更強。此外，采用細胞膜蛋白提取物相對于采用細胞本身具有更高的安全性。


圖1樹突細胞的表型在無血清RPMI1640的環境中貼壁的小鼠單核細胞在含有10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的培養基中培養4天，并分化為樹突細胞。其形態表現出明顯的樹狀突起。本圖的原始放大倍數為200倍。
圖2樹突細胞表面分子的表達情況樹突細胞收獲以后，分別與PE(藻紅素)偶聯的抗ICAM-1和抗B7-1單抗以及FITC(熒光素)標記的抗B7-2和抗MHC-II單抗于室溫保溫1h。所有的樣品用PBS洗滌后，用流式細胞儀檢測熒光。結果表明，樹突細胞表面的共刺激分子和MHC-II分子皆大量表達。
圖3樹突-骨髓瘤融合細胞表面分子的表達情況樹突-骨髓瘤融合細胞收獲以后，分別與PE偶聯的抗ICAM-1和抗B7-1單抗以及FITC標記的抗B7-2和抗MHC-II單抗于室溫保溫1h。所有的樣品用PBS洗滌后，用流式細胞儀檢測熒光。結果表明，與樹突細胞相似，樹突-骨髓瘤融合細胞表面的共刺激分子和MHC-II分子均大量表達。
圖4轉染GM-CSF的骨髓瘤FO細胞用無血清RPMI1640稀釋10倍的重組GM-CSF腺病毒懸液孵育細胞。37℃培養1小時后，分別加入小牛血清和無血清RPMI1640，調整血清濃度至10％，并于孵箱培養24小時。收集轉染和未轉染的骨髓瘤FO細胞，用2％多聚甲醛固定15分鐘，再用含0.5％Triton X-100及0.5％BSA的PBS滲透細胞膜。用PE偶聯的抗小鼠GM-CSF的抗體(0.5μg/106個細胞)室溫染色1小時并在熒光顯微鏡下觀察。(A、轉染骨髓瘤FO細胞可見光照片；B、未轉染骨髓瘤FO細胞可見光照片；C、轉染骨髓瘤FO細胞熒光照片；D、未轉染骨髓瘤FO細胞熒光照片。)圖5大鼠肺血管內皮的生物素標記生物素標記和未標記的大鼠肺用HRP-Streptavidin染色，用蘇木精復染，以檢測生物素標記情況。A生物素標記肺。大血管(粗箭頭所示)和肺泡毛細血管(細箭頭所示)的內皮膜蛋白因為被生物素標記而呈陽性。B在生物素標記肺中，支氣管(▲所示)因為未被生物素標記而呈陰性，而毛細血管呈陽性(細箭頭所示)。C未經生物素標記的大鼠肺呈陰性。Scale bar100μm。
圖6生物素標記的內皮膜蛋白的分離純化EP指單價親和素親和柱的洗脫蛋白(Eluted Proteins)；LH指肺勻漿液蛋白(LungHomogenate)。兩個電泳道上樣等量的蛋白質。A銀染的聚丙烯酰胺凝膠。兩個泳道顯示了不同的蛋白質條帶。有些蛋白質在EP中富集(用表示)，而有些蛋白質在EP中減少或者消失(用表示)。B用HRP-Streptavidin檢測的免疫印跡。盡管兩個泳道上樣了等量的蛋白質，但是EP所含的生物素標記蛋白是LH的10倍以上。說明通過親和層析，生物素標記被有效分離純化了。
圖7低劑量活骨髓瘤FO細胞對骨髓瘤的預防效果BALB/c小鼠分別用103活骨髓瘤、104活樹突-骨髓瘤融合細胞和106γ射線照射的樹突-骨髓瘤融合細胞免疫，每組5只。每兩周免疫一次，共免疫三次。在末次免疫后一周接種106骨髓瘤并每天觀測腫瘤生長情況，直至60天。結果表明，全部對照小鼠長出了腫瘤，并于44天內全部死亡。相比之下，免疫組小鼠的生存率有不同程度的提高。其中，低劑量活骨髓瘤和樹突-骨髓瘤融合細胞避免了80％的小鼠腫瘤發生，而照射處理的樹突-骨髓瘤融合細胞只保護了60％的小鼠不生成腫瘤。
圖8低劑量活骨髓瘤針對異源腫瘤的預防效果用103骨髓瘤FO細胞免疫C57BL/6小鼠，每兩周免疫一次，共免疫三次，每組5只。在末次免疫后一周接種106LLC腫瘤，并每天觀測腫瘤生長情況直至小鼠全部死亡。結果表明，與對照組相比，免疫組小鼠的生存率及生存時間均無顯著差異。
圖9活血管內皮細胞對骨髓瘤和LLC的預防免疫效果C57BL/6J與BALB/c小鼠每周一次連續4周接受106活血管內皮細胞免疫后，分別于末次免疫一周后接種106LLC(A)或FO(B)腫瘤細胞(n＝5)。腫瘤的生長狀況被持續觀測一個月。“*”表示兩組腫瘤體積間有顯著差異(P＜0.05)。
圖10活血管內皮細胞免疫延長腫瘤切除小鼠的壽命接種106LLC腫瘤細胞的C57BL/6J小鼠在切除腫瘤后每周一次連續3次免疫活血管內皮細胞，其腫瘤大小(A)和生存時間(B)被觀測。“*”表示兩組之間的生存時間存在顯著差異(P＜0.05)。
圖11腫瘤血管膜表面蛋白誘導的抗腫瘤免疫效果6-8周齡的雄性C56BL/6J小鼠用于腫瘤免疫預防實驗。免疫組5只，每次免疫使用純化的腫瘤肺血管內皮膜蛋白100μg和等體積的弗氏完全佐劑混合免疫；對照組5只，注射等體積PBS。兩組小鼠均腹腔注射，共免疫4次。末次免疫后第七天給兩組小鼠皮下植入LLC腫瘤細胞，均為5×105個細胞/只。記錄腫瘤小鼠生存率。
圖12活血管內皮細胞免疫血清對血管內皮細胞的生長抑制梯度濃度(10μl、20μl、30μl)的活血管內皮細胞免疫小鼠的血清被加入血管內皮細胞和SPC-A-1的培養上清中。結果表明，血管內皮細胞的生長收到抑制，而SPC-A-1的生長則未受影響。
圖13低劑量活骨髓瘤FO細胞過繼免疫實驗供體BALB/c小鼠接受103骨髓瘤FO細胞免疫，每兩周免疫一次，共免疫三次，并于末次免疫后一周提取淋巴細胞和制備血清。受體小鼠在接種106骨髓瘤FO細胞后一周于尾靜脈分別注射免疫小鼠的100μl血清或7×107淋巴細胞。實驗結果表明，骨髓瘤的生長受到了淋巴細胞的抑制，而血清則未見明顯效果。
圖14活血管內皮細胞過繼免疫實驗將活血管內皮細胞免疫小鼠的血清和T淋巴細胞分別注射于接種106SPC-A-1的nude小鼠及接種106FO的BALB/c小鼠，腫瘤生長情況被觀測。結果表明，免疫小鼠的血清和T淋巴細胞均表現出抗腫瘤活性。“*”表示不同組間小鼠腫瘤的大小具有顯著性差異(P＜0.05)。
圖15活血管內皮細胞免疫誘導腫瘤壞死接種106FO細胞的腫瘤小鼠在接受注射活血管內皮細胞免疫小鼠的T淋巴細胞后，其腫瘤組織被制成切片觀測。結果表明，與注射PBS的腫瘤小鼠切片相比，注射T淋巴細胞的小鼠腫瘤組織中出現出血(箭頭)、壞死(大箭頭)和炎癥浸潤(小箭頭)的現象。
圖16腫瘤凍干粉疫苗預防免疫模型生存曲線收獲未轉染與轉染的骨髓瘤FO細胞，用PBS洗滌三次，計數，離心去上清并凍干。將凍干粉用PBS溶解，與弗氏完全佐劑1∶1混勻。每組含5只小鼠，每只皮下注射1×106個細胞的凍干粉。小鼠每兩周免疫一次，共免疫兩次。末次免疫后一周背部皮下接種1×106個骨髓瘤FO細胞，持續觀察腫瘤生長55天。
圖17低劑量活骨髓瘤FO細胞免疫小鼠血清抗體滴度檢測將骨髓瘤FO細胞分別與1∶100稀釋的骨髓瘤FO(A)或樹突-骨髓瘤融合細胞(B)免疫的小鼠血清保溫，之后再與FITC標記的兔抗小鼠二抗保溫。洗滌后，于流式細胞儀檢測樣品熒光。結果表明，與對照組小鼠血清相比，免疫小鼠血清對骨髓瘤的抗體滴度無顯著差異。
圖18T細胞純度鑒定采用經典尼龍毛柱法從小鼠淋巴細胞中提取T細胞。將重懸于含有5％小牛血清RPMI1640培養基的淋巴細胞通過37℃預熱的尼龍毛柱，收集穿過的細胞即為T淋巴細胞。將T細胞與其特異性的PE偶聯的抗小鼠CD3抗體保溫，并用流式細胞儀檢測熒光計算T細胞純度。結果表明，T細胞純度達到了78.46±8.01％。
圖19低劑量活骨髓瘤FO細胞免疫小鼠T細胞CTL功能檢測采用尼龍毛柱法從免疫小鼠(A、低劑量骨髓瘤，B、樹突-骨髓瘤融合細胞)脾臟中提取的T細胞按照5∶1的比例與50μg/ml絲裂霉素C預處理的骨髓瘤FO細胞或樹突-骨髓瘤融合細胞共同孵育72小時。T細胞被收獲后與目標骨髓瘤FO細胞分別以圖示的效靶比孵育6小時。裂解細胞釋放在上清中的乳酸脫氫酶含量被測定并計算出裂解百分比。結果表明，免疫小鼠的T淋巴細胞展現出裂解骨髓瘤FO細胞的能力，并與效靶比呈正相關。
圖20低劑量活骨髓瘤FO細胞誘導分泌的細胞因子檢測提純的T細胞與50μg/ml絲裂霉素C預處理的骨髓瘤FO細胞或樹突-骨髓瘤融合細胞以5∶1的比例在含有10％胎牛血清、50U/mlIL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養基中孵育72小時，其上清中分泌的IFN-γ和IL-4用夾心ELISA試劑盒測量。結果表明，與細胞免疫相關的Th1類細胞因子IFN-γ的表達有大幅上升，而與體液免疫相關的Th2類細胞因子IL-4的表達則未見明顯變化。
圖21轉染GM-CSF骨髓瘤凍干粉免疫小鼠血清抗體的檢測將末次免疫后一周的小鼠取血，制備血清。將骨髓瘤FO細胞分別與1∶100稀釋的轉染的骨髓瘤凍干粉免疫小鼠血清及對照組小鼠血清保溫。之后與PE標記的抗小鼠二抗保溫，并用流式細胞儀檢測熒光。
圖22轉染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉誘導的CTL功能檢測末次免疫后一周取小鼠脾臟細胞，并用尼龍毛柱法提純T細胞作為效應細胞。將骨髓瘤FO細胞與50μg/ml絲裂霉素C在37℃保溫1小時，再與T細胞以1∶10的比例在含有10％胎牛血清、50U/mlIL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養基中共同孵育3天進行體外激活。之后，將T細胞與骨髓瘤FO細胞按照效靶比40∶1、20∶1、10∶1、5∶1的比例保溫4小時，按照試劑盒說明書對其上清釋放的LDH含量進行測定并計算殺傷率。
圖23活血管內皮細胞誘導的CTL功能檢測活血管內皮細胞免疫小鼠的T淋巴細胞被提取并在體外激活后分別與血管內皮細胞(A)和骨髓瘤FO細胞(B)培養。結果表明，該T細胞具有裂解血管內皮細胞的能力，并呈現T細胞劑量相關性，但不具備裂解骨髓瘤FO細胞的能力。
圖24活血管內皮細胞誘導分泌的細胞因子檢測活血管內皮細胞免疫小鼠的血清(A)及其T淋巴細胞體外激活釋放的上清(B)被用來檢測細胞因子的釋放。結果表明，其血清和細胞上清中的IFN-γ和IL-4均顯著的升高。這說明活血管內皮細胞免疫小鼠的體液免疫和細胞免疫均被激活。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的闡述，但不限制本發明。
一般性說明實施例中未注明具體條件的實驗方法，均為本領域普通技術人員公知的方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進行。
本申請中提及的生物材料及試劑均有商品供應或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對本發明不是唯一的，可分別用其它適合的生物材料和試劑來代替。
發明材料1.小鼠品系6至8周雌性BALB/c、C57BL/6和Nu/Nu BALB/c小鼠，購自上海實驗動物中心。
2.細胞系及其培養BALB/c同源的骨髓瘤細胞系FO和C57BL/6同源的肺癌細胞系LLC均購自ATCC(美國模式培養物收集中心)。人肺癌細胞SPC-A-1購于上海細胞庫。FO、LLC及SPC-A-1細胞均使用含有10％熱滅活新生牛血清(GIBCO，Grand Island，NY)、2mM L-谷胺酰胺(Hyclone，Logan，Utah)、2mg/ml碳酸氫鈉(Amersco，Cleveland，OH)、25mM HEPEs(Promega，Madison，WI)、100U/ml青霉素(華北制藥集團公司，石家莊，中國)和100μg/ml鏈霉素(魯抗制藥，濟寧，中國)的RPMI1640培養基培養。新提取的原代T細胞則培養于含有10％熱滅活的胎牛血清、50U/ml重組人白介素-2(北京四環制藥，北京，中國)，5μg/ml伴刀豆球蛋白(Promega，Madison，WI)、2mML-谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氫鈉、25mM HEPEs、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中。人原代臍靜脈血管內皮細胞培養于含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)90μg/ml肝素鈉(Sigma，St.Louis，MO)、2ng/ml bFGF(R&D，USA)、100μg/ml青霉素和100μg/ml的鏈霉素的IMDM培養液中。
主要試劑重組GM-CSF的腺病毒Adv-1/GM-CSF(購自南京大學分子醫學研究所)；定量GM-CSF的夾心ELISA所用捕捉抗體和檢測抗體均購于biolegend公司，HRP偶聯的親和素購于Pharmingen公司。顯色底物TMB購于KPL公司。藻紅素(PE)標記的抗小鼠GM-CSF抗體購于eBioscience公司。藻紅素標記的抗ICAM-1和抗B7-1單抗以及熒光素(FITC)標記的抗B7-2單抗購于Pharmingen公司。熒光素標記的抗MHC-II單抗購于Southern Biotechnology公司。CTL實驗所用CytoTox 96 non radioactivecytotoxicity assay試劑盒購于Promega公司。檢測IFN-γ和IL-4的夾心ELISA試劑盒購于Pharmingen公司。提純T細胞所用尼龍毛購于Polysciences公司。
3統計方法統計學顯著性差異用學生t檢驗計算。
實施例1低劑量活骨髓瘤FO細胞誘導抗腫瘤免疫1、疫苗的制備1.1脾細胞衍生的樹突細胞小鼠脾臟中的紅細胞采用溶于0.01M Tris-HCl的8.3g/ml的氯化銨溶液裂解。未裂解脾臟細胞培養于含有2mM谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氫鈉、25mM HEPEs、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的無血清RPMI1640中。在5％CO2孵箱中培養1小時后，未貼壁細胞被洗去。貼壁脾臟細胞則繼續在含有10％胎牛血清、2mM谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氫鈉、25mM HEPEs、10ng/ml IL-4(PeproTech，UK)、10ng/ml GM-CSF(PeproTech，UK)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的培養基中培養，并分化為樹突細胞。培養4天后，貼壁和松散貼壁的樹突細胞通過輕輕吹打收獲，細胞表面展現出典型的樹狀突起(見圖1)。同時，一些共刺激分子，比如ICAM-1、B7-1、B7-2和MHC-II等的表達也急劇上調(見圖2)。
1.2細胞融合樹突細胞與骨髓瘤FO細胞的混合比例為1∶2.5。融合過程使用預熱的50％(w/v)的聚乙二醇(Sigma)。
1.3樹突細胞和樹突-骨髓瘤融合細胞表面抗原鑒定樹突細胞和采用PEG(聚乙二醇)制備的樹突-骨髓瘤融合細胞在用PBS洗滌后，分別與藻紅素(PE)偶聯的抗ICAM-1(Pharmingen)和抗B7-1(Pharmingen)單抗以及熒光素(FITC)標記的抗B7-2(Pharmingen)和抗MHC-II(Southern Biotechnology，Alabama)單抗于室溫保溫1h。所有的樣品用PBS洗滌后，用流式細胞儀(Becton Dickinson，Moutain View，CA)檢測熒光。
1.4融合細胞篩選在洗滌之后，融合細胞被培養于含有10％特級胎牛血清(Hyclone)，2mM谷胺酰胺，25mM HEPEs，2mg/ml碳酸氫鈉，10ng/ml GM-CSF，10ng/mlIL-4，5％(v/v)克隆因子(OriGen，Austin，Texas)，2％(v/v)HAT(氨基喋呤-胸苷-次黃嘌呤)(Sigma)，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基中。由于樹突細胞不能在體外無限增殖，HAT又限制了骨髓瘤FO細胞的生長，而樹突-骨髓瘤融合細胞則不然，在該培養基培養一周后則獲得單一的樹突-骨髓瘤融合細胞。經流式細胞儀檢測發現，樹突-骨髓瘤融合細胞表面共刺激分子表達與樹突細胞相似(見圖3)。
2活骨髓瘤FO細胞免疫最大安全劑量骨髓瘤FO細胞與樹突-骨髓瘤融合細胞在洗滌后重懸于無血清RPMI-1640培養基中。BALB/c小鼠注射骨髓瘤FO及樹突-骨髓瘤融合細胞劑量梯度共設5組，每組5只，分別在背部皮下分別注射102、103、104、105和106個骨髓瘤FO細胞。之后每天觀察小鼠腫瘤生長狀況，持續觀察兩周。結果顯示小鼠接種106樹突-骨髓瘤融合細胞和接種106骨髓瘤FO細胞都可以導致腫瘤形成。為了確定疫苗的安全劑量，我們在小鼠皮下接種了一系列的劑量。結果表明，在每只小鼠注射103骨髓瘤FO細胞和每只小鼠注射104樹突-骨髓瘤融合細胞的劑量組未見有腫瘤形成，但是在更高的劑量組中都有腫瘤出現(見表1)。因此，每只小鼠接種103活骨髓瘤FO細胞或104活樹突-骨髓瘤融合細胞被確定為免疫時采用的最大安全劑量。小鼠共免疫三次，每兩周免疫一次。
表1活細胞疫苗的最大安全劑量

a腫瘤發生率被表示為在整個組中腫瘤發生小鼠的數目。
b活樹突-骨髓瘤融合細胞的最大安全劑量為每只小鼠注射104個細胞。
c活骨髓瘤融合細胞的最大安全劑量為每只小鼠注射103個細胞。
3、疫苗抗腫瘤效果的評價3.1活細胞預防免疫抗腫瘤模型小鼠骨髓瘤FO模型骨髓瘤FO細胞、樹突-骨髓瘤融合細胞、經20Gyγ射線照射過的樹突-骨髓瘤融合細胞被收獲并分別重懸在無血清RPMI1640培養基中。雌性BALB/c小鼠分別被103活骨髓瘤FO細胞、104活樹突-骨髓瘤融合細胞、106γ射線照射過的樹突-骨髓瘤融合細胞免疫。細胞免疫一共進行三次，每兩周免疫一次。在最后一次免疫后一周皮下接種106活骨髓瘤FO細胞。之后每天觀察腫瘤生長狀況，直到用RPMI1640培養基免疫的對照組小鼠全部死亡，記錄其生存率。在接種106骨髓瘤FO細胞之后，對照組中全部小鼠都長出腫瘤并在44天內陸續死亡，而免疫組則表現出不同程度升高的生存率(見圖7)。并且，活的骨髓瘤FO細胞和樹突-骨髓瘤融合細胞比γ射線照射過的樹突-骨髓瘤融合細胞更加有效。有80％經活細胞免疫的小鼠避免了腫瘤發生，而照射過的樹突-骨髓瘤融合細胞只保護了60％的小鼠。同時，被保護的小鼠在其整個壽命中保持了無腫瘤的狀態。
小鼠肺腫瘤LLC模型為了評估低劑量骨髓瘤誘導的免疫是否能夠抵抗異源腫瘤，C57BL/6小鼠被用活骨髓瘤FO細胞免疫并接種LLC腫瘤細胞。收集骨髓瘤FO細胞重懸于無血清RPMI1640培養基中。雌性C57BL/6于背部皮下接種103活骨髓瘤FO細胞進行免疫。骨髓瘤FO細胞每兩周免疫一次，共免疫三次。在末次免疫一周后，給小鼠背部皮下接種106LLC細胞。每天觀測小鼠腫瘤生長情況直至全部小鼠死亡。沒有明顯證據表明該腫瘤受到了抑制(見圖8)，這揭示著活骨髓瘤誘導的免疫可能是骨髓瘤特異性的。
3.2活細胞過繼免疫抑制腫瘤生長實驗活骨髓瘤免疫BALB/c供體小鼠用103活骨髓瘤FO細胞免疫三次，每兩周免疫一次。其淋巴細胞和血清在末次免疫后7天收獲。受體小鼠則接種106骨髓瘤FO細胞或SPC-A-1細胞，并在接種后一周于尾靜脈分別注射末次免疫后一周供體免疫小鼠的7×107脾細胞或100μl血清治療。受體小鼠每三天注射一次，共注射4次。用游標卡尺測量腫瘤長徑和垂直徑，其大小由下列公式計算腫瘤體積＝0.5×腫瘤長徑×腫瘤垂直徑2，持續觀測直至所有對照組小鼠死亡為止。實驗結果表明，活骨髓瘤FO細胞免疫的淋巴細胞有抑瘤活性，而血清則未見明顯效果(見圖13)；3.3免疫小鼠血清中抗體的檢測低劑量骨髓瘤免疫將骨髓瘤FO細胞與1∶100稀釋的低劑量活骨髓瘤免疫小鼠血清或對照小鼠血清保溫，之后再與FITC標記的兔抗鼠二抗(Southern Biotechnology)保溫。洗滌后，于流式細胞儀檢測樣品熒光。結果見其熒光強度與對照組血清結果相比無顯著差異(見圖17)。這說明免疫血清中針對骨髓瘤的抗體滴度不高。這些數據表明，經免疫致敏的淋巴細胞而非血清在抑制腫瘤生長的過程中發揮著主要的作用。
3.4T細胞提取及純度鑒定采用經典尼龍毛柱法從小鼠淋巴細胞中提取T細胞。將重懸于5％小牛血清RPMI1640的淋巴細胞通過37℃預熱的尼龍毛柱，收集穿過的細胞即為T淋巴細胞。將T細胞與PE偶聯的抗小鼠CD3抗體保溫，并用流式細胞儀檢測熒光計算T細胞純度。結果表明，T細胞的純度達到了78.46±8.01％(見圖18)。
3.5CTL功能檢測利用尼龍毛柱從小鼠脾臟中提取的T細胞培養于24孔板中，并按照5∶1的比例與50μg/ml絲裂霉素C預處理的骨髓瘤FO或樹突-骨髓瘤融合細胞在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養基中共同孵育72小時。之后T細胞被收獲并與目標骨髓瘤FO細胞以不同的效靶比在U形底96孔板中孵育6小時。裂解細胞釋放在上清中的乳酸脫氫酶(LDH)含量使用CytoTox 96cytotoxicity assay kit(Promega)測定。LDH特異性的釋放百分比由下列公式計算特異性釋放百分比＝(實驗組釋放-T細胞自發釋放-骨髓瘤自發釋放)/(最大骨髓瘤釋放-骨髓瘤自發釋放)×100。結果證明，與對照組T細胞相比，提取自低劑量骨髓瘤或樹突-骨髓瘤融合細胞免疫小鼠的T細胞具有裂解骨髓瘤的能力(見圖19)。同時，裂解百分比也呈現出效靶比相關性。
3.6細胞因子分析提純的T細胞與50μg/ml絲裂霉素C預處理的骨髓瘤FO細胞以5∶1的比例在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養基中孵育72小時，T輔助細胞(Th)分泌于培養上清中分泌的IFN-γ和IL-4用夾心ELISA試劑盒(BD Pharmingen)測量。結果表明，與對照組相比，IFN-γ的分泌量提高了10倍多，而IL-4則未見明顯改變(見圖20)。因為Th1細胞與Th2細胞分別特異性的分泌IFN-γ或IL-4等細胞因子，上述數據表明，作為細胞免疫反應的一部分，Th1相關細胞因子表達明顯上升，而Th2相關的細胞因子則沒有顯著改變。
實施例2轉染GM-CSF的骨髓瘤FO細胞誘導抗腫瘤免疫1、疫苗的制備1.1將重組GM-CSF的腺病毒轉染骨髓瘤FO細胞用無血清RPMI-1640稀釋10倍的重組GM-CSF腺病毒懸液孵育細胞。37℃培養1小時后，分別加入小牛血清和無血清RPMI-1640，調整血清濃度至10％，并于孵箱培養24小時。
1.2轉染效率及GM-CSF分泌量的測定收集轉染和未轉染的骨髓瘤FO細胞，用2％(v/v)多聚甲醛固定15分鐘，再用含0.5％(v/v)Triton X-100及0.5％(w/v)BSA的PBS滲透細胞膜。用PE偶聯的抗小鼠GM-CSF的抗體(0.5μg/106個細胞)室溫染色1小時并在熒光顯微鏡下觀察。由圖4可見，與可見光照片及未轉染骨髓瘤照片比較，90％以上的骨髓瘤FO細胞被重組腺病毒轉染。分泌的GM-CSF采用夾心ELISA法定量。用抗小鼠GM-CSF的捕獲抗體(1μg/ml)鋪板，用含1％BSA，0.1％Tween 20的PBS封閉，再依次與轉染細胞上清、生物素標記的抗小鼠GM-CSF的檢測抗體(2μg/ml)及偶聯HRP的親合素保溫，并用TMB底物顯色，于450nm檢測。夾心ELISA測得轉染后骨髓瘤FO細胞培養上清中分泌GM-CSF的量為240ng/24小時/106個細胞。
1.3腫瘤細胞凍干粉的制備分別收獲未轉染與轉染的骨髓瘤FO細胞，用PBS洗滌三次，計數，離心去上清并直接凍干。
2、疫苗抗腫瘤效果的評價2.1免疫小鼠血清中抗體的檢測轉染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉免疫將骨髓瘤FO細胞與1∶100稀釋的轉染骨髓瘤凍干粉免疫小鼠血清或對照小鼠血清保溫，之后再與FITC標記的兔抗鼠二抗(Southern Biotechnology)保溫。洗滌后，于流式細胞儀檢測樣品熒光。結果見圖21，與對照小鼠相比，免疫小鼠的血清中存在可識別骨髓瘤的抗體。
2.2T細胞提取及純度鑒定采用經典尼龍毛柱法從小鼠淋巴細胞中提取T細胞。將重懸于5％小牛血清RPMI1640的淋巴細胞通過37℃預熱的尼龍毛柱，收集穿過的細胞即為T淋巴細胞。將T細胞與PE偶聯的抗小鼠CD3抗體保溫，并用流式細胞儀檢測熒光計算T細胞純度。結果表明，T細胞的純度達到了78.46±8.01％(見圖18)。
2.3CTL功能檢測利用尼龍毛柱從小鼠脾臟中提取的T細胞培養于24孔板中，并按照5∶1的比例與50μg/ml絲裂霉素C預處理的目標細胞在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養基中共同孵育72小時。之后T細胞被收獲并與目標骨髓瘤FO細胞以不同的效靶比在U形底96孔板中孵育6小時。裂解細胞釋放在上清中的乳酸脫氫酶(LDH)含量使用CytoTox 96 cytotoxicity assay kit(Promega)測定。LDH特異性的釋放百分比由下列公式計算特異性釋放百分比＝(實驗組釋放-T細胞自發釋放-骨髓瘤自發釋放)/(最大骨髓瘤釋放-骨髓瘤自發釋放)×100。由圖22可見，小鼠經轉染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉免疫后，其T細胞裂解骨髓瘤的能力與對照小鼠無顯著差異，未見針對骨髓瘤的細胞免疫。
2.4凍干粉疫苗的體內抗瘤活性本發明采用小鼠骨髓瘤預防免疫模型檢測凍干粉疫苗的抗腫瘤活性。將凍干粉用PBS溶解，與弗氏完全佐劑1∶1混勻。對照組、骨髓瘤凍干粉組和轉染骨髓瘤凍干粉組小鼠分別用PBS、骨髓瘤凍干粉或轉染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉免疫，每組含5只小鼠，每只皮下注射1×106個細胞的凍干粉。小鼠每兩周免疫一次，共免疫兩次。末次免疫后一周背部皮下接種1×106個骨髓瘤FO細胞，持續觀察腫瘤生長55天。由圖16可見，未經免疫的5只BALB/c小鼠于接種腫瘤細胞后40天全部死亡。單獨的骨髓瘤凍干粉免疫的5只BALB/c小鼠全部出現腫瘤，并于接種后第51天全部死亡。相比之下，轉染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉則抑制了3只BALB/c小鼠的腫瘤發生。這些數據表明，與對照組相比，單純的骨髓瘤凍干粉沒有顯著的抑瘤效果，但轉染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉則可以預防腫瘤的發生。
實施例3活原代臍靜脈血管內皮細胞誘導抗腫瘤免疫1、疫苗的制備1.1原代人血管內皮細胞的制備我們根據Jaffe EA等人的分離血管內皮細胞的方法進行制備[43]。新鮮的人臍靜脈血管被II型膠原酶消化，得到的人臍靜脈內皮細胞用含有10％FBS的IMDM培養基培養于1％明膠包被的培養皿中。
2、疫苗抗腫瘤效果的評價2.1活細胞預防免疫抗腫瘤模型小鼠骨髓瘤FO模型原代人臍靜脈內皮細胞被收獲并重懸在無血清RPMI1640培養基中。雌性BALB/c小鼠被106原代人臍靜脈內皮細胞免疫。每周免疫一次共免疫四次。在最后一次免疫后一周皮下接種106活骨髓瘤FO細胞。之后每天觀察腫瘤生長狀況，直到用RPMI1640培養基免疫的對照組小鼠全部死亡，記錄其生存率。
小鼠肺腫瘤LLC模型收集原代人臍靜脈血管內皮細胞并重懸于無血清RPMI1640培養基中。雌性C57BL/6于背部皮下接種106原代人臍靜脈內皮細胞進行免疫。每周免疫一次共免疫四次。在末次免疫一周后，給小鼠背部皮下接種106LLC細胞。每天觀測小鼠腫瘤生長情況直至全部小鼠死亡。
活血管內皮細胞對骨髓瘤及LLC腫瘤的預防免疫效果活血管內皮細胞顯著的減緩了骨髓瘤以及LLC腫瘤的生長(見圖9)，同時，免疫102到107劑量的小鼠均未出現不良反應。
2.2活血管內皮細胞免疫抑制黑色素瘤轉移6周齡C57BL/6小鼠被皮下接種5×105LLC細胞。當腫瘤生長至800mm3后，小鼠被深度麻醉并切除腫瘤。并于腫瘤切除3天后治療組小鼠用5×105個活血管內皮細胞免疫，每周免疫一次，連續免疫3周。對照組小鼠則用PBS代替。檢測小鼠的生存狀況。結果表明，小鼠的腫瘤轉移并未被抑制，但生存周期被顯著的延長。其生存周期從腫瘤接種后48.9天延長到59.5天，或是從腫瘤切除后30.9天延長到41.5天(見圖10)。
2.3活細胞過繼免疫實驗活血管內皮細胞免疫BALB/c供體小鼠用106活血管內皮細胞免疫三次，每周免疫一次。其淋巴細胞和血清在末次免疫后7天收獲。受體BALB/c小鼠接種106骨髓瘤FO細胞，并在接種后一周尾靜脈注射100μl血清或107T淋巴細胞治療。受體小鼠每三天注射一次，共注射4次。每兩天觀測一次小鼠腫瘤生長情況，直至所有對照組小鼠開始死亡為止。小鼠的腫瘤組織被制為切片觀察。在nude小鼠中接種106SPC-A-1細胞，于接種一周后連續兩周每周3次注射免疫小鼠的血清，觀測腫瘤的生長情況。實驗結果表明，活血管內皮細胞免疫的淋巴細胞與血清則均有抑瘤活性(見圖14)。同時，活血管內皮細胞過繼免疫免疫治療的小鼠腫瘤切片也可見嚴重的出血、壞死和炎癥現象(見圖15)。活血管內皮細胞免疫小鼠的血清可以有效的抑制血管內皮細胞的生長，而對腫瘤細胞SPC-A-1沒有明顯作用(見圖12)。
2.4免疫小鼠血清中抗體的檢測活血管內皮細胞將血管內皮細胞以106每孔的濃度培養于96孔板中過夜。分別將10μl、20μl、30μl活血管內皮細胞免疫小鼠的血清與血管內皮細胞孵育2天，用MTT法檢測血清作用。
2.5T細胞提取及純度鑒定采用經典尼龍毛柱法從小鼠淋巴細胞中提取T細胞。將重懸于5％小牛血清RPMI1640的淋巴細胞通過37℃預熱的尼龍毛柱，收集穿過的細胞即為T淋巴細胞。將T細胞與PE偶聯的抗小鼠CD3抗體保溫，并用流式細胞儀檢測熒光計算T細胞純度。結果表明，T細胞的純度達到了78.46±8.01％(見圖18)。
2.6CTL功能檢測利用尼龍毛柱從小鼠脾臟中提取的T細胞培養于24孔板中，并按照5∶1的比例與50μg/ml絲裂霉素C預處理的骨髓瘤FO或樹突-骨髓瘤融合細胞在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養基中共同孵育72小時。之后T細胞被收獲并與目標骨髓瘤FO細胞以不同的效靶比在U形底96孔板中孵育6小時。裂解細胞釋放在上清中的乳酸脫氫酶(LDH)含量使用CytoTox 96cytotoxicity assay kit(Promega)測定。LDH特異性的釋放百分比由下列公式計算特異性釋放百分比＝(實驗組釋放-T細胞自發釋放-骨髓瘤自發釋放)/(最大骨髓瘤釋放-骨髓瘤自發釋放)×100。結果表明，活血管內皮細胞免疫小鼠的T淋巴細胞展現了裂解血管內皮細胞的能力，并與T淋巴細胞劑量成相關性，但沒有發現其裂解腫瘤細胞FO的能力(見圖23)。由此可見，活血管內皮細胞免疫小鼠的細胞免疫均被激活。
2.7細胞因子分析提純的T細胞與50μg/ml絲裂霉素C預處理的活血管內皮細胞以5∶1的比例在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養基中孵育72小時，T輔助細胞(Th)分泌于培養上清中分泌的IFN-γ和IL-4用夾心ELISA試劑盒(BD Pharmingen)測量。結果顯示，在免疫小鼠的血清中IL-4與IFN-γ分別從30.3pg/ml和28.2pg/ml提高到152.5pg/ml和125.2pg/ml，而免疫小鼠T細胞體外激活后IL-4和IFN-γ的釋放量也從32.4和30.2上升到493.5pg/ml和257.2pg/ml(見圖24)。由此可見，活血管內皮細胞免疫小鼠的體液免疫被激活。
實施例4腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白提取物誘導抗腫瘤免疫1、腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白的制備腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白的制備將SD大鼠乳腺癌細胞13762培養至對數期(培養的方法是本領域普通技術人員公知技術)。用不含血清的McCoy’s 5A培養基懸浮細胞，并調節細胞濃度至1×106細胞/ml。每只SD大鼠尾靜脈注射1×10513762細胞，記錄大鼠體重。注射細胞10天后每天稱重大鼠，如果連續三天體重下降且超過10克，將大鼠麻醉進行肺灌流，用生物素標記大鼠肺腫瘤血管內皮細胞，并用HRP-streptavidin染色檢驗標記效果(圖5)。將肺組織剪為小塊后勻漿。在勻漿液中加入1/10體積的10％(w/v)SDS溶液，并混勻1h。4℃20,000rpm離心2h后，收集離心上清并對PBS透析24小時去除游離的生物素。再次于4℃20,000rpm離心1h，收集上清。用固定化的單體親和素親和柱對標記的腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白進行提純，并用銀染SDS-PAGE和Western-Blot檢驗蛋白的富集效果(見圖6)。
2、疫苗抗腫瘤效果的評價腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白免疫抑瘤實驗6-8周齡的雄性C56BL/6J小鼠被分為免疫組和對照組，每組5只，免疫組每次免疫使用腫瘤肺血管內皮膜蛋白100μg和等體積的弗氏完全佐劑混合免疫；對照組注射等體積PBS。兩組小鼠均腹腔注射，共免疫4次。末次免疫后第七天給兩組小鼠皮下植入LLC腫瘤細胞，均為5×105細胞/只。記錄腫瘤小鼠生存率(見圖11)。
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權利要求
1.一種誘導抗腫瘤免疫的方法，其特征在于利用103～104劑量活骨髓瘤FO細胞誘導抗腫瘤免疫；或者，利用GM-CSF轉染的骨髓瘤FO細胞凍干粉誘導抗腫瘤免疫；或者，利用原代人臍靜脈血管內皮細胞誘導抗腫瘤免疫；或者，利用腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白提取物誘導抗腫瘤免疫的方法。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于利用103～104數量級的活骨髓瘤FO細胞誘導抗腫瘤免疫的方法的步驟是a.培養活骨髓瘤FO細胞；b.通過最大安全劑量的試驗來保留其免疫原性并降低致瘤性，c.采取確定的最大安全劑量誘導抗腫瘤免疫，d.對其所誘導的體液免疫與細胞免疫效果進行測量。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于利用GM-CSF轉染的骨髓瘤凍干粉誘導抗腫瘤免疫的方法，包括通過利用重組GM-CSF基因的腺病毒制備分泌GM-CSF的骨髓瘤，該細胞直接凍干為凍干粉，利用該凍干粉誘導抗腫瘤免疫，對所誘導的體液免疫與細胞免疫效果進行測量。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于利用活原代臍靜脈血管內皮細胞誘導抗腫瘤免疫的方法包括活原代臍靜脈血管內皮細胞的制備，利用該細胞誘導抗腫瘤免疫，對所誘導的細胞免疫與體液免疫效果進行測量。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于利用腫瘤血管內皮細胞膜表面蛋白提取物誘導抗腫瘤免疫的方法，包括利用生物素標記腫瘤血管內皮細胞，將腫瘤血管內皮細胞破碎勻漿，采用單體親和素親和層析柱收集腫瘤血管內皮細胞膜蛋白，利用該蛋白誘導抗腫瘤免疫，對誘導的細胞免疫與體液免疫效果進行測量。
6.權利要求1～5任一所述的方法在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種誘導抗腫瘤免疫的方法及其在制藥中的應用。該方法利用10
文檔編號C12N5/10GK1887296SQ20061004086
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月31日 優先權日2006年7月31日
發明者劉建寧, 譚向陽, 張菁 申請人:南京大學生物制藥工程研究中心