專利名稱：：兔胚胎干細胞系及其建系方法兔胚胎干細胞系及其建系方法發明背景小鼠因多種優點而被廣泛地應用于生物學和醫學研究。一方面，業已建立了許多具有同源遺傳背景的野生型同類小鼠品系。另一方面，業已建立和表征了許多具有遺傳突變的小鼠模型，這些遺傳突變體大多通過同源重組技術獲得(Robertsonetal.，1986;Thompsonetal"1989;Babinetetal.，2001)。這些遺傳突變小鼠的個別基因被缺失、增加或被修飾，這樣的小鼠在遺傳和發育生物研究領域具有非常重要的作用。有些小鼠的遺傳突變模擬人類的疾病狀況(Holschneideretal.，2001;Haradaetal.，1999;Kulkarnietal.,1999)，這類小鼠為闡明人類疾病的發病機理提供了非常有價值的動物模型。雖然小鼠在遺傳學研究方面具有重要作用，但是由于其個體較小，對于某些需要較大個體的動物的生物學實驗卻并不是理想的模型動物。基于這種原因，兔長期以來作為優選的模型動物被廣泛運用于心血管、肺等器官疾病的研究中。兔還被廣泛用于生產抗體、代謝病研究和藥物篩選等方面，因為這些實驗需要頻繁的采取血樣，較大個體的動物更適合于此類研究(Gravesetal.，1993)。兔孕期短(31天)，飼養方便，在生物、醫學及藥學研究中具有重要的作用。兔還具有重要的經濟價值，譬如兔的毛皮(安哥拉長毛兔)可運用于紡織工業。使用轉基因技術，還可在兔乳汁中生產人類酶蛋白，用于治療由于酶蛋白遺傳缺陷引起的人類疾病。利用兔或兔細胞系來生產人源化抗體，在醫藥研究領域具有廣泛的用途。胚胎千細胞是一種由著床前胚胎的內細胞團在體外培養而成多能干細胞(Evansetal.，1981;Gailetal.，1981)。這種細胞能在體外長期傳代而不影響其發育潛能，而且能保持穩定的二倍體核型。將胚胎千細胞重新引入到早期胚胎中，它們能發育成機體的每一種細胞類型，包括生殖細胞(Bradleyetal.，1984)。在早期的研究中，從兔囊胚中分離培養出一種"可能的"胚胎干細胞，在體外能長期培養(Gravesetal.，1993)，能分化形成類胚體。然而，這種細胞系是在血清培養基中建立培養而成的，血清中的許多成分使得胚胎干細胞發生很高的自發分化率。這種細胞能在體外培養多長時間并仍能保持參與胚胎發育的潛能，仍屬未知。另外，作者未能提供諸如表面標志物的表達、畸胎瘤的形成，分化的多能性等胚胎干細胞相關的特征信息。人胚胎干細胞于1998年首次建立(Thomsonetal.，1998;Reubinoffetal.，2000)。未分化的人胚胎干細胞能在體外長期培養，表達喊性磷酸酶、許多表面標志物及多能性相關的標志物，在體外培養中能形成類胚體，在免疫缺陷小鼠體內能形成畸胎瘤。雖然不同物種的胚胎干細胞具有相似的特點，比如在祠養層細胞上生長良好，具有高核質比，在體外在化學成分相對明確的培養基中能長期培養，但是不同物種的胚胎干細胞在很多方面存在著固有的不同。從不同物種的胚胎中分離干細胞的過程中，需要調整不同的影響因素至最佳狀態。例如最適的胚胎發育時期對分離胚胎千細胞成功與否至關重要，大多數小鼠和兔胚胎在受精后3-4天發育至嚢胚期，而人胚胎發育至嚢胚階段需5-6天。人、小鼠和兔三個物種的嚢胚和內細胞團的形態和生長動態各不相同。此外，在原代的由內細胞團、嚢胚或完整胚胎生長出的細胞團中，準確地識別出未分化胚胎干細胞、滋養層細胞和其他類型細胞至關重要，以便能夠特異性地挑選出未分化的胚胎干細胞進行傳代。這依賴于對早期不同胚胎細胞類型的形態和行為的詳盡了解，不同物種早期胚胎細胞的形態和行為是各不相同的。而且，在培養不同物種的胚胎干細胞時，培養體系中相同組分需要調整到不同的狀態，以滿足特定物種的胚胎千細胞的最適需要。比如，大多數小鼠胚胎干細胞在較厚的銅養層細胞上生長良好，而大多數人胚胎干細胞最適宜生長在較薄的飼養層細胞上。小鼠胚胎干細胞能用劇烈的酶消化的方式進行傳代，而相同的傳代方式可能增加人胚胎千細l包染色體異常的幾率(Buzzardetal.，2004)。由此可見，似乎不太可能利用現成的人和小鼠胚胎干細胞的建系方法進行其他哺乳動物的胚胎千細胞建系。因此，有必要建立一種新的方法來建立兔胚胎千細胞系(rbES)，使其能夠在體外長期維持未分化狀態，并保持正常的核型。
發明內容一方面，本發明提供了一種利用無血清培養體系建立多能兔胚胎干細胞系的方法，包括下列步驟(a)收集嚢胚期的兔胚胎；(b)在無血清培養基中培養從嚢胚中分離出來的內細胞團；(c)從內細胞團的生長物中挑選出未分化的兔胚胎干細胞，傳至新的培養基中；(d)在體外長期傳代兔胚胎干細胞，并使之保持未分化狀態。用以培養兔胚胎干細胞的培養基含有血清替代物，既可商購，也可自制。培養基中優選添加生長因子，例如bFGF。不同的品系或林系的兔子均可用作分離兔胚胎千細胞的來源。胚胎或嚢胚可通過自然交配獲得，也可通過體外受精獲得。兔胚胎干細胞也可從兔體細胞核移植產生的嚢胚中分離培養而來，核移植胚胎能成功地發育至嚢胚(50%-80%2-細胞胚胎能發育至嚢胚)，從而可用于獲得核移植胚胎干細胞(ntES)。因為ntES的遺傳背景與體細胞核供體相同，所以當分化的ntES移植回核供體內不會被排斥，因此，兔將成為很好的治療性克隆的動物模型。或者，兔嚢胚也能通過孤雌激活卵母細胞產生，并從中分離出孤雌胚胎干細胞(pES)。本培養體系為研究孤雌胚胎干細胞的潛在運用提供了模型。從囊胚中分離內細胞團可以采用機械剝離法，也可采用免疫外科手術法。飼養層細胞可以是1)任何類型的來自小鼠、兔和其他哺乳動物的體細胞；2)任何類型的由小鼠、兔和其他哺乳動物胚胎千細胞分化而來的細胞；或者3)任何永生化的哺乳動物細胞系。例如，銅養層細胞可以來自受孕12-15天的小鼠胚胎。另外，可以通過形態觀察來選擇未分化的兔胚胎千細胞。另一方面，本發明提供了利用上述方法建立起來的兔胚胎干細胞系。所述rbES細胞系能夠表達多能性相關的分子標志Oct3/4，在免疫缺陷動物體內能形成畸胎瘤。所述rbES細胞系能在無血清培養基中長期增殖(大于3個月)，保持正常的核型，維持未分化的多能狀態。優選地，可采用許多技術對rbES細胞系進行基因改造。通過轉染，感染或電轉化的方法，可將編碼期望的肽的DNA導入到rbES基因組中。在特定的內源性或外源性啟動子的控制下，rbES能表.達這些肽。在大多數情況下，使用這些方法導入的DNA分子隨機整合到rbES的基因組中。或者，利用同源重組技術，能夠精確和可控地敲入、敲出或改造基因(例如，基因增加、缺失或修飾)。通過生殖系傳遞或核移植技術，可以從rbES獲得活的兔個體。在一種方法中，將rbES注射入囊胚腔中(Schoonjansetal.，1996)或者與四倍體胚胎聚集(Nagyetal"19卯；Nagyetal"1993)。在胚:胎環境中，未分化的rbES將參與到三個胚層各種組織的發育中。或者，用rbES作為核供體，可以通過核移植技術獲得活的個體(Wilmutetal.，1997;Edwardsetal.，2003)。因此，本發明的目的之一是用基因改造或未改造的rbES作為核供體，通過核移植技術，獲得兔胚胎、兔胎兒、新生兔和成體兔。在一個實施方案中，上述核移植方法包括下列步驟(a)將rbES細胞與去核的兔卵母細胞融合，或將rbES細胞注射到去核的兔卵母細胞中；(b)使用電脈沖和/或化學物質激活核移植單元；(c)將處于著床前任何階段的核移植單元移植入代孕母兔或其他代孕哺乳動物母體的生殖系統中；(d)使植入的胚胎在體內發育。其中，"著床前階段"包括l-細胞、2-細胞、4-細胞、8-細胞桑椹和嚢胚階段。優選地，植入的胚胎在體內進一步發育成兔胎兒、新生兔或成體兔。在一個實施方案中，上述核移植方法可以產生帶有特定基因突變的活體兔，突變可以通過導致DNA序列改變的一個或幾個堿基插入、缺失或天然突變獲得。這就是說，可以將rbES技術同基因改造技術和核移植技術相結合，構建能夠產生具有特定基因型和表型的轉基因兔的技術平臺。例如，使用特定的rbES細胞系作為核供體，通過核移植克隆可以產生具有相同遺傳背景的兔克隆群。這些兔品系與其同類系相似，可被廣泛地用作為實驗動物。另外，用經過基因改造的rbES作為核供體，可以產生具有新基因型的轉基因兔，這種轉基因兔可以在乳汁、血液或身體的其他部分產生所期望的肽。例如，可以產生在乳汁中含溶酶體酸性a-葡萄糖苷酶(lysosomalacida-glucosidase)(GAA)的兔基因型，這種乳汁可用作為々大食增補物治療遺傳性的GAA缺陷患者。可以產生在乳汁或身體其他部分可以分泌生長因子、酶或生物活性肽的特定兔基因型。可以操縱編碼免疫球蛋白的兔基因，使其產生人源化抗體。也可改造編碼兔皮毛成分的基因，從而改變兔毛的顏色、密度和直徑等。又在另一方面，本發明提供了通過上述核移植方法產生的兔突變體。優選地，所述兔攜帶的突變或者引起免疫缺陷，或者誘導模擬人類疾病的癥狀，或者影響或改變特定兔組織或器官的生物學特征，從而使得所述組織或器官表現出新的生物學特征。或者，在所述兔中，編碼免疫球蛋白的基因的DNA序列中帶有變化，編碼兔毛皮成分的基因的DNA序列中帶有突變，或者編碼參與代謝過程的肽的基因的DNA序列中帶有突變。又在另一方面，本發明提供了利用上述轉兔突變體來獲得具有商業價值的生物產品的方法。這種生物產品可以是治療人類疾病的分子，包括但不限于人源化抗體。本發明還涉及兔突變體在遺傳、發育、生物學、藥學和醫學研究中作為實驗動物模型的用途，或其在藥物研究、篩選、研發和毒理測試、以及組織工程中的用途。一旦改變rbES細胞的基因組，這種經遺傳修飾的rbES就可以作為核供體用以產生帶有特定期望特征的活兔。使用這種方法，就可以產生許多不同的兔突變體，類似于多種轉基因小鼠的產生(TorresM.，1998)。可以優先考慮創建攜帶參與肺和心血管疾病形成的基因突變的兔，以推進對這些系統的研究。攜帶參與代謝路徑的修飾基因的兔對藥物篩選和毒理測試具有重要作用。通過干細胞技術創建兔品系將利于干細胞研究、組織工程和器官移植。具有同源遺傳背景的兔系之間的細胞或組織移植不會引起排斥反應。突變對免疫系統功能至關重要的基因可以產生免疫缺陷的兔。而免疫缺陷兔可以提供千細胞(比如人胚胎千細胞)在體內的行為的重要信息。通過將人類細胞移植進入免疫缺陷兔體內，產生穩定的人兔細胞嵌合體，可以促進藥物篩選和毒理測試。如前所述，rbES同樣可以從.孤雌或核移植所產生的嚢胚中分離出來(Kaufmanetal.，1983;Cibellietal.，2002;Wakayamaetal.，2001;Hwangetal.，2004)。這種rbES細胞及他們的親本兔(為pES提供卵母細胞的母兔，以及為核移植干細胞ntES提供核供體細胞的兔)可用以研究pES和ntES在體內的行為。所以，本發明的一個目的是通過將rbES注射入著床前的不同發育階段的兔胚胎中，產生嵌合體兔。這種rbES可以來自常規的兔胚胎/囊胚、孤雌囊胚或核移植囊胚，并且可以經過基因改造或未改造。本發明的實用性本發明利用無血清培養體系建立的rbES細胞系能夠以未分化的狀態在體外長期傳代(大于100代)，并保持穩定核型。分子分析表明rbES細胞具有許多與hES細胞相似的特性，即他們表達ES細胞典型的多能性分子標志，還有在未分化ES細胞中高表達的分子。這些細胞在體外在成分明確的培養條件下生長增殖，并且在體外和體內能分化成許多細胞類型。rbES細胞具有分化為所有三個胚層的細胞和組織的潛能。rbES表現出高克隆形成率，便于進行遺傳操作。通過不同的方法，可以對rbES進行一系列的基因改造，比如同源重組。基因改造或未改造的rbES細胞可以作為核供體產生活的兔個體。干細胞技術、基因改造技術和動物克隆技術相結合，將形成一個技術平臺，有效地生產新的兔品系。這些新品系的兔將為醫學、生物學、藥學研究提供獨特的實驗系統。這些新品系兔也將產生具有經濟價值的產品。附圖的簡短說明圖1:rbES細胞的形態圖A.嚢胚階段的受精胚胎。B、C和D.來自rbES:l、QZL2和LHR2的rbES。在無血清培養基中，rbES細胞在輻照的小鼠祠養層上形成扁平單層的克隆，大多數克隆有明顯的邊界，細胞核質比高，核仁明顯。加入血清促使rbES在凝膠包被的培養皿中貼壁和生長，但是rbES將很快分化(E和F)。圖2:rbES細胞系長期培養后保持正常核型(rbES傳代80次的核型分析)。G帶染色顯示了雌性rbES細胞系的正常核型44,XX。圖3A:兔O""、7DGF/、FG/V和五J^F2基因的部分cDNA序列。圖3B:rbES表達多能分子標志及ES細胞中所富含的分子。rbES細胞系穩定地表達O""、EA4F2、FG7^和rZ)G7^7(分別是泳道l、3、5、7)。在逆轉錄步驟中未加入逆轉錄酶的樣品作為基因組DNA污染的對照(分別是泳道2、4、6、8和10)。p-肌動蛋白(泳道9)用作為體系內參。圖4:rbES細胞表達的標志的細胞化學和免疫組化分析。人ES細胞(hES35a)表達抗SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的抗體所識別的標志，但不表達SSEA-1。小鼠ES(mES)只表達SSEA-1。相反，rbES細胞(qzlES2)不表達這5種抗體所識別的分子。rbES表達OCT-4和高水平的堿性磷酸酶活性。圖5:rbES分化形成的細胞和組織類型。A.由rbES細胞形成的類胚體(EB);B.由EB貼壁后向外長出的細胞中含有具典型神經細胞形態的細胞，這些細胞的p-微管蛋白抗體免疫染色呈陽性；C.有些EB切片含有腸狀結構，a-胎蛋白抗體免疫染色呈陽性；D.其他EB切片CD31免疫染色呈陽性，CD31是上皮細胞的標志，能夠對血管樣結構進行染色。圖6:rbES細胞形成的畸胎瘤的組織學分析。畸胎瘤含有多種分化組織A.角化復層扁平上皮(外胚層)；B.毛嚢(外胚層)；C.腸上皮(內胚層)；D.假復層纖毛柱狀上皮(內胚層)；E.肌肉(中胚層)圖7:表達綠色熒光蛋白GFP的rbES細胞亞系(rESl-GFP2)。A和B.穩定表達GFP的rbES細胞集落；C和D.從表達GFP的類胚體中中長出的ES細胞。E和F.在分化后有些分化的細胞依然是GFP陽性。左列(A、C和E)為熒光顯微照片；右列(B、D和F)分別為同一視野的放大照片。圖8:兔ntES表達的標志(免疫細胞化學染色)。兔n促S細胞不表達SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-8〗。兔ntES細胞表達OCT-4和高水平的堿性磷酸酶。圖9:兔ntES細胞正常核型。G帶染色顯示了雄性兔ntES細胞系(第9代)的正常核型44,XY。圖10:pES細胞學和免疫組化染色。兔pES細胞不表達SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，TRA-l-60，TRA-l-81.兔ntES細胞表達OCT-4和高水平的堿性磷酸酶。圖11:兔pES細胞的正常核型。G帶染色顯示了雌性pES細胞系(第20代)的正常核型，44,XX。圖12:正常兔ES細胞(rbES)、兔ntES細胞和兔pES細胞中印跡基因表達的RT-PCR分析。A.正常rbES和pES細胞中H19和SNRPN的表達。pESBl，兔孤雌胚胎千細胞B1;pESCl,兔孤雌胚胎干細胞C1;prabbitB，pESBl卵細胞供體兔；prabbitC，pESCl卵細胞供體兔；MW表示DNA分子量標志泳道；(-)，無逆轉錄酶的陰性RT對照。B.兔ntES細胞中H19和SNRPN基因的表達。ntESAl，兔核移植胚胎干細胞A1;ntrabbitA,ntESAl核供體兔；MW，分子量標志；(-)，無逆轉錄酶的陰性RT對照。圖13:rbES，兔ntES和兔pES細胞的孩t衛星標志分析。A為5L1C3基因座(位于5號染色體)的STR分析；B為19L1A4基因座(位于19號染色體)的STR分析；C為6L1F10基因座(位于6號染色體)的STR分析；D為OCELAMB基因座(位于內皮細胞白細胞粘附分子l基因上)的STR分析。框內數字和相應的峰代表每一STR標志的PCR產物大小(bp)和多態性的位置。5個電泳圖代表5個DNA樣品的分析pESBl供體兔(l)、PESB1(2)、ntESAl供體兔(3)、ntrESAl(4)以及作為對照的無關供體兔(5)。圖14:rbES細胞核移植到去核卵母細胞中所產生的活體小兔。實驗表明rbES細胞核在核移植實驗中能支持胚胎發育至嚢胚階段。圖15:哺乳動物表達載體pQBIpgk的圖譜。pQBIpgk為在轉化的哺乳動物細胞中表達GFP的表達載體，該載體GFP-neo構建體的氨基端含GFP,以確保細胞既抗G418，又表達GFP。小鼠pgk啟動子和腺病毒的三聯引導序列結合確保其在多種細胞類型尤其是在ES細胞中長期穩定地表達。該載體的設計使得缺乏polyA信號序列的表達盒易于切除和亞克隆。實施例以下將結合實施例和附圖進一步闡迷本發明，這些實施例絕不應當解釋為對本發明的限制。實施例l.rbES細胞培養在本實施例中，我們利用基本相同的分離和培養方法，從三個亞種(新西蘭，安哥拉，青紫蘭)的兔嚢胚中分離胚胎干細胞，其中，從新西蘭白兔獲得一個細胞系，從安哥拉兔獲得一個細胞系，從青紫蘭兔獲得三個細胞系(圖l和表l)。從三種不同的兔亞種中成功地對兔胚胎干細胞進行了建系的結果表明本方法可同樣地適用于其他兔亞種。新西蘭，安哥拉，青紫蘭兔分別購自上海實驗動物中心、北京市藥品檢驗所和南京金陵種兔場。自然交配4天后，用PBS將囊胚從子宮中沖出，機械法或者免疫外科法(Davoretal.,1975)分離出內細胞團，接種到經55CyY射線照射的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養層上。基本培養液含78%DMEM/F-12,2mML-谷氨酸，1%非必需氨基酸，0.1mM(5-巰基乙醇，20%KnockOut血清替代物(Invitrogen，Caiisbad，CA)，添加或不添加4-8ng/ml人重組bFGF。3-5天左右，內細胞團生長形成集落。最初長出的內細胞團通常含有異類的細胞類型。6-8天后，機械法挑選出具有典型ES細胞形態(圖1)的細胞傳代至新培養板中。如圖1所示，在無血清培養基中，rbES細胞在祠養細胞上形成扁平單層的克隆。5個細胞系的群體倍增時間分別在大約12-16小時(表l)。細胞核大，核質比高，這些特點與hES細胞相似。與h]ES細胞相比，核仁小而不明顯。大多數集落有明顯的邊界。在培養皿中，能觀察到單個的rbES細胞和小的新細胞集落的生長。rbES細胞早期采用機械法傳代，1-2個月后，使用胰酶消化的方法傳代。即，用0.05%的胰酶消化細胞后，輔以輕輕的吹打，使細胞成為小團塊。NZ-1細胞系已使用胰酶消化的方法傳代l年以上，迄今仍保持正常核型(圖2)。所有rbES細胞系均在不含LIF的培養液中建立。因此，rbES細胞多能性的維持不依賴于外源性的LIF。雖然rbES細胞系最初是在含bFGF的培養液中建立的，但在隨后的實驗中很快就發現，在不添加外源性bFGF的培養液中，rbES細胞也能很好的增殖并保持未分化狀態。在含4ng/mlbFGF的培養液中，rbES細胞群體倍增(PD)時間為15h，而在不含bFGF的培養液中，rbES細胞群體倍增時間為20h(數據未顯示)。所以，bFGF能夠增加rbES細胞的增殖速度。也許rbES細胞依賴于內源性的bFGF維持未分化狀態的存活和增殖，這需要進一步的實驗來加以證實。在無血清培養基中，rbES已持續傳代l年以上，仍保持未分化狀態。在無血清培養基中，rbES的生長似乎依賴于伺養層細胞。當傳至無飼養層細胞的凝膠包被的培養亞中時，rbES不能貼壁。在培養液中加入血清能促使細胞貼壁和生長，但很快就會分化(圖1，數據未顯示)。血清中促使細胞分化的因子仍未知。表1.由三個兔亞種建立的rbES細胞系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例2.rbES細胞表達的分子標志用Trizo1⑧(Invitrogen，Carlsbad,CA)提取總RNA，以DNaseI于37。C處理20分鐘以去除污染的基因組DNA。根據廠家提供的方法，使用莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(Promega，Madison，WI)和隨機引物(Promega)進行第一鏈的合成。引物序列如表4所示。使用下列參數進行PCR^應94。C變性4分鐘，隨后35個擴增循環，包括94。C變性30秒，退火30秒，72。C延伸40秒，之后在72。C進行5分鐘終延伸。退火溫度見表4。在逆轉錄步驟中不加逆轉錄酶的樣品用作為基因組DNA污染的對照。f;-肌動蛋白用作為體系內參。潛果0c"是所有胚胎干細胞的多能性標志。r/)G/7、FG7^和五A4F2在ES細胞中高表達，而當ES分化時其表達下調。我們對兔OW、7T)G^7、FGJW和五A4F2基因的部分序列進行了擴增、克隆和測序。結果示于圖3A之中。rbES細胞表達OW(圖3B)。值得注意的是，在我們的培養體系中，rbES細胞能長期增殖(^2year)，其能夠保持未分化狀態，并且表達O"-么為了分析rbES細胞的標志物表達情況，將rbES細胞克隆在4%PFA(多聚甲醛)中室溫固定15分鐘。細胞以TBS-T緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.4，0.15MNaCl，0.05%Tween-20)洗兩遍，5-10分鐘/次。0.1%TritonX-100/PBS室溫處理細胞10分鐘。再以TBS-T緩沖液洗兩遍，5-10分鐘/次，然后以3%BSA/PBS(封閉液)酵育1h。表征rbES細胞所使用的一抗為購自Chemicon(Temecula，CA)的anti-SSEA-l、anti-SSEA誦3、anti-SSEA畫4、anti-TRA-l-60和anti-TRA-l-81以及.購自SantaCruzBiotechnology的(SantaCruz，CA)anti-OCT-4。所有抗體以PBS稀釋，并與樣品于4'C孵育過夜。次日，以TBS-T緩沖液洗三遍，5-10分鐘/次。加二抗，室溫孵育1小時。所用的二抗為FITC綴合的驢抗山羊IgG、FITC綴合的山羊抗小鼠IgG+IgM、FITC綴合的驢抗小鼠IgG和FITC綴合的山羊抗大鼠IgG+IgM(JacksonLaboratories,WestGrove,PA)。激光共聚焦顯微鏡(01ympus)觀察并拍照記錄。為了檢測堿性磷酸酶活性，將rbES細胞以4%PFA室溫固定10分鐘，以緩沖液III(100mMTris-HCl，100mMNaCl，50mMMgCl2，pH9.5)沖洗10分鐘，與NBT/BC[P(緩沖液m1:100稀釋)室溫暗反應15-30分鐘。充分顯色后終止反應，PBS洗一遍，觀察并拍照記錄。為了檢測分化的rbES細胞的標志物表達，類胚體(EBs)懸浮培養20天后，收集，制備冷凍切片。或者，EBs懸浮培養4-7后，轉移到塑料載片上貼壁培養。再繼續培養7天，使分化細胞由EBs向外長出。載片上的細胞4%PFA室溫固定10-15分鐘。加一抗4。C過夜進行抗體染色。所用的一抗為外胚層分子標志P-微管蛋白m(l:400，Sigma)、NSE(1:5，DAKO)和波形蛋白(1:50，DAKO);中胚層分子標志anti-CD3]l(1:100，DAKO)，anti-MHC(1:100，SantaCruz)和anti-結蛋白(1:100，S詣taCruz);內胚層分子標志anti-AFP(1:500，Biogenex)，anti-白蛋白(1:1000，DAKO)和anti-c-met(1:100，SantaCruz)。樣品與HRP綴合的二抗(l:lOO，Jackson)37。C賻育l小時。顯色后，以溶于PBS之中的50。/o甘油封片，以配備有Spotdigitalcamera(斑點數碼相機)和軟件的Olympus顯微鏡進行鏡檢分析。趙已知不同物種來源的ES細胞與抗SSEA-l、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的抗體的反應不同。例如，hES表達能被抗SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的抗體所識別的抗原，但不表達能被抗SSEA-1的抗體所識別的抗原。小鼠ES細胞只表達這五種標志中的'一種，即SSEA-1。相反，rbES不表達能被這五種抗體識別的分子(圖4)。尚無法確定是rbES根本不表達類似于這些表面抗原的標志，還是rbES表達類似抗原，但不與這些抗體交叉反應。如圖4所示，rbES表達高水平的堿性磷酸酶。實施例3.細胞克隆及群體倍增時間的計算我們研究了三種rbES細胞系的克隆形成率。以0.05%胰蛋白酶將細胞集落消化成單細胞。每個細胞系接種1000個細胞到培養亞中。5天后，計算集落數量，克隆形成率以下列公式計算克隆形成率(％)=(克隆數/1，000)x100%。如表2所示，三種rbES細胞系rbESl、Qzl2和LHR1的克隆形成率分別為0.15±0.01%、0.18±0.04%和0.13±0.03%。rbES細胞的克隆生長將會有利于遺傳操作過程中rbES細胞的篩選。表2.rbES細胞的克隆形成率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>以記號筆在培養亞的底部標記小的(大約IO個細胞左右)細胞集落，每隔24小時照相，計算集落內的細胞數量(N)，以確定群體倍增(PD)時間。PD時間值根據下列公式計算PD(小時)-時間總長/Log2(N2/NJ。每抹細胞至少計算三個PD值，然后求平均值。在4ng/mlbFGF培養液中，5個i'bES細胞系的群體倍增時間為12至16小時，如表1所示。而在不含bFGF培養液中，rbES細胞群體倍增時間為20小時(數據未顯示)。這表明，bFGF濃度升高能夠促進rbES細胞增殖。實施例4.體外分化通過類胚體途徑，rbES細胞能夠在體外分化。以lmg/mlIV型膠原酶37。C消化rbES細胞3-5分鐘，輕輕吹打成小的細胞團，懸浮培養4-8天，培養基包括如下成分78%DMEM，20%FBS，2mML-谷氨酸，1%非必需氨基酸和O.lmMp-巰基乙醇。每兩天換一次培養液。rbES細胞在無飼養細胞、含血清的培養條件下懸浮培養，可迅速形成外表光滑的EB(圖5A)。EB經過貼壁培養后，可生長出許多形態各異的分化細胞。免疫組化染色表明，分化的rbES細胞表達所有三個胚層的分子標志(43)。由EB貼壁生長出的細胞中有具典型神經細胞形態的細胞，這種細胞呈神經絲H(神經組織相關標志，外胚層)陽性(圖5B)。有些EB的切片含有腸樣結構，免疫組化染色顯示呈a-胎蛋白陽性(圖5C)。在其它EB切片中可見血管狀結構的周圍有部分細胞呈CD31(血管內皮細胞相關標志，中胚層)陽性。表3.rbES細胞、兔ntES和兔pES細胞所表達的分化標志<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例5.體內分化為了檢測rbES的體內分化潛能，將大約2-5><106形態上未分化的3種rbES細胞注射進NOD-SCID小鼠后腿肌肉中(4周齡，購自中科院上海實驗動物中心)。10-12周后，所有3種rbES細胞系均形成實體畸胎瘤。在腫瘤形成的8-10周內，對畸胎瘤取材進行切片，4。/。多聚甲醛固定，蘇木精和曙紅染色后進行組織學分析。實體畸胎瘤含有豐富的組織類型，如圖6所示，這些畸胎瘤包含有來自三個胚層的組織，包括角化復層扁平鱗狀上皮和毛嚢(外胚層)；肌肉(中胚層)；以及腸上皮和假復層纖毛柱狀上皮(內胚層)。從而，體內和體外實驗都證實，在本發明的無血清培養體系中建立起來的rbES細胞系具有發育的多能性，能發育成所有三個胚層的多種組織。實施例6.遺傳操作將由CMV啟動子驅動的含GFP基因的載體電轉化到rbES細胞中。新霉素抗性篩選得到數百個表達GFP基因的克隆。從中建立7個GFP+的rbES細胞亞系，他們在體外保持未分化的增殖，并持續表達GFP(圖7)。實施例7.核型分析將處于指數生長期的rbES細胞，加入200ng/ml終濃度的秋水仙素于5%C02中于37。C孵育1.5-2小時。0.05%胰酶消化成單細胞，1,200rpm離心5分鐘(印pendorfcentrifuge,5810R)，加入IOml37。C預熱的低滲液(KC10.56g/100ml水+檸檬酸鈉0.5g/100ml水)，37。C孵育30分鐘。逐滴加入2ml固定液(乙酸:甲醇-l:3)于低滲液中，室溫預固定5分鐘。1,200rpm離心5分鐘。重懸于10ml固定液中，室溫固定10分鐘。再重復離心固定步驟2-3次。最后一次固定后，離心，剩余適量固定液，重懸細胞，將細胞滴加到-20C預冷的栽玻片上。室溫老化2天后，65。C老化4小時。0.1%胰酶(溶于0.8o/o的NaCl中)37'C消化5分鐘，1%Giemsa染色15分鐘，鏡檢，照相，每個rbES細胞系至少計數20個中期染色體標本，并分析至少5個Giemsa染色帶的核型實施例8.rbES細胞的基因改造利用哺乳動物表達載體pQBIpgk(Takara，Japan)作為轉基因載體。pQBIpgk載體結構如圖15所示，GFP-NEO融合蛋白的表達在小鼠pgk啟動子和腺病毒三聯引導序列的聯合控制下。Qiagen-cleanedlargeseale質粒DNA以限制酶SalI處理而線性化，以等體積酚/氯仿抽提一次，以等體積氯仿抽提兩次。1/10體積3MNaAc(pH5.2)和2.5倍體積100。/。乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌數次，重懸于滅菌PBS中，濃度lpg/]al。以0.05%胰酶/1mlEDTA消化細胞，1.0-1.5x1()7個rbES細胞重懸于10ml培養液中。PBS洗兩次，重懸于800纟ilPBS中，加入IOO照線性化的DNA，放置于4mmBiorad基因脈沖管中，室溫靜置20分鐘。利用BioradGenePulserll電轉化系統，250V電壓和500pF電容電轉化。電轉化后，將脈沖管于室溫靜置15分鐘。細胞重懸于培養液中，涂板到鋪有飼養細胞的6cm培養皿中，鋪板密度lx106個細胞/皿。第二天更換培養液。電轉化48小時后，加入350jLig/ml的G418。每天換液，持續7天。挑選出保持未分化形態的克隆，機械劃成50個細胞左右的小塊，傳到3.5cm的培養皿中。實施例9.從核移植和孤雌嚢胚中建立rbES細胞系名^c^^it屈W種建新西蘭成年母兔頸部皮下注射PMSG150IU/只(天津市華孚高新生物技術公司，中國)以進行超數排卵。96小時后耳緣靜脈注射HCG100IU/只(ZhongbaoInc.Tianjin，China)。HCG注射后15hi后以沖卵液沖出Mn卵母細胞，沖卵液為hRD培養液(50%RMPI1640,50%DMEM，(Gibco)，補充有10。/o胎牛血清(FCS，Hyclone，Uhta，USA)，10mMHEPES)。將沖出的團狀物移入600pl含100IU/ml透明質酸酶的hRD中。置C02培養箱38。C消化10分鐘后，將分散的卵母細胞和顆粒細胞復合體移入hRD，洗滌7次(50plHRD液滴)。在新的hRD液滴中，用內徑和透明帶外徑大小相等的玻璃管吹打復合體，直至顆粒細胞完全脫落。脫顆粒的卵母細胞洗滌6次，細胞移入mRD(10%FCS，20mM谷氨酸，223丙酮酸鈉，P/。非必需氨基酸)，38°C,5%C02，100%濕度培養箱中待用。為了去除笫一極體，將卵母細胞移入含7.5pg/ml松胞菌素B(Sigma)的hHRD中37。C培養10分鐘，極體以外徑15-22的去核針吸出。將去除極體的卵母細胞移入融合液中，洗滌三次，然后移入融合槽內的融合液中進行電擊激活。電擊參數如下直流電3.0KV/cm，時長20jis,三次脈沖，每次脈沖間隔一秒。電擊儀為BTX830，融合液(0.25M山梨糖醇，O.lmM乙酸鉤，0.5mM乙酸鎂，lg/LBSA)。電擊后將去除極體的卵母細胞移入mRD中洗滌三次，置38。C,5%C02:I100%濕度培養箱中培養。l小時后作第二次電擊。將去除極體的卵母細胞移入含5mg/mLCHX(環己酰亞胺)和2mM6-DMAP(二甲氨基嘌呤)的mRD中培養l小時，然后移入mRD培養液培養2小時，然后移入50ml添加2.5%FBS的B2培養液微滴中，置38。C，5%C02,100%濕度培養，觀察胚胎的發育。通常4天后收集嚢胚。使用上述技術，成熟的兔卵母細胞經化學激活，發育為嚢胚，并成功地從孤雌囊胚中分離出孤雌胚胎千細胞即pES細胞。名裙移控發麼^種建單個供體細胞注射進去核卵母細胞的卵周隙。為進.行電融合，將去核卵母細胞-成纖維細胞復合體移入融合液中，洗滌三次，然后移入融合槽內的融合液(0.3M山梨糖醇溶液，添加0.5mM醋酸鎂，0.1mM醋酸鉀，10mMHepes，lmg/mlBSA)中，用毛細玻璃針撥動重構復合體，使去核卵母細胞與成纖維細胞的接觸面與電流的方向垂直，然后進行電擊，參數如下直流電3000V/cm，時長20jis，三次，每次間隔一秒。電擊后將重構復合體移入mRD中洗滌三次，置38。C，培養1.5小時。隨后，進行同樣的電擊誘導激活。重構胚移入含5mg/mLCHX和2mM6-DMAP的mRD中，38。C培養l小時。然后胚胎在mRD中培養過夜，第二天移入代孕母體內。或者在50ml的含2.5。/。FBS的B2培養液的微滴中，置38匸，5%C02，100。/。濕度培養箱內培養4-5天，形成嚢胚，或在第二天轉移到假孕的母兔體內。胚胎移植受體母兔晚于卵母細胞質供體兔24h左右耳靜脈注射HCG80IU/只誘導排卵。8-15個4-細胞或8-細胞的重構胚經由輸卵管傘轉移入兩側的輸卵管內。兔胎兒自然分娩或在第31天剖腹產。使用上述核移植技術，來自核供體兔耳朵皮膚的成纖維細胞被重編程，發育至嚢胚階段。而后從囊胚的內細胞團中成功分離出核移植胚胎干細胞即ntES細胞。絲兔ntES細胞(圖9)和兔pES細胞(圖ll)均能在體外長期增殖(ntES，10代；pES，20代)并保持正常核型。這兩種細胞系都表達高水平的堿性磷酸酶和多能標志OCT4(圖8和10)。通過分析印記基因的表達和微衛星基因分析，證實了兩種細胞的核移植和孤雌來源(圖12和13)。實施例10.利用rbES細胞作為核供體產生克隆兔在小鼠核移植試驗中，ES細胞已被用來作為核供體細胞克隆出了活體小鼠。因為ES細胞本身就是多能性的，以ES細胞作為核供體能夠提高克隆效率(Wakayamaetal.，1999;Rideoutetal.，2000)。我們發現，像小鼠ES細胞一樣，rbES也能作為核供體細胞，產生活的克隆兔。與去核卵母細胞融合后，rbES細胞核能支持胚胎發育至嚢胚階段。rbES來源的核移植胚胎移植入代孕母體內，胚胎持續發育并進而產生活體克隆小兔(圖14)。分化和未分化的均已被成功地用作為核供體而產生活體克隆小兔。表4.RT-PCR引物序列、退火溫度和產物大小基因引物序列退火溫度產物大小_(M_OCT4EBAF2FGF4TDGF1P肌動蛋白F5'CATGAGCAGCAAGGGAAAAC3'R5'GGGCGATGAACCATACCG3，F5'AAGTGGGCCGAGAACTGG3，R5'TGCCGTCCTCCTTTATGC3'F5'CATGAGCAGCAAGGGAAAAC3'R5'GGGCGATGAACCATACCG3'F5'GACGCAACTGTGAACATGATG3'R5'GCCAGGTAGAAAGGTCTGAGG3'F5，CACACGGTGCCCATCTACG3'R5，GCCATCTCCTGCTCGAAGTC3'5755565958231178134126203參考文獻BradleyA，EvansM，KaufmanMH，RobertsonE(1984):Formationofgerm-linechimaerasfromembryo-derivedteratoca:rcinomacelllines.Nature309:255-256.BabinetC，Cohen-TaimoudjiM(2001):Genomeengineeringviahomologousrecombinationinmouseembryonicstem(ES)cells:anamazinglyversatiletoolforthestudyofmammalianbiology.AnAcadBrasCienc73:365-383.BuzzardJJ，Gough匪，CrookJM，ColmanA(2004):KaryotypeofhumanEScellsduringextendedculture.NatBiotechnol22:381-382.CibelliJB，GrantKA，ChapmanKB，CunniffK，WorstT，GreenHL，WalkerSJ，GutinPH，Vil譜L，TabarV，DominkoT，KaneJ，WettsteinPJ，La隨RP，StuderL，VranaKE，WestMD(2002):Parthenogeneticstemcellsinnonhumanprimates.Science295:819.DavorSolterandBarbaraB(1975):KnowlesImm冊osurgeryofMouseBlastocyst.PNAS72:5099-5102.EvansMJ，KaufmanMH(1981》Establishmentincultureofpluripotentialcellsfrommouseembryos.Nature292:154-156.EdwardsJL，SchrickFN，McCrackenMD，vanAmstelSR，HopkinsFM，WelbornMG，DaviesCJ(2003》Cloningadultfarmanimals:areviewofthepossibilitiesandproblemsassociatedwithsomaticcellnucleartransfer.AmJReprodImmunol50:113-123.GailR.Martin(1981):IsolationofaPluripotentCellLinefromEarlyMouseEmbryosCulturedinMediumConditionedbyTeratocarcinomaStemCells.PNAS78:7634-7638.GravesKH，MoreadithRW(1993》Derivationandcharacterizationofputativepluripotentialembryonicstemcellsfrompreimplantationrabbitembryos.MolReprodDev36:424-433.HolschneiderDP,ChenK，SeifIetal(2001):Biochemical,behavioral,physiologic,andneurodevelopmentalchangesinmicedeficientinmonoamineoxidaseAorB.BrainResBull56:453-462.HaradaN，TamaiY，IshikawaTetal(1999):Intestinalmicewithadominantstablemutationofgene.EMBOJ18:5931-5942.HwangWS，RyuYJ，ParkJH，ParkES，LeeEG，Ko()JM，JeonHY，LeeBC，KangSK，KimSJ，AhnC，HwangJH，ParkKY，CibdliJB，MoonSY(2004》EvidenceofaPluripotentHumanEmbryonicStemCellLineDerivedfromaClonedBlastocyst.Science303:1669-1674.KulkarniRN，BruningJC，WinnayJNetal(1996):Tissue-specificknockoutoftheinsulinreceptorinpancreat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