專利名稱：一種微生物發(fā)酵法制備開(kāi)菲爾多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵法制備開(kāi)菲爾多糖的方法，涉及利用乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985發(fā)酵生產(chǎn)一種葡萄糖與半乳糖的比例為1∶10，含有β-糖苷鍵、特性粘度[η]為73.86[溶液濃度為1g/100mL]的新型開(kāi)菲爾多糖。
背景技術(shù)：
開(kāi)菲爾(Kefiran)多糖是1967年荷蘭的La.Riviere首次對(duì)開(kāi)菲爾粒的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究時(shí)所發(fā)現(xiàn)的一種具有一定彈性的粘性多糖，并命名開(kāi)菲爾粒中的這種纖維狀物質(zhì)為Kefiran。
開(kāi)菲爾多糖作為一種重要的生理活性物質(zhì)，具有抗真菌、抗細(xì)菌、降壓、降血糖、抗癌和抗腫瘤等功能特性。同時(shí)開(kāi)菲爾多糖具有阻止腫瘤的惡化，抑制癌細(xì)胞增殖，并且對(duì)形成干擾素β-皮甾醇和去甲腎上腺素具有促進(jìn)效果，是一種很好的消炎降壓及免疫激活物質(zhì)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，開(kāi)菲爾多糖可使胃液和小腸中的蛋白酶活性提高兩倍以上。已有研究表明，將開(kāi)菲爾多糖作為一種功能性食品組分添加到食品中，具有降低血壓功效。2005年研究表明，開(kāi)菲爾多糖在臨床醫(yī)學(xué)上用于抗菌、消炎、傷口愈合，廣泛地應(yīng)用于各種疾病診治中。
最早利用發(fā)酵法生產(chǎn)開(kāi)菲爾多糖的是Takao Mukai等，其在1989年將L.Kefiranofaciens培養(yǎng)在IKPL培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)3天，多糖的產(chǎn)量為63mg/L；1992年，Haruhiko Yokoi等報(bào)道了發(fā)酵法生產(chǎn)開(kāi)菲爾多糖的產(chǎn)量達(dá)2.04g/L；1998年，Takahiro Mitsue和Yusaku Fuiio利用Lactobacillus kefiranofaciens KF-75和Torulaspora delbrueckii IFO 1626混合培養(yǎng)的方法將開(kāi)菲爾多糖產(chǎn)量提高到3.7g/L；1999年T.Mitsue等研究了Lactobacillus kefiranofaciens與不同的酵母菌株混合培養(yǎng)對(duì)開(kāi)菲爾多糖產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)利用Lactobacillus kefiranofaciens單獨(dú)發(fā)酵生產(chǎn)得到的多糖產(chǎn)量為1.8g/L，與Torulaspora delbrueckii IFO 1626(TD-1626)混合培養(yǎng)6天得到的產(chǎn)量為2.3g/L，而將Lactobacillus kefiranofaciens與Torulaspora delbrueckii IFO 1626分批混合培養(yǎng)7天，產(chǎn)量可達(dá)3.7g/L。2003年，Benjamas Cheirsilp等通過(guò)Lactobacillus kefiranofaciens和Saccharomycescerevisiae混合培養(yǎng)來(lái)提高開(kāi)菲爾多糖的產(chǎn)量，經(jīng)分批混合培養(yǎng)87h，開(kāi)菲爾多糖的產(chǎn)量最終可達(dá)到5.41g/L；2004年，出現(xiàn)利用大米水解液進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)開(kāi)菲爾多糖的報(bào)道，其產(chǎn)量為5.04g/L。
Kooiman對(duì)開(kāi)菲爾多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究表明，其內(nèi)部葡萄糖和半乳糖之比為1∶1，多為中性；1987年，向井孝夫的研究也證明了Kooiman得到的結(jié)論。近年來(lái)的研究表明，Kefiran除具有Kooiman所報(bào)道的結(jié)構(gòu)外，還含有6-O-取代半乳糖的結(jié)構(gòu)。1987年T.Toba等在對(duì)開(kāi)菲爾粒中多糖組分進(jìn)行的凝膠色譜分析中發(fā)現(xiàn)開(kāi)菲爾粒中多糖有二個(gè)代表性分子量分別是4.0×106Da和1.0×106Da的峰。1990年，Haruniko yokoi也對(duì)此多糖進(jìn)行凝膠過(guò)濾色譜分析，發(fā)現(xiàn)上清液和莢膜多糖各有二個(gè)峰，上清液多糖的二個(gè)峰分別是4.0×106Da和1.5×106Da；莢膜多糖組分的二個(gè)峰分別為4.0×106Da和1.0×106Da。目前的研究指出，開(kāi)菲爾多糖是一種水溶性的中性支鏈多糖，分子量在1.0×106Da左右，含有幾乎相等的D-葡萄糖和D-半乳糖殘基，葡萄糖與半乳糖的比例為1∶1.05，其主鏈為由五個(gè)六碳糖組成的重復(fù)單元，并有一個(gè)或兩個(gè)糖殘基隨機(jī)連接在重復(fù)單元上。在25℃時(shí)，Kefiran的[α]D＝+54°；特性粘度[η]為5.4±0.5[溶液濃度為1g/100mL]。
開(kāi)菲爾多糖作為一種新型的活性多糖，由于其特殊的生物學(xué)特性，廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、功能性食品添加劑的領(lǐng)域，也引起國(guó)外學(xué)者的普遍關(guān)注和研究。而在國(guó)內(nèi)，隨著人們生活水平的提高，對(duì)功能性食品的需求和要求也越來(lái)越高，必須加大對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)開(kāi)菲爾多糖的研究力度，但至今未見(jiàn)國(guó)內(nèi)對(duì)開(kāi)菲爾多糖的研究報(bào)道，特別是與國(guó)外不同結(jié)構(gòu)類型的開(kāi)菲爾多糖的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵法制備開(kāi)菲爾多糖的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是利用乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985發(fā)酵菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)4天，采用工業(yè)級(jí)的麥芽汁和國(guó)產(chǎn)酵母粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)分子量數(shù)量級(jí)為1.5×105Da；葡萄糖與半乳糖的比率為1∶10；β-型吡喃多糖中含有β-糖苷鍵；特性粘度[η]為73.86[溶液濃度為1g/100mL]的新型開(kāi)菲爾多糖。
(1)菌株乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985，購(gòu)自日本大阪大學(xué)生物工程學(xué)院，見(jiàn)參考文獻(xiàn)Modelling and optimization of environmental conditions forkefiran production by Lactobacillus kefiranofaciens.Applied microbiology andBiotechnology，2001，57639-646。
(2)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，乙酸鈉5，磷酸二氫鉀2，檸檬酸三銨2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·5H2O 0.05，Tween 80l，pH 5.5。
基本發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)胰蛋白胨20，酵母膏10，牛肉膏20，磷酸二氫鉀2，乙酸鈉5，MnSO4·5H2O 0.28，檸檬酸三銨4，MgSO4·7H2O 0.58，CaCl2·2H2O0.74，Tween 80l。
改進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)基在質(zhì)量濃度為10％的麥芽汁中添加以g/L計(jì)的酵母粉100，KH2PO44，MgSO4·7H2O 1，MnSO4·5H2O 0.2。
(3)搖瓶培養(yǎng)將30℃下厭氧培養(yǎng)48h的種子以10％的接種量分別轉(zhuǎn)接到基本發(fā)酵培養(yǎng)基和本發(fā)明提出的改進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃下靜置培養(yǎng)4天，進(jìn)行對(duì)比。
(4)細(xì)胞干重的測(cè)定取一定量的菌懸液置于10ml容量瓶中，加入去離子水定容至10ml，搖勻，用UNICE 2000型可見(jiàn)分光光度計(jì)，于660nm處比色測(cè)OD值，利用細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線算得細(xì)胞干重。
(5)開(kāi)菲爾多糖含量的測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法取適量發(fā)酵液于3000rpm離心30min。取2ml上清液，加入等體積-20℃的無(wú)水乙醇混勻，3000rpm離心15min，棄去上清液，沉淀用95％乙醇洗數(shù)次，洗去殘?zhí)牵瑢⒊恋砣苡谌ルx子水中，3000rpm離心10min得上清液。將上清液稀釋后，用蒽酮-硫酸比色法測(cè)吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和換算系數(shù)(0.9)計(jì)算出多糖的濃度。
(6)Kefiran的制備與提取L.kefiranofaciens JCM 6985菌25℃靜置發(fā)酵4天，發(fā)酵液于4000rpm下離心30min，除去菌體及沉淀，離心得到的上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/5，取出冷卻后加入相等體積的-20℃的無(wú)水乙醇，待產(chǎn)生沉淀后，離心收集沉淀物，將沉淀溶于一定量的蒸餾水中，于4000rpm下離心10min，除去不溶物，得上清液，此過(guò)程重復(fù)3次，所得沉淀經(jīng)真空干燥后研磨成粉末，即為胞外多糖粗品。
(7)多糖分子量的測(cè)定高效凝膠過(guò)濾色譜法(HPGFC)儀器Waters 600高效液相色譜儀(配2410示差折光檢測(cè)器和M32工作站)色譜條件色譜柱UltrahydrogelTMLinear 300mm×7.8mmid×2流動(dòng)相0.1mol/L硝酸鈉流速0.9ml/min柱溫45℃樣品制備樣品溶解于流動(dòng)相中，用微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后供進(jìn)樣。
分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品Dextran T-2000(Mw2000000)Dextran T-580(Mw580000)Dextran T-190(Mw188000)Dextran T-70(Mw70,000)
Dextran T-10 (Mw10,000)Dextran T-5 (Mw4600)Maltopentaose(Mw828)(8)單糖組分分析A完全水解取一定量的多糖溶液加適量2mol/L H2SO4，封管，100℃，水解10h，BaCO3中和，離心，取上清液備用。
B高效液相色譜(HPLC)儀器Waters 600高效液相色譜儀(配2410示差折光檢測(cè)器和M32工作站)色譜條件色譜柱Sugarpakl，6.5mmid×300mm流動(dòng)相純水檢測(cè)器靈敏度4柱溫85℃流速0.4ml/min進(jìn)樣體積10μL(9)多糖的紅外光譜分析將干燥的多糖用KBr壓片法做紅外光譜分析。
(10)特性粘度的測(cè)定以水為溶劑，配置1％的開(kāi)菲爾多糖溶液，采用烏氏粘度計(jì)于25℃測(cè)定多糖溶液的特性粘度。包括相對(duì)粘度ηrelt/t0(t樣品流出時(shí)間，t0溶劑流出時(shí)間)增比粘度ηspηrel-1比濃粘度ηredηsp/C特性粘度[η]以ηred為縱坐標(biāo)，C為橫坐標(biāo)，外推至C為0時(shí)的ηred，即截距。根據(jù)比濃粘度ηred＝ηsp/C與濃度C的關(guān)系式Huggins公式ηsp/C＝[η]+k[η]2C，ηsp/C與C呈線性關(guān)系，但ηsp/C與C的線性關(guān)系必須在一定的濃度范圍內(nèi)，超過(guò)濃度限度時(shí)線性關(guān)系遭到破壞，曲線向上彎曲，因?yàn)殡S濃度的增加，聚合物分子鏈間的距離逐漸縮短，分子間作用力加強(qiáng)，所以在測(cè)定多糖EPSII的特性粘度時(shí)，選擇的糖濃度為1％。
本發(fā)明的有益效果Kefiran是一種重要的多糖，在臨床上的用途廣泛。開(kāi)菲爾多糖的結(jié)構(gòu)對(duì)其功能影響很大，如多糖的抗腫瘤活性是由于β-糖苷鍵的存在。本發(fā)明方法對(duì)提高Kefiran多糖的產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)Kefiran工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)為Kefiran作為食品添加劑得到大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。無(wú)論從理論還是從實(shí)踐角度來(lái)看，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)Kefiran的產(chǎn)業(yè)化，不僅能填補(bǔ)我國(guó)在這一研究領(lǐng)域的空白，對(duì)我國(guó)醫(yī)藥工業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)均具有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)的結(jié)果比較可以看出，改變發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分能有效地提高Kefiran的產(chǎn)量，并且能改變Kefiran的結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)出具有抗腫瘤活性的β-糖苷鍵的Kefiran多糖。在其它培養(yǎng)條件相同的情況下，使用麥芽汁和酵母膏使得Kefiran多糖的產(chǎn)量提高近一倍，結(jié)構(gòu)與已見(jiàn)報(bào)道的Kefiran多糖不同。


圖1標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的出峰時(shí)間和分子量對(duì)數(shù)值的關(guān)系圖出峰時(shí)間同分子量之間的對(duì)應(yīng)方程為L(zhǎng)og Mol Wt＝13.1-0.471T具體實(shí)施方式
對(duì)比例1 按照說(shuō)明書中所描述的發(fā)酵條件，采用基本發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞干重6g/L，Kefiran多糖含量為0.85g/L，發(fā)酵周期為5天。
對(duì)比例2 按照說(shuō)明書中所描述的發(fā)酵條件，采用基本發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞干重為8g/L，Kefiran多糖含量為1.96g/L，發(fā)酵周期為4天。
實(shí)施例1 按照說(shuō)明書中所描述的發(fā)酵條件，采用本發(fā)明改進(jìn)的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞干重為24.6g/L，Kefiran多糖含量為2.6g/L，發(fā)酵周期為4天。
實(shí)施例2 按照說(shuō)明書中所描述的發(fā)酵條件，采用本發(fā)明改進(jìn)的發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果開(kāi)菲爾多糖的分子量為1.5×105Da；葡萄糖與半乳糖的比率為1∶10；β-型吡喃多糖中含有β-糖苷鍵；特性粘度[η]為73.86[1g/100ml]。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵法制備開(kāi)菲爾多糖的方法，其特征是采用乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985為發(fā)酵菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)4天，得到分子量數(shù)量級(jí)為1.5×105Da；葡萄糖與半乳糖的比率為1∶10；β-型吡喃多糖中含有β-糖苷鍵；1g/100ml溶液的特性粘度[η]為73.86的開(kāi)菲爾多糖；發(fā)酵條件為菌株乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985；種子培養(yǎng)基，以g/L計(jì)葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，乙酸鈉5，磷酸二氫鉀2，檸檬酸三銨2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·5H2O 0.05，Tween 80 1，pH 5.5，培養(yǎng)條件30℃下厭氧培養(yǎng)48h；發(fā)酵培養(yǎng)基在質(zhì)量濃度為10％的麥芽汁中添加以g/L計(jì)的酵母粉100，KH2PO44，MgSO4·7H2O 1，MnSO4·5H2O 0.2；培養(yǎng)條件將種子培養(yǎng)液以10％的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃下靜置培養(yǎng)4天。
全文摘要
一種微生物發(fā)酵法制備開(kāi)菲爾多糖的方法，涉及發(fā)酵法制備開(kāi)菲爾多糖的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985為發(fā)酵菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)后，接種于經(jīng)改進(jìn)的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行靜置培養(yǎng)，得到一種分子量數(shù)量級(jí)為1.5×10
文檔編號(hào)C12R1/225GK1884570SQ20061004060
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者王淼, 畢潔 申請(qǐng)人:江南大學(xué)