一種紫花杯冠藤組培快繁的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紫花杯冠藤組培快繁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紫花杯冠藤(Cynanchumpurpureum)是蘿蘑科鸛絨藤屬的植物，分布在俄羅斯、朝鮮以及中國大陸的河北等地，生長于海拔100米至670米的地區(qū)，一般生長在山地林中，屬于直立草本植物，略為分枝而互生，莖被疏長柔毛，干后中空。花期5-6月，果期6月。
[0003]絨藤屬植物在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化以及鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎等方面具有較高的藥用價值，很早就有人從中分離出C21留體類、留體類生物堿、黃酮類、萜類、苯類衍生物以及脂肪烷和脂肪酸類化合物等多種化學(xué)成分;對開發(fā)新藥和尋找新藥源都具有很大的現(xiàn)實(shí)意義。目前對于紫花杯冠藤的研究較少，更沒有關(guān)于紫花杯冠藤組織培養(yǎng)方面的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種紫花杯冠藤組培快繁的方法，能夠快速建立起紫花杯冠藤的組培快繁體系，可以實(shí)現(xiàn)紫花杯冠藤的快速增殖。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0006]—種紫花杯冠藤組培快繁的方法，包括如下步驟:
[0007](I)外植體的選擇及處理:選用帶有腋芽的野外植株，用干凈的剪刀剪下帶有2個腋芽的莖段，把莖段用干凈的封口袋保存，保存時間不超過兩天并且不能沾水；
[0008](2)外植體的消毒:把步驟(I)得到的莖段放在燒杯中，先加入2?4滴洗潔精，再加水沖洗2?3次至無泡沫，沖洗時間不能過長以免造成二次污染，然后將其在超凈臺中先用體積濃度70 %的酒精浸0.5?2分鐘，無菌水沖洗2?4次，用加兩滴吐溫的質(zhì)量濃度為5 %的次氯酸鈉溶液消毒3?7分鐘后用無菌水洗4?6次;再用加兩滴吐溫的質(zhì)量濃度0.1 %的升萊消毒5?15分鐘，后用無菌水洗5?6次；
[0009](3)接種培養(yǎng):將莖段剪成Icm左右的小段，每段帶兩個腋芽，將其接種到接種培養(yǎng)基上;
[0010](4)繼代增殖培養(yǎng):接種成功后將分化的芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖，每次繼代30天左右；
[0011](5)生根培養(yǎng):將經(jīng)過繼代培養(yǎng)的分化芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。
[0012]步驟(3)所述的接種培養(yǎng)基為MS+6-BA0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L。
[0013]步驟(4)所述的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA lmg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L。
[0014]步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.1?0.2mg/L+糖20g/L。
[0015]步驟(4)所述的繼代增殖培養(yǎng)，如在繼代過程中苗有細(xì)弱現(xiàn)象，則用權(quán)利要求3所述的繼代增殖培養(yǎng)基和MS+6-BA 0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g//L培養(yǎng)基交替使用培養(yǎng)以達(dá)到壯苗目的，每30天更換一次。
[0016]優(yōu)選地，步驟(3)、(4)和(5)的培養(yǎng)條件均為:23土 TC，光照時間12小時/天，光照強(qiáng)度2000Lx左右，pH值為6.2。
[0017]優(yōu)選地，還包括組培苗移栽，具體如下:
[0018]組培苗根長出2?3cm時出瓶，出瓶前練苗一周，先將培養(yǎng)瓶移至溫室，自然條件下煉苗2d，然后解開封口膜，煉苗5d，煉苗完成后取出小苗洗凈根部附著的培養(yǎng)基，用多菌靈1000倍液或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，防止病害的發(fā)生，移栽到經(jīng)消毒的栽培基質(zhì)中，溫度控制在24-26°C，濕度控制在70%左右，15d以后逐漸降低濕度，直至將移栽苗置于自然條件下，煉苗移栽期間適當(dāng)遮光，使光照強(qiáng)度為自然光的50%。
[0019]優(yōu)選地，所述的栽培基質(zhì)用腐殖土、園土和沙按照I: 1:1的體積比混合而成。
[0020]優(yōu)選地，步驟(2)所述外植體的消毒方法為:把步驟(I)得到的莖段放在燒杯中，先加入3滴洗潔凈，再加水沖洗3次至無泡沫，然后將其在超凈臺中先用體積濃度70%的酒精浸I分鐘，無菌水沖洗2次，用加入兩滴吐溫的質(zhì)量濃度為5%的次氯酸鈉消毒5分鐘后用無菌水洗5次;再用加入兩滴吐溫的質(zhì)量濃度0.1 %的升汞消毒10分鐘，后用無菌水洗6次。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:
[0022]本發(fā)明通過系統(tǒng)的研究，對紫花杯冠藤各個培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)選，首次建立了紫花杯冠藤的組織培養(yǎng)體系，提供了一整套的采用紫花杯冠藤的莖段作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)的方法，可以生產(chǎn)整齊一致的紫花杯冠藤幼苗，為紫花杯冠藤的快速繁殖提供了有效的支持，為紫花杯冠藤的開發(fā)利用提供了技術(shù)保證，也為進(jìn)一步探索紫花杯冠藤的基因工程、拓寬外植體材料等奠定了基礎(chǔ)。
[0023]并且本發(fā)明培養(yǎng)過程速度快，再生頻率較高，擴(kuò)繁系數(shù)高達(dá)40倍以上，并且變異率較低，周期相對較短，能較好地保持紫花杯冠藤的遺傳穩(wěn)定性。
[0024]培養(yǎng)的組培苗移栽成活率高，達(dá)到85%以上。
【附圖說明】
[0025]圖1是本發(fā)明紫花杯冠藤經(jīng)過繼代增殖培養(yǎng)出來的苗生長狀況。
[0026]圖2是本發(fā)明紫花杯冠藤的生根情況。
[0027]圖3是生根培養(yǎng)基激素過量時紫花杯冠藤的生長狀況。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0029]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030]實(shí)施例1
[0031]—種紫花杯冠藤組培快繁的方法，包括如下步驟:
[0032](I)外植體的選擇及處理:選用帶有腋芽的野外植株，野外采集外植體應(yīng)避免二次污染，用干凈的剪刀剪下帶有2個腋芽的莖段，把莖段用干凈的封口袋保存，保存時間不超過兩天并且不能沾水；
[0033](2)外植體的消毒:把步驟(I)得到的莖段放在燒杯中，先加入3滴洗潔精，再加水沖洗3次至無泡沫，然后將其在超凈臺中先用體積濃度為70%的酒精浸I分鐘，無菌水沖洗2次，用加入兩滴吐溫的有效氯濃度為5%的次氯酸鈉消毒5分鐘后用無菌水洗5次;再用加入兩滴吐溫的質(zhì)量濃度0.1 %的升汞消毒10分鐘，后用無菌水洗6次。
[0034](3)接種培養(yǎng):將莖段剪成Icm左右的小段，每段帶兩個腋芽，將其接種到接種培養(yǎng)基(MS+6-BA0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L)上;培養(yǎng)約2_5天左右開始生長；
[0035](4)繼代增殖培養(yǎng):接種成功后將分化的芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基(MS+6-BAlmg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L)上進(jìn)行繼代增殖，每次繼代30天左右;生長情況見圖1，從圖1可以看出，經(jīng)過繼代增殖的紫花杯冠藤生長狀況良好，增殖系數(shù)平均超過40。
[0036](5)生根培養(yǎng):將經(jīng)過繼代培養(yǎng)的分化芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(1/2MS+IBA 0.lmg/L+糖20g/L)上誘導(dǎo)生根，約20天左右生根，經(jīng)過30天左右，其生根情況如圖2所示，從圖2可以看出，其生根狀況良好，可以繼續(xù)進(jìn)行組培苗的移栽。
[0037](6)組培苗移栽:組培苗根長出2?3cm時出瓶，出瓶前練苗一周，先將培養(yǎng)瓶移至溫室，自然條件下煉苗2d，然后解開封口膜，煉苗5d，煉苗完成后取出小苗洗凈根部附著的培養(yǎng)基，用多菌靈1000倍液或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，防治病害的發(fā)生，移栽到經(jīng)消毒的栽培基質(zhì)(腐殖土、園土和沙按照1:1:1的體積比混合而成)中，溫度控制在24-26 0C，濕度控制在70 %左右，15d以后逐漸降低濕度，直至將移栽苗置于自然條件下，煉苗移栽期間適當(dāng)遮光，使光照強(qiáng)度為自然光的50% ο最終的移栽成活率達(dá)89%。
[0038]上述紫花杯冠藤組培快繁的方法中，步驟(3)、(4)和(5)的培養(yǎng)條件均為:23± I0C，光照時間12小時/天，光照強(qiáng)度2000Lx左右，pH值為6.2。
[0039]實(shí)施例2
[0040]—種紫花杯冠藤組培快繁的方法，包括如下步驟:
[0041 ] (I)外植體的選擇及處理:選用帶有腋芽的野外植株，野外采集外植體應(yīng)避免二次污染，用干凈的剪刀剪下帶有2個腋芽的莖段，把莖段用干凈的封口袋保存，保存時間不超過兩天并且不能沾水；
[0042](2)外植體的消毒:把步驟(I)得到的莖段放在燒杯中，先加入2滴洗潔精，再加水沖洗3次至無泡沫，沖洗時間不能過長以免造成二次污染，然后將其在超凈臺中先用體積濃度70%的酒精浸2分鐘，無菌水沖洗4次，用加兩滴吐溫的有效氯質(zhì)量濃度5%的次氯酸鈉消毒7分鐘后用無菌水洗4次;再用加兩滴吐溫的質(zhì)量濃度為0.1 %的升汞消毒5分鐘，后用無菌水洗5次；
[0043](3)接種培養(yǎng):將莖段剪成Icm左右的小段，每段帶兩個腋芽，將其接種到接種培養(yǎng)基(MS+6-BA0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L)上;培養(yǎng)約2_5天左右開始生長；
[0044](4)繼代增殖培養(yǎng):接種成功后將分化的芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖，在繼代過程中如有苗有細(xì)弱現(xiàn)象，則采用MS+6-BAlmg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g//L培養(yǎng)基和MS+6-BA0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g//L培養(yǎng)基交替使用培養(yǎng)以達(dá)到壯苗目的，每30天更換一次；
[0045](5)生根培養(yǎng):將經(jīng)過繼代培養(yǎng)的分化芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(1/2MS+IBA 0.2mg/L+糖20g/L)上誘導(dǎo)生根，約20天左右生根，當(dāng)根生長到3cm左右時出瓶，根生長過長、生根時間過長都會影響移栽成活。
[0046](6)組培苗移栽:組培苗根長出2cm時出瓶，出瓶前練苗一周，先將培養(yǎng)瓶移至溫室，自然條件下煉苗2d，然后解開封口膜，煉苗5d，煉苗完成后取出小苗洗凈根部附著的培養(yǎng)基，用多菌靈1000倍液或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，防治病害的發(fā)生，移栽到經(jīng)消毒的栽培基質(zhì)(腐殖土、園土和沙按照1:1:1的體積比混合而成)中，溫度控制在24-26°C，濕度控制在70%左右，15d以后逐漸降低濕度，直至將移栽苗置于自然條件下，煉苗移栽期間適當(dāng)遮光，使光照強(qiáng)度為自然光的50 %，移栽成活率為85 %。
[0047]上述紫花杯冠藤組培快繁的方法中，步驟(3)、(4)和(5)的培養(yǎng)條件均為:23± I0C，光照時間12小時/天，光照強(qiáng)度2000Lx左右，pH值為6.2。
[0048]對比例I
[0049]除了生根培養(yǎng)基的激素IBA的用量為0.3mg/L外，其余同實(shí)施例1。最終培養(yǎng)得到的組培苗生長狀況見圖3。
[0050]發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，生根培養(yǎng)基的激素IBA的用量超過0.2mg/L時，會長出較大的愈傷組織，并且生根較少，即使生根，也是附著在愈傷組織上，當(dāng)出瓶時，所生的根還是留在培養(yǎng)基上，相當(dāng)于移栽的苗不具有根，發(fā)明人經(jīng)過篩選，選擇了激素IBA的用量為0.1?
0.2mg/L，可以有效的促進(jìn)生根。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種紫花杯冠藤組培快繁的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)外植體的選擇及處理:選用帶有腋芽的野外植株，用干凈的剪刀剪下帶有2個腋芽的莖段，把莖段用干凈的封口袋保存，保存時間不超過兩天并且不能沾水； (2)外植體的消毒:把步驟(I)得到的莖段放在燒杯中，先加入2?4滴洗潔精，再加水沖洗2?3次至無泡沫，沖洗時間不能過長以免造成二次污染，然后將其在超凈臺中先用體積濃度70%的酒精浸0.5?2分鐘，無菌水沖洗2?4次，用加兩滴吐溫的質(zhì)量濃度為5%的次氯酸鈉溶液消毒3?7分鐘后用無菌水洗4?6次;再用加兩滴吐溫的質(zhì)量濃度0.1 %的升汞消毒5?15分鐘，后用無菌水洗5?6次； (3)接種培養(yǎng):將莖段剪成Icm左右的小段，每段帶兩個腋芽，將其接種到接種培養(yǎng)基上； (4)繼代增殖培養(yǎng):接種成功后將分化的芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖，每次繼代30天左右； (5)生根培養(yǎng):將經(jīng)過繼代培養(yǎng)的分化芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花杯冠藤組培快繁的方法，其特征在于，步驟(3)所述的接種培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花杯冠藤組培快繁的方法，其特征在于，步驟(4)所述的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA lmg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花杯冠藤組培快繁的方法，其特征在于，步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為 1/2MS+IBA 0.1?0.2mg/L+糖20g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花杯冠藤組培快繁的方法，其特征在于，步驟(4)所述的繼代增殖培養(yǎng)，如在繼代過程中苗有細(xì)弱現(xiàn)象，則用權(quán)利要求3所述的繼代增殖培養(yǎng)基和MS+6-BA 0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/U:咅養(yǎng)基交替使用培養(yǎng)以達(dá)到壯苗目的，每30天更換一次。6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的紫花杯冠藤組培快繁的方法，其特征在于，步驟(3)、(4)和(5)的培養(yǎng)條件均為:23± 1°C，光照時間12小時/天，光照強(qiáng)度2000Lx左右，pH值為6.2。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花杯冠藤組培快繁的方法，其特征在于，還包括組培苗移栽，具體如下: 組培苗根長出2?3cm時出瓶，出瓶前練苗一周，先將培養(yǎng)瓶移至溫室，自然條件下煉苗2d，然后解開封口膜，煉苗5d，煉苗完成后取出小苗洗凈根部附著的培養(yǎng)基，用多菌靈1000倍液或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，防止病害的發(fā)生，移栽到經(jīng)消毒的栽培基質(zhì)中，溫度控制在24-26°C，濕度控制在70%左右，15d以后逐漸降低濕度，直至將移栽苗置于自然條件下，煉苗移栽期間適當(dāng)遮光，使光照強(qiáng)度為自然光的50%。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的紫花杯冠藤組培快繁的方法，其特征在于，所述的栽培基質(zhì)用腐殖土、園土和沙按照I: 1:1的體積比混合而成。9.如權(quán)利要求1所述的紫花杯冠藤組培快繁的方法，其特征在于，步驟(2)所述外植體的消毒方法為:把步驟(I)得到的莖段放在燒杯中，先加入3滴洗潔凈，再加水沖洗3次至無泡沫，然后將其在超凈臺中先用體積濃度70 %的酒精浸I分鐘，無菌水沖洗2次，用加入兩滴吐溫的質(zhì)量濃度為5%的次氯酸鈉消毒5分鐘后用無菌水洗5次;再用加入兩滴吐溫的質(zhì)量濃度0.1 %的升汞消毒10分鐘，后用無菌水洗6次。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種紫花杯冠藤組培快繁的方法，屬于組織培養(yǎng)領(lǐng)域，包括以下步驟：外植體的選擇及處理、外植體的消毒、接種培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)。本發(fā)明培養(yǎng)方法速度快，再生頻率較高，擴(kuò)繁系數(shù)高達(dá)40倍以上，并且變異率較低，周期相對較短，能較好地保持紫花杯冠藤的遺傳穩(wěn)定性。培養(yǎng)的組培苗移栽成活率高，達(dá)到85％以上。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105706925
【申請?zhí)枴緾N201610073227
【發(fā)明人】孫國峰, 李曉東, 林秦文, 王亮生, 吳東啟
【申請人】中國科學(xué)院植物研究所