專利名稱：免疫磁珠分選去除分化體系中胚胎干細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫磁珠分選去除分化體系中胚胎干細胞的方法，更確切地說是采用免疫磁珠分選系統(MACS)將胚胎干細胞從其分化細胞中分離并去除，以期移植純化的分化細胞入動物體內以減少致瘤性的方法，屬于醫學生物技術領域。
背景技術：
中樞神經系統損傷修復一直是醫學界的重要難題，傳統藥物治療和手術干預方法都存在著難以克服的問題。隨著生物醫學技術的迅猛發展，在過去二十年中細胞治療(cell therapy)正越來越受到重視。細胞治療指將同種的或異種的、自體的或者異體的活細胞經過或者不經過加工后，移植于患者的腦內或脊髓內的特定區域，從而治療某種疾病。這種方法為解決神經細胞移植治療帕金森病等神經系統疾病提供了可能。
已有研究表明，將原始胚胎干細胞移植入動物體內會造成畸胎瘤，故除去胚胎干細胞分化細胞中的原始細胞、獲取大量純化的分化細胞已成為解決移植后致瘤性問題的關鍵。
傳統的將分化細胞提純方法有流式細胞儀分選、差速離心等，但上述方法均存在純度不高、儀器設備昂貴、影響細胞活力等不足，因此在實際工作中難以廣泛應用。免疫磁珠分選系統(Magnetic Cell Sorting，MACS)是一種新興的細胞分離技術，被廣泛用于細胞分離、蛋白質核酸純化等諸多領域，目前MACS已用于干細胞研究。此技術的核心是在磁珠表面包被具免疫反應原性的抗體，直接與靶細胞的抗原分子或間接與事先結合在靶細胞表面的抗體進行抗原抗體反應，在外加磁場中，這些結合了磁珠的細胞就會與其它未被結合的細胞分群，具超強順磁性的磁珠脫離磁場后立即消失磁性，這樣就可以提取或去除所標記的細胞，從而達到陽性或陰性選擇細胞的目的。此外，MACS具有孵育時間短、操作過程快、且不影響細胞在流式檢測中的散射特性與細胞的功能和活性的特點。另外，磁珠會在細胞培養的過程中生物降解，而無需再對磁珠進行專門的去除。從這些特點分析，磁珠分選能夠分離出高純度的細胞，且細胞活性保持完好。
目前尚未有如何分離去除胚胎干細胞分化體系中的原始胚胎干細胞的成熟的方法學報導。在本發明中，我們嘗試利用免疫磁珠分選系統(MACS)降低分化體系細胞中原始胚胎干細胞的比例，并經流式細胞儀檢測其純度，以從方法學上探討純化分化細胞，篩除其中原始細胞的具體途徑，為進一步將純化后的分化細胞移植入小鼠體內以進行降低致瘤性的研究奠定基礎。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種操作簡便、效果顯著的用免疫磁珠分選去除胚胎干細胞分化體系中原始細胞的方法。
為實現上述目的，本發明采用以下技術方案免疫磁珠分選去除胚胎干細胞分化體系中原始細胞的方法，包括如下步驟(1)制備單細胞懸液取培養的胚胎干細胞分化期細胞，用0.25％胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA消化2-4min，加血清終止消化，打散后離心，棄上清；用MACS緩沖液重懸細胞，過40μm濾網獲得單細胞懸液，調整細胞密度至107/ml；(2)MACS分離純化分化細胞按1∶100的稀釋比例加入小鼠抗小鼠SSEA-1 IgM抗體，使總體積為500μl，4℃孵育10min；用2ml MACS緩沖液洗滌細胞兩次，離心去除多余的抗體；用80μl MACS緩沖液重懸細胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗體的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入1ml MACS緩沖液洗滌兩次，離心去除磁珠抗體，棄上清，重新用500μl MACS緩沖液重懸細胞；2ml緩沖液預洗LD磁性分選柱后，將500μl細胞懸液過柱；1ml緩沖液洗柱兩次，去除非標記陰性細胞；移柱出磁場，用MACS緩沖液洗柱，收集洗液即為陽性細胞。
本發明首次將MACS間接陰性分選運用于胚胎干細胞的分化細胞的篩除分選中，篩除抗體結合陽性的細胞，保留純化后的陰性細胞，為MACS用于干細胞的研究提供了新的領域。胚胎干細胞特異性表面抗體(Special Stage Embryonic Angent-1，SSEA-1)是國際公認的常用的鼠胚胎干細胞的特異性胞膜表面標記物，和熒光二抗FITC有很高的結合效率，是分選順利進行的基礎，但由于其無磁珠直接結合，故只能用間接分選法。分選成功的前提是尋找胚胎干細胞的特異性標記物SSEA-1的適當作用濃度、作用溫度以及作用時間，以保證獲得最佳的分篩結果。出于有效性和保持細胞活性兩點考慮，經過多次實驗篩選，最終按1∶100的比例稀釋SSEA-1抗體即可獲得合適的作用濃度；經過多次不同溫度及不同作用時間的SSEA-1抗體檢測，最終選擇4℃作用10min為最佳篩選方式。
作為本領域常規操作，本發明中Trypsin-EDTA消化的時間為3min。離心的速度和時間為1000rpm，3min。這些數據可以根據具體實驗內容進行調整，并非本發明的創新點所在。
本發明的優點是在此優化的SSEA-1作用條件下，分篩后的分化細胞中原始細胞的比例可以明顯降低，差異有統計學意義，說明此方法簡便、有效。為進一步進行裸鼠體內移植分化細胞，進行致瘤性研究打下基礎。MACS方法操作簡便迅速，無須昂貴的實驗設備，且純度較高，分篩后的細胞有較好的存活率，分離效果可得到細胞培養、流式細胞術、熒光顯微鏡、以及PCR等分子生物學方法的確認。因此，本發明在干細胞研究中將有廣闊的應用前景。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明做進一步說明，并不以任何方式限制本發明，凡是依照本發明公開內容所進行的任何本領域等同替換，均屬于本發明的保護范圍。


圖1為SSEA-1作用濃度梯度圖。
圖2為SSEA-1于37℃作用時間梯度圖。
圖3為SSEA-1于4℃作用濃度梯度圖。
圖4-A為細胞分選實驗的陰性對照圖。
圖4-B為細胞分選實驗的分篩前SSEA-1陰性細胞中陽性比例圖。
圖4-C為細胞分選實驗的分篩后SSEA-1陰性細胞中陽性比例圖。
具體實施例方式
下述實施例中使用的材料及來源1.鼠胚胎干細胞(murine embryonic stem cells，mESC)系sv129株，ATCC編號為CRL-11379。
2.主要試劑及儀器小鼠抗小鼠SSEA-1 IgM抗體(R&D公司，美國)；包被羊抗小鼠IgM的免疫磁珠(Miltenyi Biotech公司，德國)；FITC(異硫氰酸熒光素)標記的羊抗小鼠IgM(Jackson ImmunoResearch公司，美國)；Mini MACS磁珠分選系統(Miltenyi Biotech公司，德國)；孔徑40μm篩網(Millipore公司，美國)，FACS Calibur型流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國)。
實施例1.誘導胚胎干細胞分化成神經前體細胞一.方法(公知方法)1.培養胚胎干細胞未分化的mESC在含有1000U/mL人類白血病抑制因子(hLIF，human Leukemia Inhibition Factor，CHEMICON)的ESC培養基(DMEM(Dulbecco’smodified eagle’s medium)，GIBCO；15mL/L胎牛血清(fetus bovine serum，FBS)，GIBCO；2mM非必需氨基酸(Non-essensial amino acid)，Invetrogen；0.55mM β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)，GIBCO；2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，GIBCO；青鏈霉素(Penicillin-Stroptomyicn liquid)，Invetrogen)中進行體外擴增，隔天換液，約5天細胞長滿瓶底后按1∶5比例傳代。
2.誘導胚胎體形成用0.25％Trypsin-EDTA(Invetrogen)消化mESC，離心，1000rpm，3min，棄上清；加入1ml ESC培養基重懸細胞，用巴斯德管輕輕吹打至單細胞；按2.5×104/cm2的細胞密度把消化后的ES單細胞接種于低黏附性培養皿(Petridish)中，用不含hLIF的ESC培養基的培養6天，細胞由接種時的單細胞長成懸浮的圓形細胞團，即胚胎體(Embryonic body，EBs)。
3.篩選nestin陽性細胞當EBs形成后，將胚胎體接種于0.1％明膠鋪底的普通培養皿中加入不含LIF的ES培養基，24h后將ESC培養基更換為無血清的ITSF篩選培養基(DMEM/F-12，GIBCO；其中加入5μg/mL胰島素(Insulin)，GIBCO；50μg/mL轉鐵蛋白(Transferrin)，Sigma；5μg/mL纖維連接蛋白(Fibronectin)，Sigma；30nmol/L硒酸鈉(Sodium selenium)，Sigma)培養6-10天。
4.Nestin陽性細胞擴增用0.25％胰酶消化篩選后的細胞，離心，1000rpm，3min；按2×105/cm2的密度接種細胞于預先鋪有15μg/mL多聚鳥氨酸(Poly-L-OrnithineSolution，Sigma)和1μg/mL鼠層連蛋白(Laminin，GIBCO)的培養皿中；加入增殖培養基(DMEM/F12中加入1×N2，1×B27，GIBCO；10μg/mL bFGF，R&D；1μg/mLLaminin)擴增Nestin陽性細胞，隔日換液，連續培養6天。
5.定向誘導分化擴增完畢后，培養基更換為分化培養基(DMEM/F12中加入1×N2，1×B27；1mg/L Laminin；200μM Ascorbic Acid，Sigma)誘導分化6～15天。
二.結果mESC在鋪有明膠的培養皿底生長為邊緣大致規則的近似圓形的細胞團。打散的胚胎干細胞在petri dish中懸浮培養，并撤除hLIF，可形成球形的EBs。之后將EBs打散用ITSF培養基篩選，細胞仍傾向聚集成團生長，但有很多散在呈梭形的細胞。經有絲分裂原的擴增后分化細胞數量增加，培養細胞中散在的梭形細胞多見。最后在誘導分化培養基內原先呈梭形的細胞逐漸變為圓形，細胞之間有豐富的突起連接。
實施例2.探索最適合的SSEA-1抗體與ES細胞作用濃度、溫度和作用時間一.方法1.培養胚胎干細胞未分化的mESC用含有1000U/mL hLIF的ESC培養基中，置于37℃，5％CO2孵箱中連續培養，隔天換液。約2-4天可長滿一皿，經0.25％胰酶消化后得細胞懸液，最終每皿可收集細胞量約為2×106/ml。
2.對mESC做不同濃度的小鼠SSEA-1抗體結合分析，了解SSEA-1最佳的作用濃度mESC棄去培養液，0.01M PBS(pH7.4)洗一遍，0.25％胰酶消化，離心，300g，3min；4％多聚甲醛重懸細胞，于4℃20min；0.01M PBS溶液洗一遍；滴加SSEA-1一抗稀釋液，4℃過夜，稀釋比例分別為①號管1∶25，②號管1∶50，③號管1∶100，④號管1∶500，⑤號管1∶1000。次日，PBS溶液清洗3遍；滴加1∶100稀釋的熒光二抗FITC工作液，避光，室溫孵育2h；PBS溶液清洗3次；標記后的細胞最終重懸于500μlPBS溶液中，做流式細胞分析。
3.根據上一步的實驗結果選擇適當的SSEA-1作用濃度，對mESC做不同作用時間的SSEA-1抗體結合分析，了解SSEA-1最佳的作用時間mESC棄去培養液，0.01MPBS洗一遍，0.25％胰酶消化，離心，300g，3min；4％多聚甲醛重懸細胞，于4℃20min；0.01M PBS溶液洗一遍；滴加1∶100稀釋的一抗SSEA-1工作液，分別在4℃和37℃作用時間分別為①號管5min，②號管10min，③號管15min，④號管30min，⑤號管60min；最終將標記過的細胞重懸于500μl PBS溶液中，做流式細胞分析。
二.結果1.最佳SSEA-1作用濃度不同SSEA-1作用濃度比例比較如圖1。結果顯示SSEA-1按1∶100比例稀釋，即可達到理想效果。
2.最佳SSEA-1作用溫度和時間不同SSEA-1作用時間的結果比較如圖2，3。結果顯示37℃5min或4℃10min可得到理想效果。
實施例3.分離、純化分化細胞一.方法1.制備單細胞懸液取實施例1得到的分化期細胞，0.25％胰酶消化3min，加血清終止消化，巴斯德管輕輕吹打約20次，離心，1000rpm，3min，棄上清。用MACS緩沖液重懸細胞，過40μm濾網以獲得單細胞懸液。鏡下計數并調整細胞密度至107/ml。
2.MACS分離純化分化細胞按1∶100的稀釋比例加入小鼠抗小鼠SSEA-1 IgM抗體，使總體積為500μl，4℃孵育10min；用2mlMACS緩沖液洗滌細胞兩次，1000rpm，3min，以去除多余的抗體；用80μl MACS緩沖液重懸細胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗體的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入MACS緩沖液洗滌，1000rpm，3min，棄上清，重新用500μl緩沖液重懸細胞；2ml MACS緩沖液預洗LD柱(MACS配件，MiltenyiBiotech公司，德國)后，將500μl細胞懸液過柱；1ml緩沖液洗柱兩次，以去除非標記陰性細胞；移柱出磁場，3ml緩沖液洗柱，收集洗液即為陽性細胞。分別按2×104/cm2細胞密度接種于培養皿中，收集其余細胞，待做后續實驗。
3.細胞活性檢測純化前后分別取10μl細胞懸液與10μl 0.4％臺盼藍溶液混合后，滴入細胞計數板置于顯微鏡下觀察。不著色、發亮的為活細胞，著色、胞體膨大者為死細胞，計數細胞總數及活細胞百分比。
4.細胞分篩后的流式細胞儀檢測將洗脫的SSEA-1陰性細胞和陽性細胞分別離心，1000rpm，3min；4％預冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗兩遍；加1∶100稀釋的FITC結合的抗小鼠IgM熒光二抗室溫孵育2小時；PBS洗兩遍；500μl PBS重懸細胞，上機檢測。采用SPSS 10.0軟件進行兩樣本均數的t檢驗，分析純化前后SSEA-1陰性細胞的純度及細胞活力的差別。
二.結果1.純化前分化細胞中原始細胞的比例平均為(11.61±5.34)％，純化后SSEA-1陰性細胞中原始細胞的比例平均為(0.325±0.255)％(P＜0.01)(圖4-A至圖4-C)2.純化前細胞存活率為(93.0±2.5)％，純化后為(92.6±0.7)％(P＞0.05)，這說明應用Mini MACS篩除分化細胞中的SSEA-1陽性細胞可明顯提高分化細胞的純度而基本不影響細胞活力。
權利要求
1.免疫磁珠分選胚胎干細胞分化細胞中原始細胞的方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備單細胞懸液取培養的胚胎干細胞分化期細胞，用0.25％Trypsin-EDTA消化2-4min，加血清終止消化，打散后離心，棄上清；用MACS緩沖液重懸細胞，過40μm濾網獲得單細胞懸液，調整細胞密度至107/ml；(2)MACS分離純化分化細胞按1∶100的稀釋比例加入小鼠抗小鼠SSEA-1IgM抗體，使總體積為500μl，4℃孵育10min；用2ml MACS緩沖液洗滌細胞兩次離心，去除多余的抗體；用80μl MACS緩沖液重懸細胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗體的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入MACS緩沖液洗滌離心，棄上清，重新用500μl緩沖液重懸細胞；2ml緩沖液預洗LD柱后，將500μl細胞懸液過柱；1ml MACS緩沖液洗柱兩次，去除非標記陰性細胞；移柱出磁場，用緩沖液洗柱，收集洗液即為陽性細胞。
2.根據權利要求1所述的免疫磁珠分選去除胚胎干細胞分化細胞中原始細胞的方法，其特征在于所述胰蛋白酶-EDTA消化的時間為3min。
3.根據權利要求1所述的免疫磁珠分選胚胎干細胞分化去除細胞中原始細胞的方法，其特征在于所述離心的速度和時間為1000rpm，3min。
全文摘要
本發明公開了一種免疫磁珠分選去除分化體系中胚胎干細胞的方法，屬于醫學生物技術領域。本發明包括如下步驟(1)制備單細胞懸液；(2)MACS分離純化分化細胞按1∶100的稀釋比例加入小鼠抗小鼠SSEA－1 IgM抗體，使總體積為500μl，4℃孵育10min；用2ml MACS緩沖液洗滌細胞兩次離心，去除多余的抗體；用80μl MACS緩沖液重懸細胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗體的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入MACS緩沖液洗滌離心，棄上清，重新用500μl緩沖液重懸細胞；2ml緩沖液預洗LD柱后，將500μl細胞懸液過柱；1ml緩沖液洗柱兩次，去除非標記陰性細胞；移柱出磁場，用緩沖液洗柱，收集洗液即為陽性細胞。本發明的優點是操作簡便快速，無須昂貴的實驗設備，純度較高，分篩后的細胞存活率高。
文檔編號C12N5/06GK1932008SQ20061011361
公開日2007年3月21日 申請日期2006年10月9日 優先權日2006年10月9日
發明者關云謙, 朱宛宛, 任萍, 王淑艷, 徐艷玲, 張愚 申請人:首都醫科大學宣武醫院