專利名稱：一種快速構建差異表達基因文庫的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種快速構建差異表達基因文庫的方法。
背景技術：
抑制性消減雜交(suppressionsubtractive hybridization, SSH)技術是 1996年DiatchenkoL等設計出的以抑制性PCR和消減雜交技術為基礎的一種尋找差異表達基因的方法，具有穩定、靈敏等特點，是目前最具應用前景的研究工具之一，在新基因的分離鑒定中顯示了重要的價值，得 到了廣泛的應用。但此技術存在以下缺陷:①富集的cDNA片段克隆時仍有 10-40% 左右的假陽性(Gurskaya NG, Diatchenko L, Chenchik A., et al.Equalizing cDNA subtraction based on selective suppression of polymerase chainreaction: cloning of Jurkat cell transcripts induced by phytohemaglutinin andphorbol 12-myristate 13-acetate.Anal Biochem.1996 ； 1: 90-97) !②雖然該法富集了差異表達基因，但是一些基因被多次重復克隆、檢測，導致庫容“虛增”;③該法無法預知多大的文庫庫容可以包含所有的差異基因，使檢測到的表達基因偏少；④此法操作步驟多且成本偏高，普通實驗室無力進行。上述原因導致對基因文庫的分析極易出現誤差，也限制了此技術的更廣泛應用(曾勇，陸承平.cDNA微陣列結合抑制性差減雜交研究對蝦白斑綜合癥病毒部分表達基因.病毒學報.2004;3:255-260)。因此，完善SSH技術，消除上述缺陷，為新基因的發現與功能研究提供更為完美、可靠的技術支持具有重要的科學意義。
變性梯度凝膠電泳技術(DGGE, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)通過核酸片段在變性條件下不同程度解鏈，從而導致這些片段在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速率不同以此來顯示核酸片段多樣性的技術。DGGE技術具有如下優點:①雙鏈DNA在變性梯度凝膠(變性劑濃度從小到大)的泳動過程中，其解鏈的速度和程度與其序列密切相關，在恰當的條件下，只要有一個堿基對的差異即可相互分開，應用“GC夾板”技術還可使大于500bp的DNA片段檢出率提高到100%，能得到幾乎所有微生物DNA多樣性的信息，在微生物生態學的研究中得到了廣泛的應用；②更為可貴的是，電泳凝膠上的條帶可以在回收后直接測序，由于能檢測出有差異的條帶，不會出現重復測序以及漏檢現象，從而能夠構建“精確基因文庫”;③由于取消了 PCR產物克隆程序，也就不會出現因克隆而導致假陽性的現象；④實驗成本大幅度降低。但由于DGGE技術“能檢異而不富異、不消同”，不能檢測出某些豐度低于1%的基因，而恰恰這些豐度低于1%的基因往往就是關鍵的功能基因，由于未能得到“富集”而得不到檢測，使其未能在構建差異表達基因文庫中得到應用。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的是提供一種快速構建差異表達基因文庫的方法，以克服現有技術的上述缺點，從而為尋找差異表達基因提供科學的依據和指導作用。
為達到上述目的，本發明提供如下技術方案:
一種快速構建差異表達基因文庫的方法，包括如下步驟:
a.提取感染鵝細小病毒和未感染鵝細小病毒鵝法氏囊的總mRNA；
b.利用步驟a所得總mRNA合成雙鏈cDNA，然后進行酶切消化，得酶切消化的雙鏈cDNA ；
c.將步驟b所得酶切消化的雙鏈cDNA分為2管，分別添加不同的接頭進行連接，得加有接頭的雙鏈cDNA ；
d.將步驟c所得加有接頭的雙鏈cDNA先進行正向消減雜交，然后將正向消減雜交產物進行反向消減雜交，得反向消減雜交產物；
e.以步驟d所得反向消減雜交產物進行第一次PCR擴增，然后將擴增產物稀釋，并以稀釋液為模板進行第2次PCR擴增；
f.將步驟e中第2次PCR擴增的產物進行變性梯度凝膠電泳，電泳后進行染色，得鵝細小病毒脅迫法氏囊差異表達基因文庫。優選的,所述步驟b是利用步驟a所得總mRNA加入隨機弓I物,先合成第一鏈cDNA,然后合成第二鏈cDNA，然后用Rsa I進行酶切消化，得酶切消化的雙鏈cDNA。優選的，所述步驟c中，所述不同接頭分別為接頭I和接頭2，所述接頭I為5’_ctaatacgactcactatagggctcgagcggccgcccgggcaggt-3，和 3，-ggcccgtcca-5，，所述接頭 2 為5，_ctaatacga ctcactatagggcagcgtggtcgcggccgaggt_3，矛口 3，_gccggctcca_5，。優選的，所述步驟d中，所述正向消減雜交為分別取加有接頭的雙鏈cDNA，然后分別加入酶切消化的雙鏈cDNA和雜交緩沖液，先在95-98°C條件下變性，再于65_68°C雜交8小時。優選的，所述步驟d中，所述反向消減雜交為將獲得的正向消減雜交產物混合，然后加入變性的加有接頭的雙鏈cDNA，在65-68°C條件下過夜雜交。優選的，所述步驟e中，所述第一次PCR擴增的引物為5’ -ctaatacgactcactatagggc-S’。優選的，所述步驟e中，所述第二次PCR擴增是將第一次擴增產物稀釋10倍作為模板，上游引物為5’ -tcgagcggccgcccgggcaggt-3’，下游引物為5， _agcgtggtcgcggccgaggt_3，。更優選的，所述變性梯度凝膠電泳為配制質量分數為6-8%的丙烯酰氨、變性梯度范圍為質量分數25%-45%的變性梯度膠，將步驟e所得第二次PCR產物分別加入不同泳道，先在150V條件下電泳15分鐘，再在120V條件下電泳7小時，然后銀染顯色。本發明的有益效果在于:本發明利用變性梯度凝膠電泳技術取代抑制性消減雜交中引起假陽性等技術缺陷的克隆步驟，將其應用于差異表達基因文庫的快速構建，更適合于差異表達基因文庫的快速構建。應用本發明公開的方法具有“消同富異”的作用，直接對富集了成百上千倍的差異基因，然后將兩次擴增的PCR產物進行DGGE檢測，將得到的條帶測序后構建差異表達基因文庫，既簡化了操作程序，降低了實驗誤差和實驗成本，又因不用克隆而徹底消除了 SSH假陽性現象的發生，還因為能電泳檢測出有多少條差異性條帶而精確知道基因文庫的庫容，為新基因的發現與功能研究提供更為完美、可靠的技術支持。


圖1為構建的差異表達基因文庫(I為皮下攻毒組鵝細小病毒脅迫法氏囊差異表達基因條帶；2為口服攻毒組鵝細小病毒脅迫法氏囊差異表達基因條帶；3為滴鼻攻毒組鵝細小病毒脅迫法氏囊差異表達基因條帶；4為陰性對照組鵝細小病毒脅迫法氏囊差異表達基因條帶；5為皮下攻毒對照組鵝細小病毒脅迫法氏囊差異表達基因條帶；6為口服攻毒對照組鵝細小病毒脅迫法氏囊差異表達基因條帶；7為滴鼻攻毒對照組鵝細小病毒脅迫法氏囊差異表達基因條帶；M為Marker)。
具體實施例方式下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。1、免克隆抑制性消減雜交(ACSSH)試劑:隨機引物、5XFirst_strand Buffer(第一鏈緩沖液)、連接緩沖液、雜交緩沖液、Taq聚合酶緩沖液、Second-strand EnzymeCocktail (第二鏈合成酶)、5X Second-strand Buffer (第二鏈緩沖液)、dNTPs、ddH20、AMV逆轉錄酶、T4 DNA聚合酶、EDTA/Glycogen Mix (EDTA/糖混合液)、苯酚:氯仿:異戊醇為25:24:1 (體積比)、Rsa I 酶、Rsa 緩沖液、T4 DNA 連接酶、Testerl-1 (轉錄物 l)、Testerl_2(轉錄物 2)、Adaptorl (接頭 I)、Adaptor2 (接頭 2)、5XLigation Buffer (連接緩沖液)、Ligation master mix (連接反應液)和Taq DNA聚合酶，以上試劑均購自上海生工生物工程科技有限公司。 2、變性梯度凝膠(DGGE)試劑:質量分數為40%聚丙烯酰胺貯存液、0%變性梯度凝膠、質量分數為80%變性梯度凝膠、硝酸銀染色液、固定終止液(含體積分數為10%乙醇、體積分數為0.5%冰乙酸的溶液)、顯影液(12g氫氧化鈉溶解于400 mL超純水中，4°C冰箱冷卻約2h,臨用前加入2 mL 37%甲醒)、DGGE loading buffer (溴苯酌.藍0.05g,甲醇0.05g,1XTAE10.00 mL).一種快速構建差異表達基因文庫的方法，具體步驟為:
a、提取細胞總mRNA
取140只7日齡無鵝細小病毒(GPV)的雛鵝飼養在SPF動物飼養房，隨機分為7組，第一組、第二組和第三組分別為皮下、口服和滴鼻攻毒取樣組，每組30只，其中20只為攻毒鵝，10只為同居鵝，攻毒劑量為強毒GPV每只0.1mL ;第四組為陰性對照組(健康對照組)20只，隔離飼養；第五組、第六組和第七組每組10只，分別為皮下、口服和滴鼻感染陽性對照組；攻毒后于24小時、48小時、72小時和6天后采樣，攻毒組、同居組和健康對照組每次采3只，采集法氏囊于_80°C保存備用，攻毒后隨時觀察臨床癥狀和死亡鵝解剖變化。取所有法氏囊樣本并分別提取細胞總RNA,提取步驟按照RNeasy plus Mini Kit說明書進行(該試劑盒購自QIAGEN公司)，所提RNA經紫外分光光度計進行濃度測定，然后將總RNA稀釋至DNA OD260/OD280在1.6-2.0范圍內，其濃度在IO-1OOng/ μ L范圍內。、獲得雙鏈cDNA ①cDNA第一鏈的合成
I)在0.5mL經DEPC處理過的離心管中分別加入攻毒組(tester )和陰性對照組(driver)的mRNA各2Pg，然后加入 μ (10μΜ)隨機引物，70°C溫浴2min，迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物:5 X First-strand Buffer2M-L ；
dNTPs (IOmM) μ ；
ddH20I μ ；
AMV 逆轉錄酶(20U/>L)Ιμ ；
2)42°C反應1.5小時,然后將離心管置于冰上,終止cDNA第一鏈的合成,然后馬上進行第二鏈的合成。②cDNA第二鏈的合成
1)在已經合成好cDNA第一鏈的離心管中加入如下反應物: ddH2048.4μ ；
5 X Second-strand Buffer16.0M-L ；
dNTPs (IOmM)1.6μ ；
20XSecond-strand Enzyme Cocktail4.0M-L ；
2)加入2μ (6U)T4 DNA Polymerase，13_16°C反應 30min。3)加入 20XEDTA/Glycogen Mix 4μ ,以終止反應。4)加入100μ 苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)(體積比)抽提，然后加入100μ 濃度為3 mo I/L的醋酸銨和IOOPL體積分數為95%的乙醇進行沉淀，沉淀出cDNA雙鏈，經3000r/min離心20 min后 去上清,沉淀用體積分數為80%乙醇進行洗漆，自然干燥10 min后加入50μ 滅菌去離子水溶解，置于-20°C備用。③cDNA的酶切消化
1)將步驟②制備的雙鏈cDNA經35-37°C過夜酶切，酶切體系為: cDNA 雙鏈43.5μ ；
IOXRsa Restriction Buffer5.Ομ ；
Rsa I (lOU/μυ1.5μ ；
2)每管用2.5μ EDTA/Glycogen混合物終止反應。3)加入50μ 苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)(體積比)抽提，上清置于1.5 mL離心管中加入100μ 濃度為3 mol/L的醋酸銨和100μ 體積分數為95%的乙醇沉淀，而后經體積分數為80%的乙醇洗滌后自然干燥10 min,并沉淀出酶切后的雙鏈cDNA，溶解于5.5μ 雙蒸水中。、cDNA連接接頭
將步驟b酶切消化的雙鏈cDNA分為兩份，一份與接頭I連接，另一份與接頭2連接，其中接頭 I 的序列為 5，-ctaatacgactcactatagggctcgagcggccgcccgggcaggt-3’ (SEQ IDN0.1)和 3，-ggcccgtcca-5，(SEQ ID N0.2);接頭 2 的序列為 5，-ctaatacgactcactatagggcagcgtggtcgcggccgaggt-3，(SEQ ID N0.1)和 3，-gccggctcca-5，(SEQ ID N0.3)。具體步驟如下:
1)取IKL酶切的雙鏈cDNA用5PLddH20稀釋；
2)連接反應液(LigationMaster Mix)的制備如下: ddH20 3μ ；
5 X Ligation Buffer2 ；
T4 DNA連接酶WL ；3)在兩個EP管中分別加入如下試劑
權利要求
1.一種快速構建差異表達基因文庫的方法，其特征在于，包括如下步驟: a.提取感染鵝細小病毒和未感染鵝細小病毒鵝法氏囊的總mRNA； b.利用步驟a所得總mRNA合成雙鏈cDNA，然后進行酶切消化，得酶切消化的雙鏈cDNA ； c.將步驟b所得酶切消化的雙鏈cDNA分為2管，分別添加不同的接頭進行連接，得加有接頭的雙鏈cDNA ； d.將步驟c所得加有不同接頭的雙鏈cDNA分別先進行正向消減雜交，然后將正向消減雜交產物進行反向消減雜交，得反向消減雜交產物； e.以步驟d所得反向消減雜交產物進行第一次PCR擴增，然后將擴增產物稀釋，并以稀釋液為模板進行第2次PCR擴增； f.將步驟e中第2次PCR擴增的產物進行變性梯度凝膠電泳，電泳后進行染色，得鵝細小病毒脅迫法氏囊差異表達基因文庫。
2.根據權利要求1所述一種快速構建差異表達基因文庫的方法，其特征在于:所述步驟b是利用步驟a所得總mRNA加入隨機引物，先合成第一鏈cDNA，然后合成第二鏈cDNA，然后用Rsa I進行酶切消化，得酶切消化的雙鏈cDNA。
3.根據權利要求1所述一種快速構建差異表達基因文庫的方法，其特征在于:所述步驟c中，所述不同接頭分別為接頭I和接頭2，所述接頭I如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，所述接頭2如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3所示。
4.根據權利要求1所述一種快速構建差異表達基因文庫的方法，其特征在于:所述步驟d中，所述正向消減雜交為分別取加有接頭的雙鏈cDNA，然后分別加入酶切消化的雙鏈cDNA和雜交緩沖液，先 在95-98°C條件下變性，再于65-68°C雜交8小時。
5.根據權利要求1所述一種快速構建差異表達基因文庫的方法，其特征在于:所述步驟d中，所述反向消減雜交為將獲得的正向消減雜交產物混合，然后加入變性的加有接頭的雙鏈cDNA，在65-68°C條件下過夜雜交，再加入稀釋液后在65_68°C條件下保溫7分鐘。
6.根據權利要求1所述一種快速構建差異表達基因文庫的方法，其特征在于:所述步驟e中，所述第一次PCR擴增的引物如SEQ ID N0.4所示。
7.根據權利要求1所述一種快速構建差異表達基因文庫的方法，其特征在于:所述步驟e中，所述第二次PCR擴增是將第一次擴增產物稀釋10倍作為模板，上游引物如SEQ IDN0.5所示，下游引物如SEQ ID N0.6所示。
8.根據權利要求1-7任一項所述一種快速構建差異表達基因文庫的方法，其特征于:所述變性梯度凝膠電泳為配制質量分數為6-8%的丙烯酰氨、變性梯度范圍為質量分數25%-45%的變性梯度膠，將步驟e所得第二次PCR產物分別加入不同泳道，先在150V條件下電泳15分鐘，再在120V條件下電泳7小時，然后銀染顯色。
全文摘要
本發明公開了一種快速構建差異表達基因文庫的方法，包括如下步驟先提取感染鵝細小病毒和未感染鵝細小病毒鵝法氏囊的總mRNA；利用獲得的mRNA合成雙鏈cDNA進行酶切消化，然后分為2管，分別添加不同的接頭進行連接；將加有接頭的雙鏈cDNA先進行正向消減雜交，然后將正向消減雜交產物進行反向消減雜交，反向消減雜交后再進行第一次PCR擴增，將擴增產物稀釋后，以稀釋液為模板進行第2次PCR擴增；最后將第2次PCR擴增的產物進行變性梯度凝膠電泳，電泳后進行染色，得鵝細小病毒脅迫法氏囊的差異表達基因文庫；利用本發明的方法構建的基因文庫無假陽性，并且具有速度快、靈敏度高、特異性強、成本低廉，操作方便等特點。
文檔編號C40B50/06GK103114086SQ20131005240
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月18日 優先權日2013年2月18日
發明者楊金龍, 劉作華, 黃勇, 張素輝, 楊睿, 張邑帆, 鄭華, 李成洪, 楊晶旭 申請人:重慶市畜牧科學院, 楊晶旭