專利名稱：一種快速特異擴增差異表達基因長片段的方法
技術領域：
本發明涉及一種表達基因的克隆，尤其是涉及一種快速特異擴增差異表達基因長片段的方法。
背景技術：
許多年以來，分離差異表達基因的方法僅限于差異篩選cDNA文庫，直到1992年mRNA差異顯示技術(Liang P，Pardee A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of thepolymerase chain reaction.Science，1992，257967-971)，第一次實現了同時很靈敏地檢測到真核細胞中大部分的轉錄本。近些年來，在分離和克隆差異表達基因的功能基因組學研究中，國內外學者又發展了多種分析方法，如代表性差異分析、抑制消減雜交(Diatchenko L，Lau Y FC，Campbell A P，et al.Suppression subtractive hybridizationA method for generating differentiallyregulated or tissue-specific cDNA probes and libraries.Proc Natl Acad Sci USA，1996，936025-6030)和基因芯片技術等等。實踐證明，這些方法的應用，取得了很多的成就，克隆了一系列的差異表達基因，均各具獨特優點，但同時也具有其自身的缺陷，如有的假陽性高、有的產生的基因片段短、有的技術復雜成本高等(李斐雪，王雁玲.差異表達基因的高通量篩選方法.細胞生物學雜志，2004，26339-343；周延凱，周建林，聶東宋.篩選差異表達基因方法的新進展.生物技術通報，2004，15(6)620-622；李文雍，陳清軒.篩選差異表達基因的方法進展.阜陽師范學院學報，2004，21(1)1-6；徐德全，熊遠著.差異表達基因克隆技術的研究進展.中國畜牧獸醫，2004，31(3)31-34；謝偉偉，王憑青，楊青川等.植物差異表達基因克隆技術及研究進展.重慶大學學報，2005，28(12)96-100；肖朝庭，儲明星，傅衍.幾種基因差異表達篩選技術在動物發育與繁殖中的最新進展.中國畜牧獸醫，2006，33(4)34-38)此外，引物退火時能否與其靶序列特異結合，是PCR能否成功擴增的關鍵因素之一，因此優化引物的結構是非常重要的。退火溫度的高低決定引物是否能與其互補鏈完全結合，還是有一個或多個堿基錯配，因此通過調整退火溫度就可以增加引物與模板結合的特異性。許多研究者提出了各種辦法來提高引物退火的特異性，如在引物的5’端增加一段通用引物序列，或加一段同聚物，或加上一段環狀序列，以增加PCR擴增的特異性和雜交的穩定性(Brownie J，Shawcross S，TheakerJ，et al.The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.Nucleic Acids Res，1997，253235-3241；Saiki R K，Walsh P S，Levenson C H，et al.Genetic analysis of amplified DNA withimmobilized sequence-specific oligonucleotide probes.Proc Natl Acad Sci USA，1989，866230-6234；Ailenberg M，Silverman M.Controlled hot start and improved specificity in carryingout PCR utilizing touch-up and loop incorporated primers(TULIPS).BioTechniques，2000，291018-1024)，但這些方法并不能消除初始反應的非特異性雜交。

發明內容
本發明的目的在于針對上述方法所存在的不足，提供一種具有重復性高、假陽性低、快速實惠和獲得的基因片段較長等特點的，特別有利于在非模式生物中克隆的快速特異擴增差異表達基因長片段的方法。
本發明的具體步驟為1)逆轉錄合成cDNA第一條鏈以總RNA或mRNA為模板，dT-RSL為引物，在逆轉錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈；2)PCR擴增第一條cDNA鏈經稀釋后，與dT-RSL引物和RSL隨機引物混合于PCR管中退火，進行一個PCR循環反應，合成第二條cDNA鏈，隨后將PCR反應體系中的dT-RSL和RSL隨機引物分別與cDNA第二條鏈特異結合，經PCR循環，擴增出特異的DNA片段；3)結果檢測取擴增產物溶解于上樣緩沖液中，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的產物；4)采用普通方法割膠純化差異表達基因片段，與T質粒載體連接，轉入感受態細胞，對基因片段的序列進行測定和分析。
在步驟1所述的逆轉錄合成cDNA第一條鏈中，是在0.5mL的PCR管中加入如下反應體系1～3μg總RNA(或0.1～0.3μgmRNA)，10μM dT-RSL2μL，加無RNA酶雙蒸水至總體積12μL，混合均勻；70℃孵育2min，再在冰上冷卻2min；往管中加入如下反應體系5×RTbuffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2μL，200u/uL MMLV逆轉錄酶(或其它逆轉錄酶)1μL，混合均勻；42℃孵育90min，再在94℃變性2min；合成的cDNA第一條鏈用無DNA酶雙蒸水稀釋10倍，置于-20℃備用。
在步驟2所述的PCR擴增中，是在PCR管中加入20μL如下反應體系10×PCR buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM dT-RSL1μL，10μM RSL隨機引物1μL，5U/uLTaq DNA聚合酶0.1～0.2μL，cDNA1～3μL，加無DNA酶雙蒸水至總體積20μL，混合均勻；PCR擴增循環參數為94℃ 5min，50℃ 3～5min，72℃ 1～2min，1個循環；94℃40s，65℃40s，72℃40s，35～40個循環；72℃，5min。
在步驟3中，所述的擴增產物取5uL，上樣緩沖液取1μL。
本發明具有重復性高、假陽性低、快速實惠和獲得的基因片段較長等優點，特別有利于在非模式生物中的快速特異擴增差異表達基因長片段。
具體實施例方式
實施例1dT-RSL引物序列為5’-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTT TTT TTT TTT TTTTTT TTTT-3’RSL3隨機引物序列為5’AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTI III ICC GGA GGATG-3’分別從對照組和副溶血弧菌誘導4h、1天和2天的大黃魚肝臟中提取總RNA，每一時相各取1μg RNA等量混合后分為對照組和實驗組總RNA。
1.逆轉錄合成cDNA第一條鏈1)分別在兩個0.5mL的PCR管中，加入如下反應體系3μg總RNA(對照組或實驗組)，10μM dT-RSL2μL，加無RNA酶雙蒸水至總體積12μL，混合均勻。
2)70℃孵育2min，再在冰上冷卻2min。
3)往兩個管中分別加入如下反應體系5×RT buffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2μL，200u/uL MMLV逆轉錄酶(或其它逆轉錄酶)1μL，混合均勻。
4)42℃孵育90min，再在94℃變性2min。
5)合成的對照組和實驗組的cDNA第一條鏈分別用無DNA酶雙蒸水稀釋10倍，置于-20℃備用。
2.PCR擴增及其結果的檢測1)分別在兩個0.5mL的PCR管中，加入20μL如下反應體系10×PCR buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM dT-RSL1μL，10μM RSL3隨機引物1μL，5U/uL Taq DNA聚合酶0.1μL，cDNA(對照組或實驗組)1μL，加無DNA酶雙蒸水至總體積20μL，混合均勻。
2)PCR擴增循環參數為94℃ 5min，50℃ 3min，72℃ 2min，1個循環；94℃ 40s，65℃40s，72℃40s，35個循環；72℃，5min。
3)分別取對照組或實驗組5uL擴增產物溶解于1μL上樣緩沖液中，用2.0％的瓊脂糖凝膠電泳30min，電壓5V/cm，凝膠中加入0.5ug/ml溴化乙錠。在紫外燈下觀察經過電泳后的凝膠，在1350bp左右處對照組有一條比實驗組亮的條帶。
3.割膠純化基因片段使用QIAEX膠回收試劑盒，具體步驟如下1)用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，在紫外燈下將所要的DNA目的片段用無菌刀片割下來，稱重。
2)以3∶1的比例加入Buffer QX1。
3)先將QIAEX II用振蕩器振蕩30s，再往樣品中加入30μL，混勻。
4)50℃水浴10min，以使瓊脂糖溶解，每隔2min拿出振蕩5s。
5)10000g離心1min，小心移出上清液。
6)用500μL的Buffer QX1洗滌。
7)再用Buffer PE洗滌兩次。
8)將沉淀晾干10min。
9)加入20μLddH2O，振蕩使其溶解。在室溫下放置5min。
10)10000g離心1min，小心將上清液移到新管中。
4.與質粒載體連接往管中加入以下反應體系按1∶5的比例加入PMD18-T質粒和純化好的基因片段，加ddH2O至5μL，再加入5μL ligation mix(TaKaRa)?；靹蚍磻w系，在16℃下連接反應1h。
5.感受態細胞的轉化及篩選將已轉入基因的質粒10μL加到200μL感受態大腸桿菌DH5α中，冰上放置30min。42℃熱激1min，冰上再放置2min。加入900μL LB液體培養基，37℃振蕩(300r/min)1h。將40μL2％X-gal和14μL10％IPTG均勻涂布在含Amp(60μg/mL)LB培養基表面，再在培養基表面均勻涂布100μL細菌培養液，37℃培養過夜。挑具有白斑的單克隆于5mL LB(含60μg/mL Amp)液體培養基中擴大培養。
6.提取并檢測質粒用V-gene質粒提取試劑盒提取，具體步驟如下1)取2mL在LB培養基中培養過夜的菌液，12000g離心1min，棄盡上清。
2)用0.25mL已加入RNaseA1的S1溶液懸浮細菌沉淀，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊。
3)加0.25mLS2溶液，溫和并充分地上下翻轉混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不應超過5min。
4)加入0.4mL 4℃預冷的S3溶液，溫和并充分地上下翻轉混合均勻，直至形成緊實的凝集塊，室溫靜置2min。12000g離心5min。
5)吸取步驟4中的離心上清并轉移到DNA制備管(置于2mL離心管中)，3600rpm離心1min。
6)將制備管置回離心管，加0.5mL W1溶液，3600rpm離心1min，棄濾液。
7)將制備管置回離心管，加0.7mL W2溶液，3600rpm離心1min，以同樣的方法再用0.7mLW2溶液洗滌一次，棄濾液。
8)將制備管移入離心管中，12000g離心1min。
9)將制備管移至新的1.5mL離心管中，在DNA制備膜正中央加60μL水，室溫靜置1min。12000g離心1min洗脫DNA。
10)用紫外分光光度計檢測其含量。
7.檢測質粒插入片段在PCR管中，加入20μL如下反應體系10×buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM M13正向引物0.5μL，10μM M13反向引物0.5μL，5U/uLTaq DNA聚合酶0.2μL，15.9μL ddH2O，0.5μL模板DNA。
PCR擴增循環參數為95℃，1min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，30個循環；4℃，5min。用瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增的產物。
8.測序PCR及其純化用MegaBACE測序試劑盒，反應體系為模板DNA100ng，mix4μL，1ulM13正向引物2μL，加ddH2O至10μL。PCR擴增循環參數為95℃，20s；95℃ 15s，50℃ 20s，60℃ 90s，30個循環；4℃，5min。往PCR產物中加入28.5μL 100％乙醇和NH4Ac的混合物(27.5∶1)顛倒混勻，靜置10min，12000g離心15min，棄盡上清液；加入300μL 75％乙醇，12000g離心3min，棄盡上清液；將沉淀晾干5min后加入10μL loading solution。
9.全自動序列測定及分析用MegaBACE500毛細管自動DNA測序系統進行自動測序，獲得1個1360bp纖維蛋白原β鏈基因長片段的抗病候選基因，已有研究表明該基因的表達水平可受病原體感染誘導而提高，可能是參與機體免疫機能的重要基因。
權利要求
1.一種快速特異擴增差異表達基因長片段的方法，其特征在于其步驟為1)逆轉錄合成cDNA第一條鏈以總RNA或mRNA為模板，dT-RSL為引物，在逆轉錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈；2)PCR擴增第一條cDNA鏈經稀釋后，與dT-RSL引物和RSL隨機引物混合于PCR管中退火，進行一個PCR循環反應，合成第二條cDNA鏈，隨后將PCR反應體系中的dT-RSL和RSL隨機引物分別與cDNA第二條鏈特異結合，經PCR循環，擴增出特異的DNA片段；3)結果檢測取擴增產物溶解于上樣緩沖液中，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的產物；4)采用普通方法割膠純化差異表達基因片段，與T質粒載體連接，轉入感受態細胞，對基因片段的序列進行測定和分析。
2.如權利要求1所述的一種快速特異擴增差異表達基因長片段的方法，其特征在于在步驟1所述的逆轉錄合成cDNA第一條鏈中，是在0.5mL的PCR管中加入如下反應體系1～3μg總RNA或0.1～0.3μg mRNA，10μM dT-RSL2μL，加無RNA酶雙蒸水至總體積12μL，混合均勻；70℃孵育2min，再在冰上冷卻2min；往管中加入如下反應體系5×RT buffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2μL，200u/uL MMLV逆轉錄酶或其它逆轉錄酶1μL，混合均勻；42℃孵育90min，再在94℃變性2min；合成的cDNA第一條鏈用無DNA酶雙蒸水稀釋10倍，置于-20℃備用。
3.如權利要求1所述的一種快速特異擴增差異表達基因長片段的方法，其特征在于在步驟2所述的PCR擴增中，是在PCR管中加入20μL如下反應體系10×PCR buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM dT-RSL1μL，10μM RSL隨機引物1μL，5U/uL Taq DNA聚合酶0.1～0.2μL，cDNA1～3μL，加無DNA酶雙蒸水至總體積20μL，混合均勻；PCR擴增循環參數為94℃5min，50℃3～5min，72℃1～2min，1個循環；94℃40s，65℃40s，72℃40s，35～40個循環；72℃，5min。
4.如權利要求1所述的一種快速特異擴增差異表達基因長片段的方法，其特征在于在步驟3中，所述的擴增產物取5uL，上樣緩沖液取1μL。
全文摘要
一種快速特異擴增差異表達基因長片段的方法，涉及一種表達基因的克隆。提供一種重復性高、假陽性低、快速實惠和獲得的基因片段較長的快速特異擴增差異表達基因長片段的方法。步驟為以總RNA或mRNA為模板，dT－RSL為引物，在逆轉錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈；PCR擴增第一條cDNA鏈經稀釋后，與dT－RSL引物和RSL隨機引物混合于PCR管中退火，進行一個PCR循環反應，合成第二條cDNA鏈，隨后將PCR反應體系中的dT－RSL和RSL隨機引物分別與cDNA第二條鏈特異結合，經PCR循環，擴增出特異的DNA片段；取擴增產物溶解于上樣緩沖液中，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的產物。
文檔編號C12P19/34GK1995390SQ20061013524
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月24日 優先權日2006年11月24日
發明者王藝磊, 張子平, 謝芳靖 申請人:集美大學