專利名稱：表達苯環雙加氧酶的工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及苯環雙加氧酶的專用表達工程菌及其應用，特別是涉及一種苯環雙加氧酶的專用表達工程菌與該工程菌在生產順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯中的應用。
背景技術：
順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯(DHCD，化學結構式見式I)是化學合成高性能材料聚苯(化學結構式見式II，n＝1，2，3，4，……)的單體。聚苯是一種高性能聚合物，具有穩定性好、強度高、耐高溫、阻燃、耐久性好、耐腐蝕、電性能好等一系列優異的性能。聚苯在航空航天、核能、電子信息、精密機械、石油化工、汽車等高新技術領域中都具有潛在的應用價值(曲向華，陳金春，馬祺祥，孫世堯，陳國強，用重組大腸桿菌JM109(pKST11)轉化苯生產順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯。生物工程學報，2003，19(1)74-80)。
式I 式II傳統的利用化學法由苯經催化合成聚苯的方法效率極低，而且據報導只能合成分子量很低的聚苯(Marvel C S，Hartzell G E，Preparation andAromatization of Poly-1，3-cyclohexadiene，J.Am.Chem.Soc.1959，41448-452)。新的聚苯合成方法是先通過含有苯環雙加氧酶的微生物把苯轉化成DHCD作為合成聚苯的單體，再經歷化學合成過程合成聚苯。這種方法合成聚苯的效率較高，分子量較大(Ballard D G H，et.al.，Synthesis of Polyphenylenefrom a cis-Dihydrocatechol，a biologically Produced Monomer.Macromolecules.1988，21294-300)。苯環雙加氧酶是一類可以將苯環結構氧化成順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯結構的酶(見式III)，根據其結構可以分成甲苯雙加氧酶、苯雙加氧酶、氯苯雙加氧酶等。苯環雙加氧酶通常其底物特異性比較低，如甲苯雙加氧酶(TOD)可以以苯、甲苯、萘等含有苯環的物質作為底物。研究得比較多的甲苯雙加氧酶是三種蛋白的總稱黃素蛋白還原酶(flavoprotein reductase，由todA基因編碼)、鐵氧化還原蛋白(ferredoxin，由todB基因編碼)和終端雙加氧酶(terminal dioxygenase，由兩個亞基組成，這兩個亞基分別由todC1及todC2編碼)。這三種蛋白聯合催化由苯環到順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯的反應。
式III目前，能高效率的將苯轉化為DHCD的微生物主要包括以下兩種，一是經過大量的篩選、人工誘變而獲得的野生菌株或誘變株，已有用這些菌株生產DHCD的相關報導(Quintana MG，Dalton H，Production of toluene cis-diol byimmobilized Pseudomonas putida UV4 cells in barium alginate beads.ENZYMEAND MICROBIAL TECHNOLOGY 22(8)713-720 JUN 1998)；二是從含有苯環雙加氧酶的菌株中克隆出苯環雙加氧酶基因，再將克隆的基因連接在不同的質粒上，導入到其它微生物宿主中增強表達，如帶有質粒pKST11的重組大腸桿菌(Quintana MG，Dalton H，Biotransformation of aromatic compounds byimmobilized bacterial strains in barium alginate beads.ENZYME ANDMICROBIAL TECHNOLOGY 24(3-4)232-236 FEB-MAR 1999)，從而得到苯環雙加氧酶。由于苯是一種對微生物毒害作用較強的試劑，以重組大腸桿菌作為宿主，生產DHCD的效率較低，其產量達不到規模化工業生產的要求，且在培養過程中需要添加IPTG誘導基因的表達，使得發酵培養的成本較高，難于推廣應用(曲向華，陳金春，馬祺祥，孫世堯，陳國強，用重組大腸桿菌JM109(pKST11)轉化苯生產順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯。生物工程學報，2003，19(1)74-80)。
許多假單胞菌都具有較強的抵抗有機溶劑的能力，不少種類的野生型假單胞菌基因組中就含有與苯環雙加氧酶基因功能非常相似的基因(JoséIgnacioJiménez，et.al.，Genomic analysis of the aromatic catabolic pathwaysfrom Pseudomonas putida KT2440。Environmental Microbiology，2002，4(12)，824-841)，但由于其本底表達量通常較低，野生型假單胞菌并不能作為將苯轉化為DHCD的生產菌。

發明內容
本發明的目的是提供一種可高效表達苯環雙加氧酶的專用表達工程菌。
本發明所提供的苯環雙加氧酶的專用表達工程菌，是將含有苯環雙加氧酶基因的表達載體導入假單胞菌(Pseudomonas)中得到的重組假單胞菌。
所述苯環雙加氧酶基因的特征為所編碼的苯環雙加氧酶可將苯環結構氧化為順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯結構，能催化如式III所述的反應。所述苯環雙加氧酶基因可為甲苯雙加氧酶基因(tod)或氯苯雙加氧酶基因(cdo)，所述甲苯雙加氧酶基因可為NCBI GenBank號為J04996所述的TodC1、TodC2、TodB和TodA基因，所述氯苯雙加氧酶基因可為NCBI Genbank號為U15298所述的tcbAa、tcbAb、tcbAc和tcbAd基因。
所述用于構建含有苯環雙加氧酶基因的表達載體的出發載體為任一可在假單胞菌中表達外源基因的表達載體，如pBBR1MCS-2(NCBI GenBank號為U23751)，pBBR1MCS-5(NCBI GenBank號為U25061.)，pBBR1MCS-3(NCBI GenBank號為U25059)。
以pBBR1MCS-2為出發載體，構建的含有甲苯雙加氧酶基因(tod)的表達載體為pSPM01。
以pBBR1MCS-2為出發載體，構建的含有氯苯雙加氧酶基因(cdo)的表達載體為pSPM01-1。
上述含有苯環雙加氧酶基因的表達載體可按照生物工程領域中的常規方法構建。
所述假單胞菌宿主菌的選擇是多種多樣的，如Pseudomonas putida KT2442(Kellerhals MB et al，Closed-loop control of bacterialhigh-cell-density fed-batch culturesProduction of mcl-PHAs byPseudomonas putida KT2442 under single-substrate and cofeedingconditions.BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，1999，65(3)306-315)、Pseudomonas putida KT2440(ATCC編號47054)、Pseudomonas stutzeri 1317(Chen JY，Liu T，Zheng Z，et al.Polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1and PhaC2 from Pseudomonas stutzeri 1317 had different substratespecificities，FEMS MICROBIOLOGY LETTERS 234(2)231-237 MAY 15 2004)或Pseudomonas aeruginosa PAO1(ATCC編號39018)等。
可采用生物工程領域中常用的方法將含有苯環雙加氧酶基因的表達載體轉化假單胞菌宿主菌，如接合轉化法、電擊轉化法、氯化鋰轉化法或原生質體轉化法等，優選為接合轉化法。
以Pseudomonas putida KT2442為出發菌株，構建的轉化有pSPM01的重組假單胞菌為Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)。
以Pseudomonas putida KT2440為出發菌株，構建的轉化有pSPM01的重組假單胞菌為Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)。
以Pseudomonas stutzeri 1317為出發菌株，構建的轉化有pSPM01的重組假單胞菌為Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)。
以Pseudomonas aeruginosa PAO1為出發菌株，構建的轉化有pSPM01-1的重組假單胞菌為Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)。
本發明的另一個目的是提供一種順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯(DHCD)的制備方法。
本發明所提供的順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯的制備方法，是發酵上述苯環雙加氧酶的專用表達工程菌，獲得苯環雙加氧酶，再加入底物苯或苯溶液，使每小時加入到每升發酵液中苯的含量為10-30mL，然后繼續發酵8-24小時，得到順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯；所述苯溶液中的溶劑為石蠟或豆油，苯與溶劑的體積比為1∶1-3。
可采用假單胞菌的常規培養條件對重組假單胞菌進行培養，如可選用下述三種培養基中的任意一種1)每升培養基含酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，NaCl 8-12g/L，葡萄糖18-22g/L，其余為水。
2)每升培養基含酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，葡萄糖40-60g/L，(NH4)2SO45-7g/L；MgSO40.38-0.45g/L；Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L；KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，其余為水；每升微量元素溶液I含Fe(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O1.8-2.2g/L，其余為0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含ZnSO4·7H2O80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O 18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余為0.4-0.6M HCl。
3)每升培養基含月桂酸7-9g/L，(NH4)2SO41.8-2.2g/L；MgSO40.38-0.45g/L；Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L；KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，其余為水；每升微量元素溶液I含Fe(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O 1.8-2.2g/L，其余為0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含ZnSO4·7H2O 80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O 18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余為0.4-0.6M HCl。
在實際培養過程中，可向上述培養基中再添加一定濃度的抗生素以維持質粒的穩定性，如50μg/mL硫酸卡那霉素。
所述發酵溫度為30-35℃。
將苯或苯溶液加入發酵液中的方式為流加或分批補加；所述流加速度可為10～30mL/h；所述分批補加的方式可為每隔1小時每升發酵液中添加10～30mL苯或苯溶液。
在發酵過程中，可每隔2h用高效液相色譜方法檢測DHCD的產量，當DHCD產量不再增加時，發酵結束。
本發明提供了一種苯環雙加氧酶的專用表達工程菌。該工程菌是利用基因工程技術構建出含有苯環雙加氧酶基因的質粒，然后將其導入假單胞菌中，獲得的重組假單胞菌，該工程菌與傳統的重組大腸桿菌相比具有很多優勢1)具有更強的抵抗有機溶劑的能力，能忍耐更高濃度的底物苯；2)本身具有與苯環雙加氧酶基因類似的基因，因此導入外源苯環雙加氧酶基因后可使重組假單胞菌苯環雙加氧酶的表達效率更高；3)無需添加IPTG誘導基因表達，因而降低了培養成本。此外，搖瓶實驗結果表明本發明的工程菌可高效表達苯環雙加氧酶，并可將底物苯轉化成DHCD，轉化效率較高。小型發酵罐實驗表明將本發明的工程菌在6L發酵罐中發酵后，DHCD的產量最高可達62g/L以上，且生產工藝簡單，成本低廉，適于大規模工業化生產。本發明苯環雙加氧酶的專用表達工程菌將在DHCD的工業化生產中發揮重要作用，應用前景廣闊。
以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。


圖1為質粒pSPM01的物理圖譜圖2為質粒pSPM01-1的物理圖譜具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法；所用酶試劑均購自大連寶生物工程有限公司，提取質粒、回收DNA片斷所用的試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，相應的操作步驟按照產品說明書進行；所有培養基如無特別說明均用去離子水配制，培養基滅菌條件為115℃加熱20分鐘。
培養基配方LB液體培養基每升培養基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，其余為水。
LB-Km液體培養基每升培養基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余為水。
LB-Km固體培養基每升培養基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余為水。
LB-Km-Amp液體培養基每升培養基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨芐青霉素，其余為水。
LB-Km-Amp固體培養基每升培養基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨芐青霉素，其余為水。
重組假單胞菌專用培養基重組假單胞菌專用培養基I每升培養基含酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖20g/L，其余為水。
LBG-Km液體培養基在重組假單胞菌專用培養基I的基礎上添加50μg/mL硫酸卡那霉素。
重組假單胞菌專用培養基II每升培養基含酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖50g/L，(NH4)2SO46g/L，MgSO40.41g/L，Na2HPO4·12H2O 9.65g/L，KH2PO41.5g/L，微量元素溶液I 10mL/L，微量元素溶液II 1mL/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，其余為水。
重組假單胞菌專用培養基III月桂酸8g/L，(NH4)2SO42g/L，MgSO40.41g/L，Na2HPO4·12H2O 9.65g/L；KH2PO41.5g/L，微量元素溶液I 10mL/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，微量元素溶液II 1mL/L。
重組假單胞菌專用培養基II和重組假單胞菌專用培養基III中的微量元素溶液I、II用0.5M HCl配制。微量元素溶液I的配方為Fe(III)-NH4-Citrate 5g/L，CaCl2·2H2O 2g/L；微量元素溶液II的配方為ZnSO4·7H2O 100mg/L，MnCl2·4H2O30mg/L，H3BO3300mg/L，CoCl2·6H2O 200mg/L，CuSO4·5H2O 10mg/L，NiCl2·6H2O20mg/L，NaMoO4·2H2O 30mg/L。
實施例1、苯環雙加氧酶專用表達工程菌的構建一、含有甲苯雙加氧酶基因(tod)的假單胞菌表達載體的構建1)用限制性內切酶BamH I和Nde I對質粒pKST11(Allen，C.C.R.，Boyd，D.R.，Dalton，H.，et.al.Sulfoxides of high enantiopurity frombacterial dioxygenase-catalysed oxidation.J.Chem.Soc.Chem.Comm.1995，119-120)進行雙酶切，回收大小為3866bp的甲苯雙加氧酶基因片斷(NCBIGenBank號為J04996所述的TodC1、TodC2、TodB和TodA基因)；2)用限制性內切酶BamHI對質粒pBBR1MCS-2(NCBI GenBank號為U23751)進行酶切，回收酶切片斷；3)將步驟1)和步驟2)的回收片斷用T4 DNA連接酶進行連接，連接反應完成后，將連接產物用電轉化的方法導入到E.coli JM109(ATCC編號53323)中，將轉化子涂布于LB-Km固體培養平板上，在37℃、200rpm下搖床培養12h；4)挑取在LB-Km固體培養平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養基中，在37℃、200rpm下搖床培養12h，提取質粒，并用限制性內切酶BamHI對質粒進行酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小約為5.166kb及3.844kb的DNA片斷，將構建正確的含有tod的假單胞菌表達載體命名為pSPM01，其物理圖譜見圖1。
二、含有氯苯雙加氧酶基因(cdo)的假單胞菌表達載體的構建1)以Pseudomonas sp.strain P51(Werlen C，Kohler HP，van der MeerJR.The broad substrate chlorobenzene dioxygenase and cis-chlorobenzenedihydrodiol dehydrogenase of Pseudomonas sp.strain P51 are linkedevolutionarily to the enzymes for benzene and toluene degradation.J BiolChem.1996 Feb 23；271(8)4009-16)的基因組DNA為模板，在引物P1ATAGGATCCGTAAATGAATCACACCGACAC和P2ATAGAGCTCTCATGCTGAGTCTCCTTG的引導下，PCR擴增氯苯雙加氧酶基因cdo片斷(NCBI Genbank號為U15298所述的tcbAa、tcbAb、tcbAc和tcbAd基因)，用限制性內切酶BamH I和Sac I對PCR擴增產物進行雙酶切，回收大小約為3.6kb的酶切片斷；2)用限制性內切酶BamH I和Sac I對質粒pBBR1MCS-2(NCBI GenBank號為U23751)進行雙酶切，回收大小約為5.1kb酶切片斷；3)將步驟1)和步驟2)的回收片斷用T4 DNA連接酶進行連接，將連接產物用電轉化的方法導入到E.coli JM109(ATCC編號53323)中，將轉化子涂布于LB-Km固體培養平板上，在37℃、200rpm下搖床培養12h；4)挑取在LB-Km固體培養平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養基中，在37℃、200rpm下搖床培養12h，提取質粒，并用限制性內切酶BamHI和Sac I對質粒進行酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小約為5.1kb及3.6kb的DNA片斷，將構建正確的含有cdo的假單胞菌表達載體命名為pSPM01-1，其物理圖譜見圖2。
三、甲苯雙加氧酶專用表達工程菌Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)的獲得1)將步驟一構建的含有tod的假單胞菌表達載體質粒pSPM01用電轉化法導入到E.coli S17-1(ATCC編號47055)中，并將轉化子涂布于LB-Km固體培養平板上，在37℃培養箱中培養12h；2)挑取在LB-Km固體培養平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養基中，在37℃、200rpm下搖床培養12h，提取質粒，并用限制性內切酶BamHI對質粒進行酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小約為5.166kb及3.844kb的DNA片斷，將正確轉化有質粒pSPM01的陽性克隆菌株命名為E.coliS17-1(pSPM01)；3)挑取陽性單克隆E.coli S17-1(pSPM01)，將其接種到LB-Km液體培養基中，在37℃、200rpm下搖床培養12h，同時將Pseudomonas putida KT2442菌株(Kellerhals MB et al，Closed-loop control of bacterialhigh-cell-density fed-batch culturesProduction of mcl-PHAs byPseudomonas putida KT2442 under single-substrate and cofeedingconditions.BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，1999，65(3)306-315)接種到LB液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h，然后各取1mL上述兩種菌株的培養液至無菌小管中，8000rpm離心2分鐘，棄去上清液，再各加入0.5mL無菌LB液體培養基，重懸細菌后，將兩管重懸菌液混合，置于30℃培養箱中1小時，用無菌接種環通過劃線法將一環混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養平板上，在30℃培養箱中培養24h；4)挑取在LB-Km-Amp固體培養平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Km-Amp液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h后，提取質粒，并用限制性內切酶BamHI對質粒進行酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小約為5.166kb及3.844kb的DNA片斷，將正確轉化有質粒pSPM01的重組假單胞菌命名為Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)。
四、甲苯雙加氧酶專用表達工程菌Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)的獲得1)挑取步驟三獲得的轉化有pSPM01的重組菌E.coli S17-1(pSPM01)，將其接種到LB-Km液體培養基中，在37℃、200rpm下搖床培養12h，同時將Pseudomonas stutzeri 1317菌株(Chen JY，Liu T，Zheng Z，et al.Polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1 and PhaC2 from Pseudomonas stutzeri1317 had different substrate specificities，FEMS MICROBIOLOGY LETTERS234(2)231-237 MAY 15 2004)接種到LB液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h，然后各取1mL上述兩種菌株的培養液至無菌小管中，8000rpm離心2分鐘，棄去上清液，再各加入0.5mL無菌LB液體培養基，重懸細菌后，將兩管重懸菌液混合，置于30℃培養箱中1小時，用無菌接種環通過劃線法將一環混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養平板上，在30℃培養箱中培養24h；2)挑取在LB-Km-Amp固體培養平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Km-Amp液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h后，提取質粒，并用限制性內切酶BamHI對質粒進行酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小約為5.166kb及3.844kb的DNA片斷，將正確轉化有質粒pSPM01的重組假單胞菌命名為Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)。
五、氯苯雙加氧酶專用表達工程菌Pseudomonas aeruginosa PA01(pSPM01-1)的獲得1)將步驟二構建的含有bod的假單胞菌表達載體質粒pSPM01-1用電轉化法導入到E.coli S17-1(ATCC編號47055)中，并將轉化子涂布于LB-Km固體培養平板上，在37℃培養箱中培養12h；2)挑取轉化有pSPM01-1的重組菌E.coli S17-1(pSPM01-1)，將其接種到LB-Km液體培養基中，在37℃、200rpm下搖床培養12h，同時將Pseudomonasaeruginosa PA01菌株(ATCC編號39018)接種到LB液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h，然后各取1mL上述兩種菌株的培養液至無菌小管中，8000rpm離心2分鐘，棄去上清液，再各加入0.5mL無菌LB液體培養基，重懸細菌后，將兩管重懸菌液混合，置于30℃培養箱中1小時，用無菌接種環通過劃線法將一環混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養平板上，在30℃培養箱中培養24h；3)挑取在LB-Km-Amp固體培養平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Km-Amp液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h后，提取質粒，并用限制性內切酶BamH I和Sac I對質粒進行酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小約為5.1kb及3.6kb的DNA片斷，將正確轉化有質粒pSPM01-1的重組假單胞菌命名為Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)。
五、甲苯雙加氧酶專用表達工程菌Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)的獲得1)挑取步驟三獲得的轉化有pSPM01的重組菌E.coli S17-1(pSPM01)，將其接種到LB-Km液體培養基中，在37℃、200rpm下搖床培養12h，同時將Pseudomonas putida KT2440菌株(ATCC編號47054)接種到LB液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h，然后各取1mL上述兩種菌株的培養液至無菌小管中，8000rpm離心2分鐘，棄去上清液，再各加入0.5mL無菌LB液體培養基，重懸細菌后，將兩管重懸菌液混合，置于30℃培養箱中1小時，用無菌接種環通過劃線法將一環混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養平板上，在30℃培養箱中培養24h；2)挑取在LB-Km-Amp固體培養平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Km-Amp液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h后，提取質粒，并用限制性內切酶BamHI對質粒進行酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小約為5.166kb及3.844kb的DNA片斷，將正確轉化有質粒pSPM01的重組假單胞菌命名為Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)。
實施例2、苯環雙加氧酶專用表達工程菌表達的苯環雙加氧酶的酶活測定用下述方法檢測實施例1構建的四種苯環雙加氧酶專用表達工程菌表達的苯環雙加氧酶的酶活，具體方法如下將苯環雙加氧酶專用表達工程菌Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)，Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)，Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)和Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)分別接種于LB-Km液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h，再按5％(V/V)的比例將四種菌液分別接種到LBG-Km液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養，分別于不同培養時間(4，8，12，16，24，36，48h)取樣2mL，檢測苯環雙加氧酶酶活。苯環雙加氧酶酶活檢測方法為取2mL菌液樣品，8000rpm離心5分鐘，倒掉上清液，用2mL 0.1M磷酸鹽緩沖溶液(含24.5g/L Na2HPO4·12H2O，4.9g/LNaH2PO4·2H2O，pH7.2)重懸，再將懸濁液加入到500mL三角瓶中，加入0.05mL0.1M吲哚溶液(溶劑為N，N二甲基甲酰胺)，用封口膜封口，在30℃、200rpm下搖床培養30分鐘，取培養后的菌液0.5-2mL于塑料管中，加入3mL乙酸乙酯，振蕩，5000rpm離心5分鐘，取上層有機層，在靛藍的特定吸收峰600nm，以乙酸乙酯為空白測定OD600，利用靛藍-OD600標準曲線定量靛藍，相對酶活以靛藍的生成量/分鐘/每升菌液(mg/min/L)表示，酶活測定結果如表1所示，表明四種苯環雙加氧酶專用表達工程菌Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)，Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)，Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)和Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)經培養，均可正確穩定表達苯環雙加氧酶，且培養12h時的表達量達到最高。
表1不同培養時間的四株重組假單胞菌菌液中的苯環雙加氧酶酶活

實施例3、用Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)轉化苯生產DHCD的搖瓶實驗1)將Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)接種于LB-Km液體培養基中，在35℃、200rpm下搖床培養12h，再按5％(V/V)的比例將菌液接種到LBG-Km液體培養基中，在35℃、200rpm下搖床培養12h；2)將苯溶解于豆油中配成苯溶液，苯與豆油的體積比分別為1∶1和1∶3；3)將苯及步驟2)配制的苯溶液分別加入到步驟1)中含有Pseudomonasstutzeri 1317(pSPM01)的發酵液中，使得發酵液中苯的濃度分別為5、10、15mL/L，然后在35℃、200rpm下繼續搖床培養8h，培養結束后用Bio-RAD公司(美國)Biologic Duo-Flow HPLC系統(色譜柱為迪馬公司(中國)DiamonsilC18烷基化硅柱；流動相為甲醇∶水＝1∶1的溶液，流速為0.6mL/min。進樣量為50μl。檢測器使用Biologic Duo-Flow HPLC系統的紫外檢測器，波長設定為254nm)檢測發酵液中的DHCD含量，方法如下A、繪制標準曲線將DHCD標樣配制成1g/L的母液，稀釋2.5-200倍，用上述檢測方法及條件進行HPLC檢測，并繪制出峰面積—濃度標準曲線；B、待檢樣品制備將發酵液10000rpm離心5min，取上清，用去離子水稀釋20-200倍，并用0.45μm微孔濾膜過濾得到待檢測樣品。
C、用上述檢測方法及條件進行HPLC檢測，根據峰面積及標準曲線算出發酵液中DHCD的濃度。
Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)不同發酵液樣品中的DHCD含量檢測結果如表2所示，表明利用Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)發酵表達的甲苯雙加氧酶，可將底物苯轉化成DHCD，且培養基中苯的濃度為5mL/L時，DHCD產量較高。
表2用Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)轉化苯生產DHCD的搖瓶實驗結果

實施例4、用Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)轉化苯生產DHCD的搖瓶實驗1)將Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)接種于LB-Km液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h，再按5％(V/V)的比例將菌液接種到LBG-Km液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h；2)將苯溶解于石蠟中配成苯溶液，苯與石蠟的體積比分別為1∶1和1∶3；3)將苯及步驟2)配制的苯溶液分別加入到步驟1)中含有Pseudomonasputida KT2442(pSPM01)的發酵液中，使得發酵液中苯的濃度分別為5、10、15mL/L，然后在30℃、200rpm下繼續搖床培養8h，培養結束后用與實施例3相同的方法檢測發酵液中的DHCD含量，Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)不同發酵液樣品中的DHCD含量檢測結果如表3所示，表明利用Pseudomonasputida KT2442(pSPM01)發酵表達的甲苯雙加氧酶，可將底物苯轉化成DHCD，且培養基中苯的濃度為5mL/L時，DHCD產量較高。
表3用Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)轉化苯生產DHCD的搖瓶實驗結果

實施例5、用Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)轉化苯生產DHCD的搖瓶實驗1)將Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)接種于LB-Km液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h，再按5％(V/V)的比例將菌液接種到重組假單胞菌專用培養基III中，在30℃、200rpm下搖床培養30h；2)將苯溶解于石蠟中配成苯溶液，苯與石蠟的體積比分別為1∶1和1∶3；3)將苯及步驟2)配制的苯溶液分別加入到步驟1)中含有Pseudomonasputida KT2440(pSPM01)的發酵液中，使得發酵液中苯的濃度分別為5、10、15mL/L，然后在30℃、200rpm下繼續搖床培養8h，培養結束后用與實施例3相同的方法檢測發酵液中的DHCD含量，Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)不同發酵液樣品中的DHCD含量檢測結果如表4所示，表明利用Pseudomonasputida KT2440(pSPM01)發酵表達的甲苯雙加氧酶，可將底物苯轉化成DHCD，且培養基中苯的濃度為5mL/L時，DHCD產量較高。
表4用Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)轉化苯生產DHCD的搖瓶實驗結果


實施例6、用Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)轉化苯生產DHCD的搖瓶實驗1)將Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)接種于LB-Km液體培養基中，在35℃、200rpm下搖床培養12h，再按5％(V/V)的比例將菌液接種到LBG-Km液體培養基中，在35℃、200rpm下搖床培養12h；2)將苯溶解于豆油中配成苯溶液，苯與豆油的體積比分別為1∶1和1∶3；3)將苯及步驟2)配制的苯溶液分別加入到步驟1)中含有Pseudomonasaeruginosa PAO1(pSPM01-1)的發酵液中，使得發酵液中苯的濃度分別為5、10、15mL/L，然后在35℃、200rpm下繼續搖床培養8h，培養結束后用與實施例3相同的方法檢測發酵液中的DHCD含量，Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)不同發酵液樣品中的DHCD含量檢測結果如表5所示，表明利用Pseudomonasaeruginosa PAO1(pSPM01-1)發酵表達的氯苯雙加氧酶，可將底物苯轉化成DHCD，且培養基中苯的濃度為5mL/L時，DHCD產量較高。
表5用Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)轉化苯生產DHCD的搖瓶實驗結果

實施例7、重組菌Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)轉化苯生產DHCD的小型發酵罐實驗1)將Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)接種于LB-Km液體培養基中，在30℃、200rpm下搖床培養12h，再按5％(V/V)的比例將菌液接種到LBG-Km液體培養基中，在35℃、200rpm下搖床培養12h，然后按10％(V/V)的比例將菌液接種到6L小型發酵罐中，發酵液體積為3L，培養基為重組假單胞菌專用培養基II，在初始pH 7.0(pH通過5M NaOH自動控制)，通氣量為1L空氣/L發酵液/h，溶氧控制值為飽和值的20％，通過攪拌自動控制，攪拌轉速為200-800rpm，發酵培養至12h，將pH值控制在7.2；2)將苯溶解于石蠟中配成苯溶液，苯與石蠟的體積比分別為1∶1和1∶3；3)分別用分批加入(每隔1小時向每升發酵液中添加20mL苯或含有該體積苯的苯溶液)和連續流加的方式(流加速度為每小時20mL苯或含有同體積苯的苯溶液)將苯及步驟2)配制的苯溶液分別加入到步驟1)中含有Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)的發酵液中，培養過程中每隔2h使用與實施例3相同的方法檢測發酵液中的DHCD含量，當DHCD產量不再增加時，發酵培養結束。Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)不同發酵液樣品中的DHCD含量檢測結果如表6所示，表明利用Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)發酵表達的甲苯雙加氧酶，可將底物苯轉化成DHCD，且采用分批加入和流加的方式均可獲得較高產量的DHCD。
表6用Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)轉化苯生產DHCD的小型發酵罐實驗結果

權利要求
1.表達苯環雙加氧酶的工程菌，是將含有苯環雙加氧酶基因的表達載體導入假單胞菌中得到的重組假單胞菌。
2.根據權利要求1所述的工程菌，其特征在于所述苯環雙加氧酶基因為甲苯雙加氧酶基因。
3.根據權利要求2所述的工程菌，其特征在于所述甲苯雙加氧酶基因為NCBIGenBank號為J04996所述的TodC1、TodC2、TodB和TodA基因。
4.根據權利要求1所述的工程菌，其特征在于所述苯環雙加氧酶基因為氯苯雙加氧酶基因。
5.根據權利要求4所述的工程菌，其特征在于所述氯苯雙加氧酶基因為NCBIGenbank號為U15298所述的tcbAa、tcbAb、tcbAc和tcbAd基因。
6.根據權利要求1-5任一所述的工程菌，其特征在于用于構建所述含有苯環雙加氧酶基因的表達載體的出發載體為pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-5或pBBR1MCS-3。
7.根據權利要求6所述的工程菌，其特征在于所述含有苯環雙加氧酶基因的表達載體為pSPM01或pSPM01-1。
8.根據權利要求7所述的工程菌，其特征在于所述假單胞菌為Pseudomonasputida KT2442、Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas stutzeri 1317或Pseudomonas aeruginosa PAO1。
9.根據權利要求8所述的工程菌，其特征在于所述工程菌為Pseudomonas putidaKT2442(pSPM01)、Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)、Pseudomonas stutzeri1317(pSPM01)或Pseudomonas aeruginosa PA01(pSPM01-1)。
10.一種順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯的制備方法，是發酵權利要求1所述的表達苯環雙加氧酶的工程菌，獲得苯環雙加氧酶，再加入底物苯或苯溶液，每小時加入到每升發酵液中苯的含量為10-30mL，然后繼續發酵8-24小時，得到順-1，2-二羥基-3，5-環己二烯；所述苯溶液中的溶劑為石蠟或豆油，苯與溶劑的體積比為1∶1-3。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述發酵培養基為下述三種培養基中的任意一種1)每升培養基含酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，NaCl 8-12g/L，葡萄糖18-22g/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，其余為水。2)每升培養基含酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，葡萄糖40-60g/L，(NH4)2SO45-7g/L；MgSO40.38-0.45g/L；Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L；KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，其余為水；每升微量元素溶液I含Fe(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O 1.8-2.2g/L，其余為0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含ZnSO4·7H2O80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O 18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余為0.4-0.6M HCl。3)每升培養基含月桂酸7-9g/L，(NH4)2SO41.8-2.2g/L；MgSO40.38-0.45g/L；Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L；KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，其余為水；每升微量元素溶液I含Fe(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O 1.8-2.2g/L，其余為0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含ZnSO4·7H2O 80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余為0.4-0.6M HCl。
12.根據權利要求10或11所述的方法，其特征在于所述發酵溫度為30-35℃。
13.根據權利要求10或11所述的方法，其特征在于所述將苯或苯溶液加入發酵液中的方式為流加或分批補加。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于所述流加速度為10～30mL/h；所述分批補加的方式為每隔1小時每升發酵液中添加10～30mL苯或苯溶液。
全文摘要
本發明公開了表達苯環雙加氧酶的工程菌及其應用，特別是涉及一種苯環雙加氧酶的專用表達工程菌與該工程菌在生產順－1，2－二羥基－3，5－環己二烯中的應用。該工程菌是將含有苯環雙加氧酶基因的表達載體導入假單胞菌中得到的。一種順－3，5－二羥基－1，2－環己二烯的制備方法，是發酵所述表達苯環雙加氧酶的工程菌，獲得苯環雙加氧酶，再加入底物苯或苯溶液，每小時加入到每升發酵液中苯的含量為10－30mL，然后繼續發酵8－24小時，得到順－1，2－二羥基－3，5－環己二烯；所述苯溶液中的溶劑為石蠟或豆油，苯與溶劑的體積比為1∶1－3。本發明苯環雙加氧酶的專用表達工程菌將在DHCD的工業化生產中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12P7/02GK1869200SQ20061008060
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月19日 優先權日2006年5月19日
發明者陳國強, 歐陽少平, 孫尚瑜, 陳金春 申請人:清華大學