專利名稱：應用固化了超過25個堿基的標簽的陣列SuperSAGE－Array的基因表達分析的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因表達分析。更詳細而言，本發明涉及一種再現性高的高通量基因表達分析方法，它應用固化了超過25個堿基的改良的SAGE標簽的微陣列(microarray)。
背景技術：
象微陣列、SAGE法這樣的基因轉錄產物分析是各種生物學研究中不可缺少的技術。微陣列可以一次進行多個基因表達的分析或多個樣本的分析。但是，微陣列只能對點到陣列上的基因進行表達分析，為了進行廣泛的分析，有必要制備點了所有相關基因的陣列。對于水稻、擬南芥(Arabidopsis thaliana)等模型生物中，均有商品化的、包含了其所有基因的cDNA微陣列和寡核苷酸陣列用于研究。但是，對于其它多種生物，研究者必須自行從cDNA文庫設計陣列，這既費時又費錢。
相反，SAGETM(Serial Analysis of Gene Expression)法是一種能進行新基因研究和進行定量表達分析的技術(參照非專利文獻1)。該方法是基于轉錄產物3’側最近的限制性酶切位點(CATG)下游10-11bp的序列，對基因進行鑒定、分析其表達量。因此，通過用DNA測序儀對3’末端附近的序列進行測序，可進行包含未知基因的廣泛的基因表達分析。但是，SAGETM實驗步驟多，實質上不適于進行多樣本同時分析。此外，SAGETM標簽僅14個堿基序列，在LongSAGETM(參照非專利文獻2)中也只有21個堿基序列的標簽，因其太短不足以進行確定的基因鑒定，所以目前為止其應用僅限于模型生物。
最近，本發明的發明人改良SAGETM開發了SuperSAGE(參照專利文獻1和非專利文獻3～7)。在SuperSAGE中，應用EcoP15I這一III型限制性酶可獲得26個堿基序列的標簽。SuperSAGE中，通過應用該26個堿基序列的標簽，基因鑒定的精確性顯著提高。在宿主和病原體中可同時進行基因表達分析，也可用于沒有DNA數據庫的非模型生物。
專利文獻1WO2004/099445號公報非專利文獻1Velculescu et al.，Science 270484-487，1995.
非專利文獻2Saha et al.Nature Biotechnology 20508-512，200非專利文獻3Gene expression analysis of plant host-pathogen interactionsby SuperSAGE Matsumura，H.，Reich，S.，Ito，A.，Saitoh，H.，Kamoun，S.，Winter，P.，Kahl，G.，Reuter，M.，Krueger，D.，and Terauchi R.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10015718-15723.
非專利文獻4Molekulares Wechselspiel von Wirt und PathogenSimultane，genomweite Transkriptprolilierung zweier Organismen mit SuperSAGE.Kahl，G.，Winter，P.，Matsumura，H.，Reuter，M.，Kruger，D.and Terauchi R.(2004)Biospektrum 10511-513.
非專利文獻5SuperSAGE.Matsumra，H.，Ito，A.，Saitoh，H.，Winter，P.，Kahl，G.，Reuter，M.，Krueger，D.H.and Terauchi，R.(2005)Cellular Microbiology(2005)711-18.
非專利文獻6SuperSAGE，a potent transcriptome tool for eukaryoteic OrganismsMatsumura，H.，Reich，S.，Reuter，M.，Krueger，D.H.，Winter，P.，Kahl，G.and Terauchi R.InS.-M.WANG(ed.)SAGECurrent Technologies and Applications.Horizon Scientific Press(2004)77-90.
發明公開發明預解決的問題本發明的目的是提供一種基因分析方法，它能對尚未進行基因組分析的生物進行廣泛的基因表達分析和多樣本的同時分析。
解決問題的手段為了解決上述課題，發明者們對SuperSAGE的26個堿基序列標簽(SuperSAGE標簽)作為微陣列探針應用的可能性進行了研究。結果發現，應用固化了SuperSAGE標簽的陣列，通過一次雜交可獲得與原來的SAGETM同樣的基因表達分析結果。此外，還發現了下述出人意料的效果，即通過固化SuperSAGE標簽，對于沒有完備的EST序列和cDNA序列、基因組序列的非模型生物，微陣列的制備非常容易。
也就是說，本發明涉及固相化材料以及應用該固相化材料進行基因表達分析的方法，所述固相化材料中固化了多個由識別表達基因的超過25個堿基長度的寡核苷酸構成的標簽，標簽的3’末端由III型限制性酶的酶切位點限定，且其5’末端由該基因的cDNA上最接近3’側的其它限制性酶的酶切位點限定。
本發明的標簽(SuperSAGE標簽)可根據發明者們提出的SuperSAGE(WO2004/099445號)確定。具體而言，通過以下步驟進行1)應用包含III型限制性酶識別序列和oligo dT序列的引物，從表達基因的mRNA合成cDNA庫，然后用其它限制性酶處理該cDNA庫；2)從上述cDNA庫純化含PolyA序列的片段，將該片段與接頭A或接頭B連接；3)用III型限制性酶處理上述片段，連接所得包含接頭A的片段和包含接頭B的片段；4)用步驟1)中所述的其它限制性酶酶切上述連接片段以除去接頭序列，獲得雙標簽寡核苷酸；5)連接各雙標簽寡核苷酸制備多聚核苷酸；6)分析上述多聚核苷酸的堿基序列，確定該多聚核苷酸中所含標簽的堿基序列。
本發明中應用的III型限制性酶的例子在網頁http://rebase.neb.com/cgi-bin/azlist？re3中公開，例如包括EcoPI和EcoP15I。
其它限制性酶(均為商品化的)包括如下所示限制性酶。
識別序列酶(僅限于可商購產品)CATG ^NlaIII，Hsp92II，^CATG FatIC^TAG BfaI，MaeI，XspIA^CGT HpyCH4IV，MaeII，ACGT ^TaiI，TscIAG^CT AluIT^CGA TaqI^GATC BfuCI，Bsp143I，BstENII，DpnII，Kzo9I，MboI，NdeII，Sau3AIGAT^C BstKTI，G^TAC Csp6I作為一優選的例子，本實施例中特別應用EcoP15I和NlaIII。應用EcoP15I和NlaIII時，適用于前述接頭A和接頭B，它們是互不相同的雙鏈DNA，由以下第一鏈DNA(1)和第二鏈DNA(2)退火而獲得。
DNA(1)5’-N30-40-CAGCAGCATG-3’DNA(2)3’-N30-40-GTCGTC-5’這里，(1)和(2)的N30-40是互補的、任意的30～40個核苷酸序列，DNA(1)的5’末端可被標記，DNA(2)的3’末端可進行氨基酸修飾。
本發明的固相化材料，可以通過在固相上合成標簽寡核苷酸進行制備；也可將預先合成好的標簽寡核苷酸固化到固相上進行制備。
發明效果即使在尚未進行基因組分析的生物中，應用本發明也可以簡便地進行廣泛的基因表達分析和多樣本的同時分析。因此，本發明解決了傳統的微陣列和SAGETM中存在的問題，使未知、已知基因的廣泛分析成為可能。
發明的最佳實施方式本發明涉及應用固化了通過SuperSAGE獲得的、超過25個堿基的標簽寡核苷酸的固相化材料，進行各種生物基因表達分析的方法。本發明中應用的固相化材料(陣列)，是融合了SuperSAGE和微陣列技術而制備成的，本說明書中稱之為SuperSAGE-Array(圖2)。以下，對該SuperSAGE-Array的制備方法、應用它的基因表達分析方法進行詳細說明。
1.SuperSAGE標簽的制備首先，參照

圖1說明利用本發明者們開發的SuperSAGE法確定用于鑒定目的生物中各基因的、超過25個堿基的標簽(SuperSAGE標簽)的方法。這里所應用的SuperSAGE方法在下述文獻中有詳細描述Matsumura，H.，et al.，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10015718-15723；Kahl，G.et al.，(2004)Biospektrum 10511-513；Matsumra，H.etal.，(2005)Cellular Microbiology(2005)711-18；Matsumura，H.et al.，Current Technologies and Applications.Horizon Scientific Press(2004)77-90及WO2004/099445號公報。
首先，按照常規方法從目的生物的樣品中提取總RNA和mRNA，以此為模板，應用生物素化的oligo dT引物(逆轉錄引物)合成cDNA。該逆轉錄引物包括18～25個堿基和一個EcoP15I酶的識別序列5′-CAGCAG-3′和隨后的15-25mer的dT(圖1，步驟1)。該類型的III型限制性修飾酶EcoP15I識別靶DNA分子中非甲基化的、反方向開始的一對CAGCAG序列，切割距識別序列3′末端25-28個堿基的位點。
用識別CATG的限制性酶NlaIII消化合成的cDNA，用包被有鏈霉抗生素蛋白的磁石僅回收包含生物素化的逆轉錄引物序列的消化片段(圖1，步驟2、3)。
接下來，將2種接頭接頭A與接頭B(均為46個堿基)與被磁石捕獲的cDNA片段結合。這些接頭包含一個EcoP15I酶的識別序列CAGCAG(圖1，步驟4)。
所得cDNA庫分為2份，一半與接頭A結合，另一半與接頭B結合，作為“接頭A結合的cDNA”和“接頭B結合的cDNA”。
對于“接頭A結合的cDNA”和“接頭B結合的cDNA”，均用EcoP15I消化與磁石結合的DNA片段后，去除磁石(圖1，步驟5)。消化后的片段，一種是包含接頭和27-28個堿基標簽序列的片段(全長69-70個堿基)，另一種是雙鏈cDNA片段中包含的各種大小的片段。包含polyA的片段一直與磁石結合，與其后的處理無關。
包含接頭和27-28個堿基標簽序列的69-70個堿基的片段，在UV照射下，通過FITC熒光可觀察到，從膠中切出后，可通過聚丙烯酰胺凝膠進行分離。
使分別由接頭A結合的cDNA和接頭B結合的cDNA產生的69-70個堿基的片段(標簽接頭片段)，通過3′填補反應使其形成平末端，相互結合形成“雙標簽”。由于接頭片段的3′末端經氨基酸修飾被封閉，所以該結合僅在cDNA的標簽序列間發生(圖1，步驟6、7)。
通過PCR擴增所得“雙標簽”分子(圖1，步驟8)。PCR的引物由接頭序列構建，PCR產物的大小約97個堿基。
用NlaIII消化該97個堿基的PCR產物(圖1，步驟10)，形成約52個堿基的“雙標簽”片段。從膠中回收該片段，進行純化。
通過連接反應對“雙標簽”片段進行進一步連接(圖1，步驟11)，形成多聯體。該連接的多聯體進行瓊脂糖凝膠電泳，從膠中回收大約500個堿基以上長度的片段。
對根據大小分離的多聯體片段進行SphI處理和CIP處理，克隆到適當的質粒載體中(圖1，步驟12)，用該質粒轉化Ecoli(圖1，步驟13)。
接下來，通過PCR擴增插入到質粒中的片段(圖1，步驟14)。
直接從PCR產物讀取堿基序列(圖1，步驟15)。約44個堿基的雙標簽，其兩端有NlaIII的識別序列CATG。有關這大約52(44+8)個堿基序列的信息表明它們分別是由cDNA特定區域分離出來的2個26-28個堿基的標簽序列。
通過對多個克隆的堿基序列進行測序，獲得表1～5所示的各種生物來源的SuperSAGE標簽序列。
2.標簽固化-SuperSAGE-Array的制備在所得SuperSAGE標簽的序列信息的基礎上，合成寡核苷酸，固化到適當的固相材料上，制備成固相化材料(SuperSAGE-Array等)。固相化材料不限于微陣列，可以是珠(beads)陣列、濾膜、毛細管等任何一種。探針的合成過程中，為了提高固化到基板上的效率，可使用5’端標記了巰基等功能團的引物，也可將所需的功能團導入該探針的末端。
對將探針固化到基板上的方法無特殊限定，既可在玻璃、金屬、硅膠等基板上直接合成寡核苷酸(Affymetrix型)，也可將已經合成的寡核苷酸結合到基板上(標準型)，也可將探針固化到尼龍、硝酸纖維素等濾膜上。尤其是，由于玻璃等基板有效固定面積小，所帶電荷少，所以為了提高探針的固化效率，優選用多聚硅烷、硅烷、多聚碳化二亞胺、氨基硅烷等預先將表面進行處理。或者，優選應用象這樣經過表面處理的商品化的多聚硅烷化的玻璃、硅烷化的玻璃。
已經合成的探針向基板上的固定，通常應用點陣儀自動進行。為了比較探針的信息與從探針所得信號，優選掌握各基因的固定位置。對探針的固定位置無特殊限定，只要能進行上述比較即可。
3.用SuperSAGE-Array進行基因表達分析按照常規方法，從樣品中提取總RNA，制備出mRNA或cDNA。在從樣品制備mRNA或cDNA的階段，目的物預先用適當的熒光試劑(如Cy3-UDP、Cy5-UDP)等進行標記。該目的物與前面所講固化了探針的基板進行雜交，洗滌后，檢測從各探針的固定位置發出的熒光強度(信號強度)。用掃描儀讀取的熒光強度，必要時，可進行誤差調整和樣品間差異的標準化。標準化可以管家基因等在各樣品同等表達的基因為基準進行。也可確定可信度基線(limit lane)，除去相關性低的數據。
4.SuperSAGE-Array的利用應用本發明的固相化材料(SuperSAGE-Array)進行的基因表達分析，可成為一項對所有真核生物廣泛基因表達分析有用的和基礎的技術。現在可利用的微陣列大多依賴于EST和cDNA、基因組序列。獲得非冗余的cDNA序列對于陣列的制備是必要的，因此標準化的或表現2個樣品間基因表達差異的cDNA文庫的制備是必要的。本發明的固相化材料(SuperSAGE-Array)，可成為一項制備這些陣列的重要技術。
根據本發明，可在比大規模EST分析較短的時間內獲得大量的表達基因信息。此外，本發明中應用的SuperSAGE標簽是在外顯子的特定位置獲得的，所以對于每個基因都沒有重復。利用該特性，可容易地制備所有組織中在預期的條件下表達的基因的寡核苷酸。
例如，來源于各種癌組織的SuperSAGE-Array對于臨床檢查有用，SuperSAGE-Array也可用于所有真核生物。如果發現感興趣的表達模式的標簽，通過應用26個堿基序列的標簽的3’RACE法可獲得部分cDNA片段。應用RACE產物進行BLAST檢索，可鑒定該標簽所代表的基因。
宿主生物和病原體的基因的微陣列可用于宿主-病原體相互作用分析的研究。應用SuperSAGE-Array也可很容易地制備這樣的陣列。對于病原體感染的組織，通過進行SuperSAGE，可簡便制備攜載宿主與病原體基因的陣列。應用這樣的陣列，可高通量地進行宿主與病原體在感染后的基因表達的變化分析。
實施例以下，通過實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明并不限定于實施例。
實施例11.材料與方法1)RNA的制備對于水稻的SuperSAGE與Oligoarray，準備水稻葉(品種ヤシロモチ)和懸浮培養的細胞(品種かけはし)。應用mRNA PurificationKit(Amersham Pharmacia)從播種后1個月的水稻(品種かけはし)和培養細胞(品種かけはし)提取mRNA，用于Oligoarray。
對于Nicotiana benthamiana的SuperSAGE與Oligoarray，準備注入了包含下述質粒的土壤桿菌的葉。注入土壤桿菌2日后，用地塞米松(DEX)處理Nicotiana benthamiana葉子，4小時后，用mRNAPurification Kit(Amersham Pharmacia)提取mRNA。
2)質粒應用NbCD1(參照特開2005-278634號)與NbCD3cDNA(參照特開2005-245251號)，它們是發明者以前分離出的。構建包含受控于GVG啟動子(Aoyama T.and Chua N.-H.，1997，The Plant Journal(1997)11605-612)的上述cDNA與GFP cDNA的二元(dinary)質粒，上述GVG啟動子通過糖皮質激素(地塞米松)的處理可特異性誘導基因表達。
3)SuperSAGE純化從水稻和Nicotiana benthamiana中提取出的RNA，獲得3～5μg的polyA RNA。按照已經發表的文獻(同上)進行polyA的SuperSAGE文庫的制備和數據的分析。
也就是說，以所得polyA RNA為模板，通過cDNA SynthesisSystem”(Invitrogen)生物素化的oligo dT引物(逆轉錄引物CTGATCTAGAGGTACCGGATCCCAGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(序列號8))，合成cDNA。該逆轉錄引物包含22個堿基與一個EcoP15I酶識別序列5′-CAGCAG-3′序列及隨后的19個dT。
用限制性酶NlaIII消化合成的cDNA，用包被有鏈霉抗生素蛋白的磁石僅回收包含生物素化的逆轉錄引物序列的消化片段。
接下來，將以下所示2種接頭接頭A與接頭B(均為46個堿基)與被磁石捕獲的cDNA片段的末端結合。這些接頭均包含一個EcoP15I酶的識別序列CAGCAG。
接頭A是以下兩個寡核苷酸相結合的雙鏈FITC-5’-TTTGGATTTGCTGGTGCAGTACAACTAGGCTTAATACAGCAGCATG-3’(序列號197)5’CTGCTGTATTAAGCCTAGTTGTACTGCACCAGCAAATCCAAA-3’NH2.(序列號198)接頭B是以下兩個寡核苷酸相結合的雙鏈FITC-5’-TTTCTGCTCGAATTCAAGCTTCTAACGATGTACGCAGCAGCATG-3’(序列號199)5’-CTGCTGCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAA-3’-NH2.(序列號200)
所得cDNA庫分為2份，一半與接頭A結合，另一半與接頭B結合，作為“接頭A結合的cDNA”和“接頭B結合的cDNA”。用EcoP15I消化它們，去除磁石，獲得包含接頭和27-28個堿基標簽序列的片段(全長69-70個堿基)，以及雙鏈cDNA片段中包含的各種大小的片段。包含polyA的片段一直與磁石結合，與其后的處理無關。
包含接頭和27-28個堿基標簽序列的69-70個堿基的片段，在UV照射下，通過FITC熒光可觀察到，從膠中切出后，可通過聚丙烯酰胺凝膠進行分離。
分別由接頭A結合的cDNA和接頭B結合的cDNA產生的69-70個堿基的片段(標簽接頭片段)，通過3′填補反應使其形成平末端，形成相互結合的“雙標簽”。
用含接頭序列的引物，通過PCR擴增所得“雙標簽”分子，獲得大小約97個堿基的PCR產物。用NlaIII消化該97個堿基的PCR產物，形成約52個堿基的“雙標簽”片段。從膠中回收該片段，進行純化。
通過連接反應對“雙標簽”片段進行進一步連接，獲得多聚核苷酸(多聯體)。該連接的多聯體進行瓊脂糖凝膠電泳，從膠中回收大約500個堿基以上長度的片段。
對根據大小分離的多聯體片段進行SphI處理和CIP處理，克隆到適當的質粒載體中，用該質粒轉化大腸桿菌。
接下來，通過PCR擴增插入到質粒中的片段。用測序儀分析該PCR產物的堿基序列。PCR產物是約52個堿基的雙標簽，其兩端有NlaIII的識別序列CATG。有關這大約52個堿基序列的信息表明它們分別是由cDNA特定區域分離出來的2個26個堿基的標簽序列。
通過對多個克隆的堿基序列進行測序，獲得表1～5所示的各種生物來源的SuperSAGE標簽序列。
4)寡核苷酸陣列分析利用NimbleGen公司的12孔陣列系統制備SuperSAGE-Array的制備。SuperSAGE-Array設計的詳細說明如下。從各組織制備20μg的總RNA，合成雙鏈cDNA后，通過體外轉錄，制成生物素標記的cDNA探針。用熒光素Cy3標記這些生物素化的探針。用這些標記的探針雜交后，用掃描儀讀取信號，按Robust Multi-chip Analysis(RMA)法使信號值的數據標準化。陣列的制作及雜交的實施委托ジ一ンフロンティア公司進行。
2.模型生物水稻的SuperSAGE-Array為了實際上檢驗SuperSAGE-Array的性能，最初用SuperSAGE法(WO2004/099445)分析水稻葉和培養細胞中轉錄產物情況。比較2個樣品間的26個堿基序列標簽(葉子是10968個標簽；培養細胞是10044個標簽)，選擇2個樣品間表達量相同的7種標簽、僅在葉中表達量多的20種標簽、僅在培養細胞中表達量多的14種標簽(表1)，制成寡核苷酸陣列。
表1來自水稻的SupcrSAGE標簽點到SupcrSAGE-Array上

如前所述，該SuperSAGE-Array是利用12孔陣列系統(NimbleGen Inc Co.)，在載玻片上直接合成26個堿基的寡核苷酸而制備成的。關于各標簽序列，也合成50％及25％的錯配序列(不同序列)，用于雜交的特異性檢驗。
接下來，從水稻的葉和培養細胞中提取總RNA，合成標記的cRNA，作為SuperSAGE-Array的雜交探針。圖3所示的7種表達量相同的基因的標簽，在陣列分析中同樣在2個樣品間可獲得相同程度的雜交信號。此外，20種葉中表達量多的標簽，實際上在葉的RNA中也顯現較強的雜交信號。在培養細胞中表達量多的14種標簽，其中11種標簽在培養細胞的RNA中獲得較強信號。
結果，90％以上(38/41)的基因(標簽)，其SuperSAGE與SuperSAGE-Array的結果一致。
3.非模型生物Nicotiana benthamiana的SuperSAGE-Array如前所述，SuperSAGE也適于在非模型生物中探索新基因。因此，為了顯示SuperSAGE在非模型生物中利用的可能性，應用26個堿基序列的SuperSAGE標簽制備基因組信息中不存在的Nicotianabenthamiana葉中過量表達外來基因時表達量變化的基因的微陣列。
NbCD1與NbCD3基因是以前從Nicotiana benthamiana中分離出來的基因，該基因編碼過量表達時誘導細胞死亡的蛋白質。首先，尋找分別過量表達上述兩基因時，表達量增加或減少的Nicotianabenthamiana基因。Nicotiana benthamiana葉中注入土壤桿菌，所述土壤桿菌攜有整合到糖皮質激素可誘導表達盒GVG中的NbCD1、NbCD3及GFP基因的質粒。注入2天后，用地塞米松(DEX)處理葉子，誘導導入的基因表達。DEX處理后4小時從葉中提取RNA，備用于SuperSAGE。通過SuperSAGE數據的比較，選擇NbCD1或NbCD3過量表達時其標簽數為GFP過量表達時4倍以上的標簽(表2～5)。
制備固化了所選擇出的標簽的SuperSAGE-Array。通過NbCD1和NbCD3過量表達所篩選出的表達量增減的所有154種標簽用于寡核苷酸陣列(表2～5)。
表2N.benthamiana葉中因NbCD1過表達而上調基因的SuperSAGE標簽

表3N.benthamiana葉中因NbCD1過表達而下調基因的SuperSAGE標簽

表4N.benthamiana葉中因NbCD3過表達而上調基因的SuperSAGE標簽

表5N.benthamiaha葉中因NbCD3過表達而下調基因的SuperSAGE標簽

從GFP、NbCD1、NbCD3過表達的葉中提取RNA用于陣列的雜交。各基因的過量表達處理、雜交，反復獨立進行3次。為了觀察各雜交間的再現性，標出2個陣列間各標簽與oligo雜交的信號值。可以看到，大多數的信號值在重復間有良好的相關性(R2＝0.9584～0.9863)。因此，利用SuperSAGE標簽的陣列可獲得再現性非常高的雜交結果(圖4)。
3次重復間各基因(標簽)的平均信號值示于表6～9。根據GFP過量表達葉與NbCD1或NbCD3過量表達葉的平均信號值的差，用Cluster and Tree View軟件進行分析，用色塊(カラ一タイル)標示基因表達的模式(圖5)。根據SuperSAGE分析的結果，將基因分為NbCD1過量表達時誘導(A)、抑制(B)，NbCD3過量表達時誘導(C)、抑制(D)。與對照GFP過量表達的葉相比，信號強時用紅色表示，信號弱時用綠色表示。從NbCD1U及NbCD3U開始的SuperSAGE標簽，在各基因過表達時，通常可觀察到比對照強的雜交信號。此外，許多表達低下的標簽(從NbCD1D及NbCD3D開始的SuperSAGE標簽)，其信號比對照弱。選擇其表達量有顯著性差異的基因，結果發現115種基因(陣列分析的基因的74％)在SuperSAGE與SuperSAGE-Array中表達模式相同(表10)。
表6在NbCD1過表達的N.benthamiana葉中下調基因的標準化雜交信號值(Log2)的均值

*s.e.三個重復間雜交信號值的標準誤差
表7在NbCD1過表達的N.benthamiana葉中上調基因的標準化雜交信號值(Log2)的均值

*s.e.三個重復間雜交信號值的標準誤差
表8在NbCD3過表達的N.benthamiana葉中上調基因的標準化雜交信號值(Log2)的均值

*s.e.三個重復間雜交信號值的標準誤差
表9在NbCD3過表達的N.benthamiana葉中下調基因的標準化雜交信號值(Log2)的均值

*s.e.三個重復間雜交信號值的標準誤差表10


4.討論本發明的發明人開發的SuperSAGE-Array直接利用26個堿基序列的標簽不需考慮Tm值的最適化等。該陣列分析可獲得高再現性的結果。這些結果提示，SuperSAGE-Array可用于1)SuperSAGE的結果評價；2)SuperSAGE中發現的基因的多樣本表達分析。
由于SuperSAGE-Array不必要進行oligo探針的設計，可在SuperSAGE分析后1～1.5個月制作陣列，可進行廣泛的基因表達分析。總之，SuperSAGE-Array是一種可對SuperSAGE鑒定的基因進行詳細分析的優秀工具。
一些標簽在SuperSAGE與SuperSAGE-Array間不能獲得一致的結果，這是因為這些標簽接近polyA序列，雜交不能充分進行；或者26個堿基的標簽與同源基因的RNA進行雜交。這些問題可通過應用不同的其它錨定酶進行SuperSAGE而避免。
本實施例中應用識別4個堿基的限制性酶NlaIII進行特定標簽的提取，但若用限制性酶Sau3AI等取代NlaIII也可提取出同樣的標簽。2個文庫中所有感興趣的標簽進行SuperSAGE-Array，期待用SuperSAGE鑒定出的至少1個寡核苷酸可進行滿意的雜交。
實施例2實施例1中，對模型植物水稻應用固化了41個SuperSAGE標簽的陣列進行表達分析，對非模型植物Nicotiana benthamiana應用固化了154個SuperSAGE標簽的陣列進行表達分析，其結果均與通過SuperSAGE進行的表達分析結果有非常好的對應性。本實施例，對水稻，在制備固化了1000個SuperSAGE標簽的陣列，驗證用SuperSAGE-Array與SuperSAGE進行表達分析結果的對應性。
按照實施例1，從水稻葉(品種ヤシロモチ)與水稻培養細胞(品種かけはし)提取mRNA，制作SuperSAGE文庫。從該文庫中隨機選擇1000個克隆，不進行測序，確定1000個SuperSAGE標簽序列。以所確定的標簽序列為基礎，利用12-well array system(NimbleScreen 12NimbleGen Co.)制作陣列。對于各標簽序列，合成第7和第13位堿基序列改變了的錯配序列(不同序列)，用于雜交特異性的鑒定。
從水稻葉與水稻培養細胞提取總RNA，分別合成用Cy3標記的cRNA，作為雜交探針。探針與制備的陣列進行雜交，用掃描儀讀取信號，按Robust Multi-chip Analysis(RMA)法使信號值的數據標準化。雜交反復獨立進行3次。為了觀察各雜交間的再現性，標記2個陣列間各標簽的雜交信號值，與實施例1同樣，大部分的信號值在重復間顯現良好的相關性(R2＝0.973～0.992)。陣列的制作及雜交的實施委托ジ一ンフロンティア公司進行。
圖6表示應用SuperSAGE-Array的水稻葉與水稻培養細胞中各基因的表達模式。表11表示應用SuperSAGE-Array的表達分析結果與應用SuperSAGE的表達分析結果的比較。
表11應用SuperSAGE-Array和SuperSAGE對水稻葉與水稻培養細胞中各基因表達的分析結果的比較

*SuperSAGE-Array和SuperSAGE表達分析結果的一致性比率結果，用SuperSAGE與SuperSAGE-Array檢測出的表達水平結果顯示，在葉中的表達水平高于培養細胞中表達水平的基因亞組中有80.4％(統計學上有顯著性差異的為87.7％)的一致性；在培養細胞中的表達水平高于葉中的表達水平的基因亞組中有87.0％(統計學上有顯著性差異的為89.2％)的一致性。
實施例3實施例1應用SuperSAGE-Array進行表達分析中，NbCD1及NbCD3過表達時，Nicotiana benthamiana中均高表達的標簽中，選擇5個與公知的cDNA和EST不一致的標簽(NbCD3U14、20、25、32、40)，嘗試鑒定其對應的基因。
通過如下進行的3’-RACE及5’-RACE確定與各標簽對應的全長序列。從NbCD3過表達的Nicotiana benthamiana葉分離出RNA作模板，合成其兩端附加了銜接子序列的cDNA。根據SuperSAGE標簽序列為基礎，應用gene specific PCR引物和與銜接子序列互補的引物，由模板cDNA擴增部分cDNA片段。在所得片段5’末端序列的基礎上，制備引物，應用該引物與銜接子引物(與銜接子序列互補的引物)，擴增其上游區域。圖7中顯示通過3’-RACE及5’-RACE擴增全長序列的概略圖(上)，3’-RACE及5’-RACE中PCR產物的電泳圖(下)。
綜合3’-RACE與5’-RACE的結果，確定出與5個標簽對應的全長基因序列。可以確認，對于這5個基因，相應的SuperSAGE標簽序列均出現在預期的位置。各基因的功能，可通過其推定的ORF和BLAST檢索的結果進行預測。由此，可以確認通過應用SuperSAGE-Array的分析結果，可容易地確定未知基因的全長序列，容易地預測其功能。
通過以上結果可以確認，SuperSAGE-Array是一種獨一無二的有用的方法，具有高定量性的SAGE、高通量的微陣列的優點。
產業上利用的可能性根據本發明可容易地制作所有組織、預期條件下的表達基因的oligoarray。例如，各種癌組織來源的SuperSAGE-Array可用于臨床檢驗，SuperSAGE-Array還可用于所有的真核生物。此外，攜載宿主生物與病原體的基因的SuperSAGE-Array可用于宿主-病原體間相互作用分析的研究。如此，本發明可用于從基礎到臨床所有領域的基因表達分析。
附圖簡述圖1-1表示SuperSAGE標簽的制備方法的概要。
圖1-2表示SuperSAGE標簽的制備方法的概要。
圖2表示本發明的SuperSAGE-Array的概要。通過SuperSAGE-Array可發現在2個以上的樣本間表達量發生變化的基因的26個堿基序列標簽。用這些標簽序列的寡核苷酸制成微陣列(SuperSAGE-Array)。用這些陣列可進行多樣本的高通量分析。
圖3表示對水稻葉和培養細胞進行SuperSAGE-Array分析的結果。圖棒的高度表示葉和培養細胞樣本間標準化的信號值的差(用log值表示)。棒向上延伸表示葉中信號強，棒向下延伸表示培養細胞中信號強。棒的顏色表示通過SuperSAGE發現的表達模式。(樣本間同等程度的表達量，紫色；葉中表達量多的，紅色；培養細胞中多的，橙色)圖4表示外來基因過量表達的Nicotiana benthamiana中SuperSAGE-Array的再現性。
圖5表示用SuperSAGE-Array分析的NbCD1或NbCD3過量表達的Nicotiana benthamiana中基因表達的模式。根據SuperSAGE分析的結果，將基因分為NbCD1過量表達時誘導(A)、抑制(B)，NbCD3過量表達時誘導(C)、抑制(D)。與對照GFP過量表達的葉相比，信號強時用紅色表示，信號弱時用綠色表示。
圖6表示用SuperSAGE-Array分析的水稻葉和培養細胞中基因表達模式不同的結果。與培養細胞相比，葉中表達量高時用紅色表示，低時用綠色表示。
圖7表示通過3’-RACE和5’-RACE擴增的與Nicotianabenthamiana來源的5個標簽(NbCD3U14，20，25，32，40)相對應的全長序列的概要(上)，和各PCR產物的電泳圖(下)。
序列表文本序列號8-oligo dT引物序列號197-接頭A序列序列號198-接頭A序列序列號199-接頭B序列序列號200-接頭B序列序列表<110>Iwate Prefecture<120>應用固化了超過25個堿基的標簽的陣列SuperSAGE-Aaaray進行基因表達分析<130>PH-2895-CN<150>JP2005-359366<151>2005-12-13<150>JP2006-138515<151>2006-05-18<160>200<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>26<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220>
<223>發明人Terauchi，Ryohei；Matsumura，Hideo<400>1catgaattga gttcgctttg gttatg26<210>2<211>26<212>DNA<213>稻<400>2
catggtttgg ttggattagg cggagt26<210>3<211>26<212>DNA<213>稻<400>3catgggctaa agccagccaa actggt26<210>4<211>26<212>DNA<213>稻<400>4catgtcggtt cagttatgtg aacttg26<210>5<211>26<212>DNA<213>稻<400>5catgtaatgt ttgctatcgt gagtta26<210>6<211>26<212>DNA<213>稻
<400>6catggctgac ccagccttcc gtccac26<210>7<211>26<212>DNA<213>稻<400>7catgggagcg actccgtgga caacgg26<210>8<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡dT引物<400>8ctgatctaga ggtaccggat cccagcagtt tttttttttt ttttttt 47<210>9<211>26<212>DNA<213>稻<400>9catgttcggc tgcaccgatg ccaccc26<210>10
<211>26<212>DNA<213>稻<400>10catggggacg catcgccttc agctaa26<210>11<211>26<212>DNA<213>稻<400>11catgtaatat gatgcctaga gcatat26<210>12<211>26<212>DNA<213>稻<400>12catgtaatgg tacatatctc cttgtt26<210>13<211>26<212>DNA<213>稻<400>13catgctcaag atgatcgagg actacc26
<210>14<211>26<212>DNA<213>稻<400>14catgtatgta tgtcccttaa ttgtgt26<210>15<211>26<212>DNA<213>稻<400>15catgttgata ttgtatcagc aagcac26<210>16<211>26<212>DNA<213>稻<400>16catggacgag cgcgacgcca agatcc26<210>17<211>26<212>DNA<213>稻<400>17catggcgcag gaggtgcttc tcggcg26
<210>18<211>26<212>DNA<213>稻<400>18catgtactac taccttgtaa actttt26<210>19<211>26<212>DNA<213>稻<400>19catgttcggg tgcactgacg ccaccc26<210>20<211>26<212>DNA<213>稻<400>20catgggggat tgtgcacgca tctggc26<210>21<211>26<212>DNA<213>稻<400>21catgtgtgta cgtggtgtgt tttgag26
<210>22<211>26<212>DNA<213>稻<400>22catgcataat tgaacgcttg tcgtgc26<210>23<211>26<212>DNA<213>稻<400>23catgtgtaaa tactgccgtg tgtttc26<210>24<211>26<212>DNA<213>稻<400>24catggatccg tctctctggg aggaat26<210>25<211>26<212>DNA<213>稻<400>25
catgtcggac aagtgcggca actgcg26<210>26<211>26<212>DNA<213>稻<400>26catgtggtgg cttagctcta cgtgta26<210>27<211>26<212>DNA<213>稻<400>27catgttgtaa tactccatca aagagt26<210>28<211>26<212>DNA<213>稻<400>28catgcatatg tgaatgctag caccag26<210>29<211>26<212>DNA<213>稻
<400>29catgtgctgt tgtggcgtgt cgctag26<210>30<211>26<212>DNA<213>稻<400>30catgcttcaa tatatatcca tcaaat26<210>31<211>26<212>DNA<213>稻<400>31catggatttg cactgtctga tctatc26<210>32<211>26<212>DNA<213>稻<400>32catgcacaac agcacaagtg gagtag26<210>33<211>26<212>DNA<213>稻
<400>33catggtaatg taccaaacag cgatga26<210>34<211>26<212>DNA<213>稻<400>34catgcgtttg tgggcaagaa gacaat26<210>35<211>26<212>DNA<213>稻<400>35catgctggta gctcagcgaa tctcct26<210>36<211>26<212>DNA<213>稻<400>36catggcacgg ttacccgtca tttccg26<210>37<211>26<212>DNA
<213>稻<400>37catgatgatg gccgccaccg ccaccg 26<210>38<211>26<212>DNA<213>稻<400>38catgcgagtt cccggggctc aagatc26<210>39<211>26<212>DNA<213>稻<400>39catggccacc gctaccaacg gcaacg26<210>40<211>26<212>DNA<213>稻<400>40catggtcgcc gccgccgtgc cggagc26<210>41<211>26
<212>DNA<213>稻<400>41catgtgtgtt gtgtgtacga tgagct26<210>42<211>26<212>DNA<213>稻<400>42catgttaagt ttgagatatg atatga26<210>43<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>43catgttgatt atatgaccgg agggta26<210>44<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>44catgaagatt atgagattgt tttatc26<210>45
<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>45catgcaaata aagtagttgt tcgaaa26<210>46<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>46catgggcagt gaaactggga agaaga26<210>47<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>47catgtggtct ctcaaatgtt ggaact26<210>48<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>48catgtacatt gaaagatgga ggcgga26
<210>49<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>49catgtctatt ggttggcagg caaata26<210>50<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>50catgaatgaa gtttgtatcc tctgtg26<210>51<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>51catgttttca ccctatatcg ataacc26<210>52<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>52catgaagcca ttggaggttt tgtcac26
<210>53<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>53catggatcgg caaacaaaga gataat26<210>54<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>54catgtattca tctgtaaata gcttgt26<210>55<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>55catgtcgtat aaagttgtaa cggagt26<210>56<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>56catgttcatt gccaagatct ggacat26
<210>57<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>57catgaacttg aaactatgga tatctg26<210>58<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>58catgactcat atatcaagtt tatgag26<210>59<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>59catgatgctt gccaagtgat gacatt26<210>60<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>60
catgcaaaaa ttgtacgtgt ggaagg26<210>61<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>61catgttcttg tatatgtatc atatgt26<210>62<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>62catggcttct agatatccat atgatg26<210>63<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>63catgtagtgc taagtaatat tgaata26<210>64<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana
<400>64catgtaatgt tttgttgtac aatata26<210>65<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>65catggtacca tcttgttata tttgga26<210>66<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>66catggtggtg ggtacatcgt tagaag26<210>67<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>67catgggcaga tcaatgggat ccagcc26<210>68<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana
<400>68catgccttta gtactttgga tttggg26<210>69<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>69catgttactt gcaacggcga taacca26<210>70<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>70catgtaccct gctgtatatt cgggag26<210>71<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>71catgacgtat tacaagtacc aaaagc26<210>72<211>26<212>DNA
<213>Nicotiana benthamiana<400>72catggatcat atgatttcat atttgt26<210>73<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>73catggggtgt tgaccaagac gcactt26<210>74<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>74catgagtgca agcgttcgag gttcct26<210>75<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>75catgtctcat tttttgactg ctggtt26<210>76<211>26
<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>76catgattact attctatcaa gggact26<210>77<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>77catgttatgt atgtttcagt tgagat26<210>78<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>78catgaggaag tttatgttac cggaga26<210>79<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>79catgttgaga gaccacctat ttgtgg26<210>80
<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>80catgcactaa taatgctact tcaagt26<210>81<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>81catgtggagt tagatccaaa ttttcc26<210>82<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>82catggtacta ctcctggaag atcatt26<210>83<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>83catggattcc aaaaaagagc aaaagc26
<210>84<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>84catggatatt gatgatcaga ataatg26<210>85<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>85catgctaata aggaaattga tgctgc26<210>86<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>86catgacttct tgggactgat gtacat26<210>87<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>87catgactcaa atacttgtgc acgagg26
<210>88<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>88catggctaat gctggacctg gaacca26<210>89<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>89catgccccct tgtgttatgg agatct26<210>90<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>90catgcgcccc ccgtccgctt gccgac26<210>91<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>91catgagcagc taagtgaaga aacttg26
<210>92<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>92catgatcaaa atagatttca gttggg26<210>93<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>93catgtaattt cccaaatcga actgta26<210>94<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>94catggacgct tccagactac acagga26<210>95<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>95
catgtatctg ttatcaaccc tgtgtg26<210>96<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>96catgggattt ggcagaagag gccccg26<210>97<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>97catggcccct gcgcaaggat gacacg26<210>98<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>98catgatgagc tttaagggac tagtcg26<210>99<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana
<400>99catggccgac ttgctgcacg tcaacc26<210>100<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>100catgataagc tttaagggat tagtcg26<210>101<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>101catgatgcag ctgggttgtg atggcg26<210>102<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>102catgcgccgt tttggctgta gaatgg26<210>103<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana
<400>103catgtaatgt atgcaagttg ttgcta26<210>104<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>104catggacaat ttggttaggt tcagct26<210>105<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>105catgaccgtg gagccttgat catttt26<210>106<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>106catggatagt ccttcacatt ggcacg26<210>107<211>26<212>DNA
<213>Nicotiana benthamiana<400>107catgccagct gggagagcta atccgc26<210>108<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>108catgggcgtg accgtgggaa tggagg26<210>109<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>109catgggggta taccacactg tctttg26<210>110<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>110catgggactt ggtggatgca ttgctc26<210>111<211>26
<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>111catggtgacg aagccagatt ggtggc26<210>112<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>112catgtgctgc aggcagtgct tccgca26<210>113<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>113catgtgaaag aacagactga gcttgt26<210>114<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>114catggatggt atgtgcctgc tccagt26<210>115
<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>115catgcaaaac actctcatcc ccccta26<210>116<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>116catggaggca ttctcccgta cgtcat26<210>117<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>117catgtctacg gaggctgtaa cttttt26<210>118<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>118catgggtaga gccaaagagt gtgaac26
<210>119<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>119catgttctgc tactcgacta tgagac26<210>120<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>120catgtgcttc aagacgtatc acttgt26<210>121<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>121catgtacact tcaagaatcc tactcc26<210>122<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>122catgggtaga tggatggttt gcttag26
<210>123<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>123catggcacag ttaaaggatt ctctct26<210>124<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>124catggatgaa gaagctgctg ggtttt26<210>125<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>125catgacacgg tcaagcaaag atctgt26<210>126<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>126catgtgcagg actttagatc cttgca26
<210>127<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>127catgttgtat aaagttgtaa cgaagc26<210>128<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>128catgatttta tggtaacttg attgat26<210>129<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>129catgtttacc ctttgacggc ccaaat26<210>130<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>130
catgcataac aatacatttt ggtcat26<210>131<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>131catgccttct tttctttgta ttatca26<210>132<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>132catggattaa catcattatt ctctgt26<210>133<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>133catgacactg ataactgccg aggatt26<210>134<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana
<400>134catgataacg tttatctaag aagagg26<210>135<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>135catggatgga aaacttagta ccaata26<210>136<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>136catgtgaaag aacagaccga gcttgt26<210>137<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>137catgaagtcc atcaaagtcc taggct26<210>138<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana
<400>138catgatcatt cttttgtata ccgtgt26<210>139<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>139catgtttgga gtaattctcc ttgtat26<210>140<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>140catggcatct cttgacaatg ttgggg26<210>141<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>141catggtcctt caaggggaag caggtg26<210>142<211>26<212>DNA
<213>Nicotiana benthamiana<400>142catgtaagga gtgctactga aatgga26<210>143<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>143catgtggtct ctcaaatgtt ggaact26<210>144<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>144catgttgaac ctctgtaatt ccgatc26<210>145<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>145catgaacaca actagagtga agaagt26<210>146<211>26
<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>146catgaagtta tacgccggac taaagt26<210>147<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>147catgaatgaa tttaacagtt caatat26<210>148<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>148catgatagga taacaaagat atatat26<210>149<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>149catgccttta gtactttgga tttggg26<210>150
<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>150catggatcgg caaacaaaga gataat26<210>151<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>151catgttaaag tgaaacgcaa caatgg26<210>152<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>152catgttgatt atatgaccgg agggta26<210>153<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>153catgacgaag ttccaacacg aagaga26
<210>154<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>154catgataaat gggagaccct tgtact26<210>155<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>155catgatcatt ttcctgagat tcgacg26<210>156<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>156catgcaaaac ctaaaataac caaact26<210>157<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>157catggagttg tatcttgact gcttct26
<210>158<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>158catgggatag cttttcatct ttggat26<210>159<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>159catgtaacca tacaagttga accatc26<210>160<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>160catgtgaatg acgcaaactt tcaagt26<210>161<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>161catgttatag tatgagatag aggagt26
<210>162<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>162catgtcccct gtttgtatgt tctgtt26<210>163<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>163catggagcta caggacttca ttctcc26<210>164<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>164catgatctct ttcctgagat tcgtca26<210>165<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>165
catgggcaga tcaatgggat ccagcc26<210>166<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>166catggaagaa gcaaccttag tgtggt26<210>167<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>167catgtggaat gttcgtattg tgaata26<210>168<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>168catgttgctg aagttttcac gggtgc26<210>169<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana
<400>169catgcaaggc cagtcggaga agaagg26<210>170<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>170catgagggat gagccaggag cacggc26<210>171<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>171catgttgcaa cttctagtca atgact26<210>172<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>172catgagcgga agc taacctg aatcca 26<210>173<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana
<400>173catgcctgtg agcctgctgt tggtaa26<210>174<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>174catggcacca gcgtggaatg tcgcat26<210>175<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>175catggggata tagcaagatc gtgaat26<210>176<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>176catgttatct ttccaataga ggcgag26<210>177<211>26<212>DNA
<213>Nicotiana benthamiana<400>177catgagactc taaacaattt cgcttg26<210>178<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>178catgcagcaa agaccaagaa cagccc26<210>179<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>179catgccgaag caaatccacg aaatca26<210>180<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>180catgcttaca aagggaatcc agctac26<210>181<211>26
<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>181catggggtct cccgctggta aggtat26<210>182<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>182catgacgcgc ttaacctaca ctcttg26<210>183<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>183catgaggagg ctagaaggaa gaatgt26<210>184<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>184catgagggat gaaccaggag ccagac26<210>185
<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>185catgatttgt aactattggg gattct26<210>186<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>186catggatata tggcaattgc gtttgt26<210>187<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>187catgggtgct gagatggttt aatggt26<210>188<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>188catgtaattt ggcggggagt aatgta26
<210>189<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>189catgaataaa tgctactcta atagct26<210>190<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>190catgacggaa aagccaatta tcaagt26<210>191<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>191catgattggg caatttggtg ttggtt26<210>192<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>192catgattttc aaggacggag agaaga26
<210>193<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>193catgccaccg gggtccacaa cgtgct26<210>194<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>194catgctgccc aactttgtgt attggc26<210>195<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>195catgggtttc agcttgtttg attaag26<210>196<211>26<212>DNA<213>Nicotiana benthamiana<400>196catgtataaa ttgtgtaatg ttgtgt26
<210>197<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述接頭A<400>197tttggatttg ctggtgcagt acaactaggc ttaatacagc agcatg 46<210>198<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述接頭A<400>198ctgctgtatt aagcctagtt gtactgcacc agcaaatcca aa 42<210>199<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述接頭B<400>199
tttctgctcg aattcaagct tctaacgatg tacgcagcag catg44<210>200<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述接頭B<400>200ctgctgcgta catcgttaga agcttgaatt cgagcagaaa 40
權利要求
1.一種基因表達分析方法，其特征在于，使含基因的樣本與固化了多個標簽的固相化材料進行雜交，通過檢測與該標簽進行雜交的基因的信號，分析該樣本中基因的表達模式，所述固化的標簽的特征在于，其由識別表達基因的、超過25個堿基長度的寡核苷酸構成，其3’末端由III型限制性酶的酶切位點限定，且其5’末端由該基因的cDNA上離3’側最近的其它限制性酶的酶切位點限定。
2.權利要求1的方法，其中所述的標簽具有通過以下步驟確定出的堿基序列1)應用包含III型限制性酶識別序列與oligo dT序列的引物，由表達基因的mRNA合成cDNA庫，然后用其它的限制性酶處理所得cDNA庫；2)從上述cDNA庫純化包含PolyA序列的片段，將該片段與接頭A和接頭B連接；3)用III型限制性酶處理上述片段，連接所得的包含接頭A的片段和包含接頭B的片段；4)用步驟1)中所述的其他限制性酶酶切上述連接片段，除去接頭序列，獲得雙標簽寡核苷酸；5)連接各雙標簽寡核苷酸，制備多聚核苷酸；及6)分析上述多聚核苷酸的堿基序列，確定該多聚核苷酸中包含的各標簽的堿基序列。
3.權利要求1或2的方法，其中所述的III型限制性酶是EcoP15I。
4.權利要求3的方法，其中所述的其它的限制性酶選自NlaIII、Hsp92II、FatI、BfaI、MaeI、XspI、HpyCH4IV、MaeII、TaiI、TscI、AluI、TaqI、BfuCI、Bsp143I、BstENII、DpnII、Kzo9I、MboI、NdeII、Sau3AI、BstKTI、及Csp6I。
5.權利要求4的方法，其中接頭A和接頭B是互不相同的雙鏈DNA，通過以下第一鏈DNA(1)與第二鏈DNA(2)的退火而獲得，DNA(1)5’-N30-40-CAGCAGCATG-3’DNA(2)3’-N30-40-GTCGTC-5’其中，(1)和(2)的N30-40是相互補的任意的30～40個核苷酸序列，DNA(1)的5’末端可被標記，DNA(2)的3’末端可進行氨基酸修飾。
6.一種固化了多個下述標簽的固相化材料，所述被固化的標簽的特征在于，其由識別表達基因的超過25個堿基長度的寡核苷酸構成，其3’末端由EcoP15I的酶切位點限定，且其5’末端由該基因的cDNA上離3’側最近的NlaIII的酶切位點限定，該固相化材料是一種其固化的標簽具有通過以下步驟確定的堿基序列的固相化材料1)應用包含EcoP15I識別序列與oligo dT序列的引物，由表達基因的mRNA合成cDNA庫，然后用NlaIII處理所得cDNA庫；2)從上述cDNA庫純化包含PolyA序列的片段，將該片段與接頭A和接頭B連接；3)用EcoP15I處理上述片段，連接所得的包含接頭A的片段與包含接頭B的片段；4)用步驟1)中所述的NlaIII酶酶切上述連接片段，除去接頭序列，獲得雙標簽寡核苷酸；5)連接各雙標簽寡核苷酸，制備多聚核苷酸；及分析上述多聚核苷酸的堿基序列，確定該多聚核苷酸中包含的各標簽的堿基序列。
7.權利要求6的固相化材料，其中接頭A與接頭B是互不相同的雙鏈DNA，通過以下第一鏈DNA(1)與第二鏈DNA(2)的退火而獲得，DNA(1)5’-N30-40-CAGCAGCATG-3’DNA(2)3’-N30-40-GTCGTC-5’其中，(1)和(2)的N30-40是相互補的任意的30～40個核苷酸序列，DNA(1)的5’末端可被標記，DNA(2)的3’末端可進行氨基酸修飾。
8.權利要求6或7的固相化材料，其中固相化材料是在固相上合成標簽寡核苷酸而制成的。
9.權利要求6或7的固相化材料，其中固相化材料是將預先合成的標簽寡核苷酸固定到固相上而制成的。
全文摘要
提供一種基因分析方法，即使對尚未進行基因組分析的生物，它也能進行廣泛的基因表達分析和多樣本的同時分析。一種基因表達分析方法，其特征在于，含基因的樣本與固化了多個標簽的固相化材料進行雜交，通過檢測與該標簽進行雜交的基因的信號，分析該樣本中基因的表達模式。固化的標簽的特征在于，由識別表達基因的超過25個堿基長度的寡核苷酸構成，其3’末端由III型限制性酶的酶切位點限定，且其5’末端由該基因的cDNA上離3’側最近的其它限制性酶的酶切位點限定。
文檔編號C12Q1/68GK1990882SQ20061016846
公開日2007年7月4日 申請日期2006年12月13日 優先權日2005年12月13日
發明者松村英生, 寺內良平 申請人:巖手縣