專利名稱：一種在小鼠胚胎細胞中基因定點突變的構建方法
技術領域：
本發明涉及利用類轉錄激活子核酸酶快速基因編輯的方法，具體涉及一種在小鼠細胞中基因定點突變的構建方法。
背景技術：
隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代的生物研究迫切需要有效的手段來進行基因功能的分析。由于生理和遺傳層面同人類較高的一致性，基因敲除小鼠模型成為了破譯人類基因功能及尋找人類疾病治療手段的有力工具。基因打靶技術是構建基因敲除小鼠的主要傳統手段。基因打靶就是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某 一基因為目的的一項技術。傳統基因打靶技術的限制因素之一是周期長且難度大的打靶載體構建過程。其次，由于動物細胞內自發的同源重組發生率只有10_5-10_6，將打靶載體電轉入小鼠胚胎干細胞之后，要花費大量時間和人力物力篩選發生目的同源重組的胚胎干細胞。而且ES細胞在體外培養過程中對培養條件要求苛刻，稍有不慎將會引起其不可逆的分化，而使其失去生殖系轉移能力，不能在后續操作中產生突變子代。再次，顯微注射的ES細胞僅有一定的概率成功整合成為能夠形成配子的生殖系細胞。并且要求ES細胞處于良好的生長及未分化的狀態。另外，如果已有現成的目的基因被靶向的ES細胞，但與欲研究的小鼠品系不同，則將需要花費大量的時間進行回交，以稀釋ES細胞原有的遺傳背景。人工鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases, ZFN)技術是近年來發展起來的一項基因組定點修飾的技術。ZFN是一種由靶向特定DNA序列的鋅指蛋白和具有非特異性作用的FokI核酸內切酶切割結構域組成的重組蛋白。一對人工設計的，識別特定的DNA序列的ZFN與目標DNA序列(通常為相鄰兩段各18-24bp，間隔4_7bp)結合之后，它們的FokI核酸內切酶將形成二聚體，從而切割DNA雙鏈,形成雙鏈斷裂(double strand break, DSB)。該損傷主要通過易錯性的非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)以及高保真性的同源重組(homologous recombination,HR)進行修復。其中非同源末端連接通過造成目的基因的移碼，可被用來對目的基因進行基因敲除。通過在受精卵階段顯微注射編碼ZFN的DNA或相應mRNA，已實現對小鼠，大鼠，斑馬魚等模式生物的基因敲除。盡管ZFN技術在基礎研究和應用領域有著廣闊的前景，然而根據需要構建對特定DNA序列有高度特異性和親和力的ZFN是一項勞動量大，周期長，成功率低的工作，這已經成為阻礙該ZFN大規模應用的瓶頸。ZFN的DNA識別結構域由若干個鋅指模塊組成，每個鋅指模塊識別特定的3個連續堿基，因此相鄰的3 6個鋅指模塊可識別DNA上連續的9 ISbp個堿基。這種三連體識別模式意味著在可供靶向的DNA序列選擇上有更小的靈活性。盡管已有數百種鋅指模塊，但是并沒有涵蓋所有可能的堿基排列組合。同時由于相鄰鋅指模塊間的相互作用會影響其堿基識別的特異性(context dependence),因此ZF在構建過程中要經過大量的優化才能實現對目的基因的特異性結合。另外由于ZF相對較低的DNA結合特異性，ZFN在細胞內的過表達會由于脫靶效應(Off Target Effect)造成較高的細胞毒性。

發明內容
本發明的目的克服現有技術在構建基因敲除小鼠技術中存在的周期長，工作量大，難度高，效率低等不足，提供了通過在小鼠受精卵顯微注射體外轉錄的靶向目標基因的TALEN信使RNA，實現快速構建基因敲除小鼠的方法。本發明涉及一種利用類轉錄激活子核酸酶快速構建靶向性基因組DNA改變的基因修飾小鼠的方法及其應用。本發明提供了一種在小鼠胚胎細胞中基因定點突變的構建方法，通過在小鼠胚胎細胞中引入特定核算序列構建基因定點突變小鼠，包括以下步驟(I)在小鼠目標基因組序列中確定目標靶序列；
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(2)按所述目標靶序列的順序，構建能夠識別并切割目標基因的TALEN核酸序列；(3)將所述TALEN核酸序列導入小鼠胚胎細胞內；所獲得的小鼠胚胎細胞用于體外培養或直接植入母鼠，表達TALEN并切割目標基因組，從而篩選目標基因突變的小鼠。與傳統方法相比，本發明方法省略了體外進行ES細胞篩選的過程，整個操作過程只需直接將核酸導入胚胎中，不需要將ES細胞引入胚胎，避免了因ES細胞在體外培養時因培養條件不符合要求時導致的不可逆分化。其中，所述小鼠目標基因組序列包括編碼基因的基因組序列、低度重復序列、中度重復序列、高度重復序列、低拷貝序列、基因間的轉錄活躍序列或非轉錄序列。其中，所述小鼠胚胎細胞包括小鼠單細胞受精卵或多細胞小鼠胚胎。其中，所述步驟(3)是將所述TALEN核酸序列在體外轉錄為mRNA并純化后，通過顯微注射導入小鼠胚胎細胞。所述TALEN核酸序列可以通過質粒構建、人工合成等方法獲得。其中，所述步驟(3)中，切割目標基因組所形成的DNA斷裂位點通過非同源末端連接修復或通過同源重組修復。其中，所述目標基因突變包括堿基插入、缺失、改變、移碼突變或敲除。其中，所述目標基因突變的小鼠是指通過選取目標基因發生突變的小鼠與野生型小鼠雜交，再選取上述雜交所得的同窩雜合子小鼠進行自交，然后從上述所得新生小鼠中篩選目標基因突變的純合子小鼠。本發明還提供一種小鼠胚胎細胞，所述細胞是按權利要求1-7所述方法制備獲得。本發明還提供一種純合子小鼠，是含有按權利要求1-7所述方法制備獲得的小鼠胚胎細胞。即，將按權利要求1-7所述方法制備獲得的小鼠胚胎細胞用于體外培養或直接植入母鼠，表達TALEN并切割目標基因組，篩選獲得目標基因突變的小鼠；再將其與野生型小鼠雜交，再選取上述雜交所得的同窩雜合子小鼠進行自交，然后從上述所得新生小鼠中篩選目標基因突變的純合子小鼠。本發明米用類轉錄激活子核酸酶(Transcription Activator-Like EffectorNuclease, TALEN)實現對目標基因序列的特異性切割。TALEN由TAL effectors及其融合的FokI核酸酶組成。其中，TALE(TAL effectors)是由12個或以上特異性識別DNA的串聯“蛋白模塊”及其兩側的N-末端與C-末端序列組成。TAL effectors的DNA識別模塊由34個氨基酸組成，每個TAL effectors的DNA識別模塊與DNA結合的特異性是由第12位和第13位氨基酸殘基決定的，被稱作重復可變的di-residues (RVDs)位點。RVDs與A、G、C、T四種堿基有著恒定的對應關系，即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G。因此，欲使TALeffectors識別并結合某一特定核酸序列，只須將TAL effectors的DNA識別模塊按照目標DNA序列串聯克隆即可。在實際操作中一般在目標基因中選擇兩處相鄰(間隔15 20個堿基)的祀序列(一般十幾個堿基)分別進行TAL effectors識別模塊的構建。所構建的TALEN在細胞內識別并切割特定的目標基因序列,形成雙鏈斷裂(double strand break,DSB) ο該損傷通過易錯性的非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)進行修復后，將有2/3的概率造成目的基因的移碼，從而實現對目的基因的敲除。另外，可通過在TALEN對基因組產生切割的細胞(或胚胎)中引入兩端帶有同源臂中間包含外源核酸序列的DNA片段，使斷裂的基因組DNA以外源DNA片段為模板進行同源修復，這樣使得在對目的基因進行敲除的同時，將所需的核酸序列引入目的基因的基因組中，形成定點敲入(Knockin)的細胞(或胚胎)。
本發明在小鼠胚胎中基因定點突變的構建方法，例如，在小鼠胚胎中實施基因敲除方法，包括步驟如下(I)在目標小鼠基因N端編碼序列中尋找合適的靶序列。(2)按照上述靶序列的順序，組裝相應的TALEN識別模塊，然后連入TALEN表達質粒。(3)將上述質粒體外轉錄成mRNA,并進行純化。(4)將上述體外轉錄的mRNA顯微注射入人工受精形成的小鼠受精卵。(5)將上述受精卵植入假孕母鼠輸卵管內。(6)提取上述步驟所得子代小鼠的基因組DNA進行基因型鑒定。(7)將目標基因發生移碼突變的小鼠分別與野生型小鼠雜交。(8)將上述雜交所得同窩的雜合子小鼠進行自交。(9)鑒定上述自交所得小鼠的基因型，篩選目標基因移碼突變的純合子小鼠。本發明的優點包括與現有技術ZFN介導的基因敲除技術相比，本發明采用的TALEN的DNA識別模塊與單個堿基有著明確的對應關系，模塊的排列組合方式不影響彼此的DNA識別與結合能力，從而成功解決了常規ZFN方法不能識別任意目標DNA序列，以及識別特性經常受上下游序列影響的問題，使得本發明在TALEN的串聯DNA識別模塊的構建過程中免去了 ZFN構建過程中相應的復雜而昂貴的優化篩選過程。本發明很大程度上降低了 TALEN的構建成本，便于普通實驗室能夠自己構建靶向目基因的TALEN。此外，因TALeffectors的堿基識別特異性，使TALEN在細胞內表現出更低的毒性。與傳統的在小鼠胚胎干細胞內通過同源重組對目標基因進行敲除或改變相比，本發明避免周期長且難度大的打靶載體構建過程。其次，本發明中的顯微注射TALEN信使RNA所得子代小鼠，如實施例所述，其中一條等位基因發生堿基缺失的概率高達80%，優選地，通過進一步優化實驗條件和提高實驗技能，突變率可達到90%以上。而現有技術及文獻表明，通過小鼠胚胎干細胞內同源重組及后繼篩選，發生定點敲除的概率不超過10%。篩選出的ES細胞還需經過胚胎顯微注射而產生嵌合體小鼠。嵌合體小鼠如果發生生殖系轉移(germline transmission)才有可能得到特定基因敲除的雜合子小鼠。而由于ES細胞在篩選過程中培養條件的變化而發生不可逆的分化，很可能突變的ES細胞分化的子代細胞不能進入生殖系而得不到敲除小鼠。本發明通過注射單細胞期的胚胎，不存在ES細胞分化的問題，因此通過重復實驗是一般能夠得到基因敲除的小鼠品系。本發明通過注射較高濃度的TALEN信使RNA實現了很高的突變效率，這在節省實驗時間以及人力物力的投入方面有很大的意義。而且，這種高突變效率也將有助于該技術在產卵較少、生長周期較長且單個動物經濟價值高的大型動物中的應用。再次，本發明直接向人工受精的小鼠受精卵中顯微注射TALEN信使RNA，避免了周期長、勞動量大、篩選發生目的同源重組小鼠胚胎干細胞的過程。另外，本發明中構建TALEN質粒的環節只需要I 3周，從顯 微注射到鑒定出目標基因發生移碼的雜合子小鼠只需要I個月左右，而傳統的通過在小鼠胚胎干細胞內進行同源重組構建基因敲除小鼠的周期通常需要至少一年的時間。本發明方法極大縮短了實驗周期，有利于研究的聞效推進。本發明通過在小鼠胚胎中進行靶向任意基因組DNA并使其發生改變從而快速構建基因敲除小鼠方法，通過向小鼠受精卵中直接引入識別并切割目標基因的類轉錄激活子且含有核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN)的編碼 DNA、mRNA、各種人工病毒顆粒或蛋白，通過DNA雙鏈斷裂(double strand break, DSB)以及由此引起的非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)修復來造成目標基因的移碼，從而獲得目標基因敲除的FO代雜合子或純合子小鼠。本發明克服了通過向小鼠受精卵注射人工鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases, ZFN)不能識別任意目標DNA序列，且識別特性經常受上下游序列影響的問題，以及由此帶來的ZFN構建過程中復雜而昂貴的優化篩選過程。與傳統的通過在小鼠胚胎干細胞內用同源重組打靶載體對目標基因進行敲除相t匕，本發明具有無需構建同源重組打靶載體、無需進行ES打靶細胞篩選，突變體比例高，操作簡便，實驗成本和周期大大減少等優點。


圖I為一個典型的人工TALEN蛋白的結構示意圖。圖2為攜帶識別四種不同堿基的單個重復單元的載體示意圖。
圖3為構建識別二連核苷酸(AT)的雙單元載體的示意圖。圖4為以雙單元載體為起始材料，通過3輪酶切連接反應組裝其中一側TALE重復模塊過程的示意圖。圖5為最終TALEN表達載體的構建示意圖。圖6為顯微注射Lpr-TALEN所得新生小鼠所對應PCR產物T7E1酶切電泳圖。圖7為顯微注射L印r-TALEN所得新生小鼠堿基缺失情況示意圖。圖8為顯微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠所對應PCR產物T7E1酶切電泳圖。圖9為顯微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠堿基缺失情況示意圖。圖10為Paklipl同源重組打靶載體示意圖。
具體實施例方式結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的保護內容不局限于以下實施例。在不背離發明構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。如按照Sambrook等人,分子克隆,實驗室手冊(New York ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)所記載人,或按照廠商的建議條件。本發明在小鼠胚胎細胞中基因定點突變的構建方法，是一種進行靶向任意基因組DNA并使其發生改變的方法，該方法包括向小鼠細胞中引入識別并切割目標基因的類轉錄激活子核酸酶(TALEN)的編碼核酸、蛋白或人工修飾的病毒等生物活性物質，這些生物活性物質最終通過轉變成為能夠識別特異DNA序列并具有對識別序列附近的DNA分子進行切割的蛋白質分子。然后，將細胞進行體外培養或者直接將其轉入適宜的母鼠輸卵管或者子宮中，使類轉錄激活子核酸酶表達并使得在切割位點附近的目標基因組DNA發生雙聯斷裂，接著對該DNA斷裂位點進行修復。其中，修復方式包括·(a)非同源末端連接修復。非同源末端連接修復導致基因突變(堿基插入、缺失)被引入到目的基因組序列中。(b)同源重組修復。同源重組修復使供體外源DNA序列引入到目標基因組DNA序列中，導致內源目標基因序列的改變。本發明中，小鼠細胞是小鼠胚胎細胞。小鼠胚胎包括小鼠單細胞受精卵或多細胞小鼠胚胎。本發明在小鼠胚胎細胞中基因定位突變的構建方法，包括基因突變或基因敲除，其步驟包括(I)在小鼠目標基因組序列中尋找合適的靶序列。(2)按照上述靶位點的堿基序列，構建相應的TALEN質粒/核酸序列。(3)將上述TALEN質粒DNA或其相應mRNA或相應蛋白質序列或相應人工病毒顆粒導入小鼠細胞。(4)將上述細胞植入適宜的母鼠輸卵管或者子宮內。(6)提取上述步驟所得新生小鼠的基因組DNA進行鑒定。(7)選取目標基因發生移碼突變或敲除的小鼠與野生型小鼠雜交。(8)選取上述雜交所得的同窩雜合子小鼠進行自交。(9)提取上述步驟所得新生小鼠的基因組DNA，篩選目標基因發生移碼突變或敲除的純合子小鼠。所述小鼠目標基因組序列為編碼基因的基因組序列、低度重復序列、中度重復序列、高度重復序列、低拷貝序列、基因間的轉錄活躍序列或非轉錄序列。實施例I在小鼠細胞中Lpr基因敲除的構建
I、TALE靶位點的預測，即確定目標靶序列以L印r基因為本實施例中的小鼠目標基因組序列。登陸網頁TAL EffectorNucleotide Targeter 2.O (https://boglab. pip. iastate. edu/node/add/talen-old),按照操作說明，將目的基因L印r的第三個外顯子(由于未能在L印r的第一二個外顯子中找到滿足條件的靶位點)序列粘貼入相應文本框，勾選有關參數的選擇框。設定擬被TALE模塊識別的堿基數量Otepeat Array Length)范圍，優選地，本實施例中設定為15-20 ;設定間隔區域(Spacer)堿基數量，優選地，本實施例中設定為15_20。經篩選得到了若干候選革巴位點。進一步地，本實施例選擇的祀位點序列(SEQ ID NO. I)如以下所示LeftGCACTTAACCTGGCATAT|CCAATCTCTCCCTGGAA|ATTTAAGTTGTTTTGTGGCGTGAATTGGACCGTATA|GGTTAGAGAGGGACCTT|TAAATTCAACAAAACACCRight本實施例中，由于所用的TALEN質粒系統中位于TALE結合位點3’端用來識別堿基T的最后O. 5個TALE模塊已經被預先整合進pCS2_FokI載體，因此，勾選選項“Requirea T atposition N”,從而使候選序列TALE結合位點3’端均為T。 2、TALE模塊的組裝，即構建能夠識別并切割目標基因的TALEN質粒根據上述靶位點序列進行TALE模塊組裝。如圖I所示的一個典型的人工TALEN蛋白的結構，位于中部的是重復的DNA結合模塊，其左側和右側分別是來自TALE氮端的136個氨基酸和來自TALE碳端的63個氨基酸，更右側的是FokI核酸酶的切割結構域。一個典型的天然存在的重復單元是由34個氨基酸組成，其中第12和第13位是決定DNA結合的特異性重復可變的di-residues (RVDs)位點。優選地，本實施例中使用的質粒系統采用了一種“替代重復單元”，使得在不影響蛋白編碼的情況下“替代重復單元”的兩端分別有SpeI和NheI這兩個同尾酶酶切位點。該同尾酶體系使得通過重復的酶切以及連接反應進行TALE模塊的構建成為可能。模塊組裝的起始材料為攜帶識別單個堿基的TALE模塊的質粒，這些質粒是在PMD18-T (TAKARA)的基礎上構建的。四個攜帶識別單個堿基的TALE模塊質粒分別被命名為PA，pT，pC，pG，其相應編碼的重復可變二連氨基酸分別是NI，NG, HD和NN，如圖2所示的攜帶識別四種不同堿基的單個重復單元的載體示意圖。每個載體分別攜帶一個單個替代TALE單元，后者分別帶有編碼NI，NG, NN, HD的RVD，從而分別識別堿基A，T，G，C。 靶向目標DNA序列的TALE模塊可以通過一系列使用Nhel+HindlII以及Spel+HindHI的酶切-鏈接反應循環進行構建。圖3所示為一個通過使用同尾的限制性內切酶NheI和SpeI，以及另外一個內切酶HindIII，將兩個單個單元載體(A，T)通過一輪酶切連接反應構建成識別二連核苷酸(AT)的雙單元載體的示例，其中S，N, H分別代表Spel，NheI以及Hindlll。以在識別單個堿基的TALE模塊質粒的基礎上構建識別5’ -AT-3’雙堿基的TALE重復模塊為例說明了 TALEN質粒的構建過程(I)用Nhel+Hindlll雙酶切pA載體，37°C反應2小時。切膠回收含有TALE模塊的線性化載體(此處為2. 8kb)。(2)用Spel+Hindlll雙酶切pT載體，37°C反應2小時。切膠回收含有TALE模塊的DNA片段(此處為102bp)。(3)使用T4Ligase對步驟(I)和⑵中回收的DNA片段和載體進行連接，16°C連接2小時。(4)將步驟(3)中的連接產物轉化入DH5 α或類似的感受態，涂于氨芐抗性LB平板，放入37 °C恒溫培養箱過夜。
(5)挑取步驟(4)中的克隆進行擴增，提取質粒，用Spel+Hindlll進行酶切，用2%瓊脂糖膠進行電泳。釋放的DNA片段大小約為204bp(102bpX2)的，即為陽性克隆。(6)重復步驟(I) (4)中的方法繼續TALE模塊的組裝。最終得到的包含全部所需TALE模塊的質粒pMD-TALE。按上述方法構建的4種堿基任意兩兩組合可得到16個質粒，在此基礎上進行組裝能夠有效縮短所需要的時間。圖4為以雙單元載體為起始材料，通過3輪酶切連接反應組裝其中一側TALE重復模塊過程的示意圖。通過pMD18-T載體上多克隆位點兩側的測序引物(M13-47和RV-M)從兩個方向對pMD-TALE載體進行測序，以確認TALE模塊拼接無誤。
用NheI酶切pCS2_FokI載體，其中用來結合左側和右側TALE模塊的分別被命名為pCS2-PEAS和pCS2-PERR，并對其進行去磷酸化以防止其發生自連。其中pCS2_PEAS經過了 E484A，R487S點突變改造，pCS2_PERR進行了 D483R點突變改造，從而使兩者只能形成異源二聚體，而不能形成同源二聚體，以此提高對靶位點識別的特異性，降低非特異性識別造成的脫靶效應。如圖5所示的最終TALEN表達載體的構建，即，用Spel+Nhel雙酶切pMD-TALE質粒，將所釋放片段連入已用NheI線性化并去磷酸化的pCS2-FokI載體，其中左右兩個TALE分別連入PCS2-PEAS和pCS2-ERR。將連接產物轉化入感受態大腸桿菌，涂于氨芐抗性LB平板，37 °C培養過夜，并挑取克隆。通過使用SP6引物進行測序確定TALE模塊在pCS2_TALEN載體中的插入方向。3、體外轉錄TALEN mRNA并進行顯微注射取相同摩爾數(質量，如果TALE模塊數相等的話)的上述步驟中TALE模塊插入方向正確的PCS2-PEAS和pCS2-ERR質粒，進行混合，通過TALEN編碼區下游的NotI位點進行線性化，使用SP6 mMESSAGE mMACHINE Kit試劑盒對線性化的質粒進行體外轉錄。將體外轉錄所得mRNA用試劑盒所提供的LiCl溶液進行沉淀，使用顯微注射用TE重懸并將濃度稀釋為20ng/y I。使用顯微注射儀器將上述mRNA溶液注射入體外受精小鼠受精卵的原核部分，構建形成特定的小鼠胚胎細胞(受精卵)。體外培養1-2小時后將存活的受精卵移植入假孕母鼠的輸卵管。4、新生小鼠的基因型鑒定新生小鼠出生2周后，剪取腳趾，抽提基因組DNA。在靶向切割序列上游設計PCR引物Pl (SEQ ID NO. 2)，下游設計PCR引物P2 (SEQID NO. 3)，以待鑒定小鼠基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應結束后對產物進行純化，變性，緩慢退火，加入可識別并在非匹配的位點進行切割的HEndonuclease I，進行瓊脂凝膠電泳。圖6為顯微注射L印r-TALEN所得新生小鼠所對應PCR產物T7E1酶切電泳圖。如圖6所示，其中每個泳道600bp左右條帶為Paklipl鑒定引物P1，P2擴增所得產物，其中泳道I，2，3，4，6，7中約250和350bp處為經T7EI切割產生的條帶，其中條帶的強度與堿基缺失的數量成正比。Pl 引物序列TGCAAGGATTTCCAGAATCC
P2 引物序列GAATGCAGGCAGAACACAAC將第1，2，3，4，6，7號小鼠PCR產物分別連入pMD18T載體，分別挑取若干克隆提取質粒并進行測序，其中每只小鼠均有一定比例的克隆存在堿基缺失。圖7為顯微注射Lepr-TALEN所得新生小鼠堿基缺失情況示意圖，如圖7所示，其中帶有灰色陰影的序列為TALEN左右兩側靶序列，其中折線所占據的位置分別為各小鼠所缺失的堿基。選取缺失非3的整數倍堿基的雜合型小鼠，分別與野生型小鼠雜交，并將所得到的同窩小鼠進行自交，即可得到目的基因Lepr敲除的純合子小鼠。實施例2在小鼠細胞中Paklipl基因敲除與敲入的構建I、靶向Paklipl敲入位點的TALEN質粒的構建及驗證
以Paklipl基因為本實施例中的小鼠目標基因組序列。登陸網頁TALEffectorNucleotide Targeter 2.O (https://boglab. pip. iastate. edu/node/add/talen-old)，按照操作說明，將目的基因Paklipl的第一個外顯子序列粘貼入相應文本框，勾選有關參數的選擇框。設定擬被TALE模塊識別的堿基數量(Repeat Array Length)范圍，優選地，本實施例中設定為15-20 ;設定間隔區域(Spacer)堿基數量，優選地，本實施例中設定為15-20。由于Paklipl第一個外顯子長度較短，未在其中找到滿足條件的靶位點，進而提交了第二個外顯子序列，經篩選得到了若干候選靶位點。進一步地，本實施例選擇的靶位點序列(SEQ ID NO. 4)如以下所示LeftCCAACAGTCGCTATGT|AGTCTCTGGCAGCAA|AGATGAGACGATTCACGGTTGTCAGCGATACA|TCAGAGACCGTCGTT|TCTACTCTGCTAAGTGRight接下來按照實施例I中的思路進行TALE模塊的組裝，構建能夠識別并切割目標基因的TALEN質粒，進而體外轉錄TALEN mRNA并進行顯微注射。當新生小鼠出生2周后，剪取腳 止，抽提基因組DNA。在靶向切割序列上游設計PCR引物Ρ3 (SEQ ID NO. 5)，下游設計PCR引物Ρ4 (SEQID NO. 6)，以待鑒定小鼠基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應結束后對產物進行純化，變性，緩慢退火，加入可識別并在非匹配的位點進行切割的HEndonuclease I，進行瓊脂凝膠電泳。圖8為顯微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠所對應PCR產物T7E1酶切電泳圖，如圖8所示，其中每個泳道800bp左右條帶為Paklipl鑒定引物P3，P4擴增所得產物，其中2，4，5號小鼠所對應的泳道中約200和600bp處為經T7E1切割產生的條帶，其中條帶的強度與堿基缺失的數量成正比。P3 引物序列TTGGCCCTTCTTGGTCCCTC。P4 引物序列TCCCACAGGCTTGTGCTCAC。將第2，4，5號小鼠PCR產物分別連入pMD18T載體，分別挑取若干克隆提取質粒并進行測序，其中三者分別有一定比例的克隆存在堿基缺失。圖9為顯微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠堿基缺失情況示意圖，如圖9所示，其中帶有灰色陰影的序列為TALEN左右兩側靶序列，其中折線所占據的位置分別為各小鼠所缺失的堿基。通過以上實驗證明針對該靶點的TALEN質粒是有效的，為接下來開展TALEN輔助下的同源重組奠定了基礎。2、以靶位點兩側序列為同源重組引導序列構建敲入載體
圖10為Paklipl同源重組打靶示意圖。用引物對P5(SEQ ID NO. 7)，P6 (SEQ IDNO. 8)擴增靶位點左側序列HRDSl和用引物對P7 (SEQ ID NO. 9)，P8(SEQ ID NO. 10)擴增靶位點右側序列HRDS2，連入T載體，得到質粒pHRDSl+2，同時通過設計PCR引物時引入酶切位點使得HRDSl和HRDS2之間引入AscI酶切位點。然后以pEGFP-ACN載體為模板，用引物對P9(SEQ ID NO. 11), PlO (SEQ ID NO. 12)擴增得到帶有pA的EGFP編碼序列，并通過AscI酶切位點連入之前構建好的pHRDSl+2，PCR確定插入方向。將鑒定正確并線性化的DNA片段與Pakl ipI-TALEN mRNA顯微共注射入小鼠受精卵的細胞核部分。得到小鼠后，使用分別與HRDSl和EGFP互補的一對引物鑒定并篩選發生目的敲入的小鼠。P5 引物序列ATGCAGATCTAGTCCGACATGTCAAGATGGP6 引物序列ATCCGGCGCGCCATACATAGCGACTGTTGGAGGP7 引物序列ATCCGGCGCGCCTCTGGCAGCAAAGATGAGACP8 引物序列ATCGGTCGACAACCTCAGGATAAGGAGCAC P9 引物序列GTATGGCGCGCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTPlO 引物序列CAGAGGCGCGCCTGAATTCGCCCTTATCGGCG。
權利要求
1.一種在小鼠胚胎細胞中基因定點突變的構建方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)在小鼠目標基因組序列中確定目標靶序列； (2)按所述目標靶序列的順序，構建能夠識別并切割目標基因的TALEN核酸序列； (3)將所述TALEN核酸序列導入小鼠胚胎細胞內； 所獲得的小鼠胚胎細胞用于體外培養或直接植入母鼠，表達TALEN并切割目標基因組，從而篩選目標基因突變的小鼠。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述小鼠目標基因組序列包括編碼基因的基因組序列、低度重復序列、中度重復序列、高度重復序列、低拷貝序列、基因間的轉錄活躍序列或非轉錄序列。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述小鼠胚胎細胞包括小鼠單細胞受精卵或多細胞小鼠胚胎。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)是將所述TALEN核酸序列在體外轉錄為mRNA并純化后，通過顯微注射導入小鼠胚胎細胞。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，切割目標基因組所形成的DNA斷裂位點通過非同源末端連接修復或通過同源重組修復。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述目標基因突變包括堿基插入、缺失、改變、移碼突變或敲除。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述目標基因突變的小鼠是指通過選取目標基因發生突變的小鼠與野生型小鼠雜交，再選取上述雜交所得的同窩雜合子小鼠進行自交，然后從上述所得新生小鼠中篩選目標基因突變的純合子小鼠。
8.—種小鼠胚胎細胞，其特征在于，所述細胞是按權利要求1-7所述的方法制備獲得。
9.一種純合子小鼠，其特征在于，所述純合子小鼠含有按權利要求1-7所述方法制備獲得的小鼠胚胎細胞。
全文摘要
本發明公開一種在小鼠胚胎細胞中基因定點突變的構建方法，通過在小鼠胚胎細胞中引入特定核算序列構建基因定點突變小鼠，包括以下步驟在小鼠目標基因組序列中確定目標靶序列；按所述目標靶序列的順序，構建能夠識別并切割目標基因的TALEN核酸序列；將所述TALEN核酸序列導入小鼠胚胎細胞內；所獲得的小鼠胚胎細胞用于體外培養或直接植入母鼠，表達TALEN并切割目標基因組，從而篩選目標基因突變的小鼠。本發明具有無需構建同源重組打靶載體、無需進行ES打靶細胞篩選，突變體比例高，操作簡便，實驗成本和周期大大減少等優點。
文檔編號C12N5/10GK102839156SQ20121029100
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月15日 優先權日2012年8月15日
發明者李大力, 邱中偉, 劉明耀 申請人:華東師范大學