專利名稱：：使用具有破壞的糖原生物合成途徑的腸桿菌科細菌產生l-氨基酸的方法
技術領域：
：本發明涉及微生物工業，并且具體涉及使用腸桿菌科C&7tera6acfeWaceaefamily)的細菌產生L-氨基酸的方法，該細菌中糖原生物合成途徑(glycogenbiosynthesispathway)已被破壞。
背景技術：
：糖原代表了大腸桿菌(五"/7en'c/2/acoZ/)和許多其它原核生物貯藏的碳的主要形式，并且提供用于保持能量的容易代謝的底物。大腸桿菌中糖原的積累與生長速率是反相關的，并且當細胞進入穩定期時最活躍地發生。在這些條件下三種生物合成酶的水平經歷相應的改變，意味著酶生物合成的遺傳控制可占調控的至少一部分(Preiss，J.,Annu.Rev.Microbiol.38,419-458(1984》。在大腸桿菌中，糖原生物合成的結構基因簇集在相鄰的操縱子g/g^X和g/gC4P上。有趣的是，糖原生物合成基因(g/gCJ)和降解基因(g/g尸)一起位于簇中，可能促進這些系統的體內調控(Romeo，T.,Gene.70(2),363-76(1988))。g/gC基因是葡糖-1-磷酸腺苷酰轉移酶(glucose-1-phosphateadenylyltransferase)的結構基因。葡糖-l-磷酸腺苷酰轉移酶的同義詞是ADP-葡糖合酶、ADP-葡糖焦磷酸化酶、ADP:a-D-葡糖-l-磷酸腺苷酰轉移酶、GlgC蛋白。葡糖-l-磷酸腺苷酰轉移酶(EC2.7.7.27)是真細菌的糖原生物合成途徑中的別構酶(allostericenzyme)。在腸細菌中，葡糖-l-磷酸腺苷酰轉移酶由糖酵解中間物調控，用1,6-二磷酸果糖作為活化劑，以及AMP、ADP和P,作為抑制劑。所述酶催化從葡糖1-磷酸和ATP合成ADP葡萄糖和PP"該反應是細菌糖原生物合成中第一個獨特的步驟。已知大腸桿菌的碳貯藏調控系統控制涉及糖代謝和細胞運動性(motility)的基因的表達。CsrA與g/gCAP轉錄物的結合通過促進g/gC4PmRNA衰變(decay)來抑制糖原代謝。CsrBRNA通過隔離CsrA蛋白并且阻止該蛋白的作用來起到CsrA拮抗物的作用(Baker,C.S.etal,Mol.Microbiol.,44(6)，1599-610(2002))。g/gC4戶操縱子處于環腺苷酸(cAMP)和環腺苷酸受體蛋白(CRP)的正控制下。編碼腺苷酸環化酶(EC4.6.1.l)的c少a基因和編碼CRP的crp基因二者均是糖原的最優合成所必需的(Fletterick,RJ.andMadsen，N.B.，Annu.Rev.Biochem.,49，31-61(1980))。CRP結合至位于g/gC基因上游的位點。大腸桿菌中的糖原合成還由ppGpp正調節，其刺激g/gC4尸操縱子的轉錄(Preiss.J.,andRomeo,T.，Prog.NucleicAcidRes.Mol.Biol.47，299-329(1994》。通過使用mini-Mu隨機染色體文庫和對于糖原超量產生的篩選，鑒定了涉及糖原合成的新基因(g/g5)(Hengge-Aronis,R.andFischer,D.,MolMicrobiol.6,14,1877-86(1992))。還顯示大腸桿菌蛋白質GlgS在對奴/賊脅迫的應答中被上調，并且顯示它的過量表達刺激糖原合成(Kozlov,G.etal,BMCBiol"2,1,10(2004))。糖酵解生物合成的初始底物是葡糖-1-P,其得自葡糖-6-P，所以所述途徑與糖酵解竟爭葡糖-6-P。但是目前，還沒有將g/g5I和/或g/gC4尸操縱子失活或將g/gS基因失活用于產生L-氨基酸的報道。
發明內容本發明的目的包括增強產生L-氨基酸的菌林的生產力(productivity)和提供使用這些菌抹產生L-氨基酸的方法。上述目的通過發現將g/gBX和/或g(gC4尸操縱子失活能夠增強L-氨基酸的產生來實現，所述L-氨基酸例如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。本發明提供產生氨基酸的能力增加的腸桿菌科的細菌，所述氨基酸如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。本發明的目的是提供腸桿菌科的產生L-氨基酸的細菌，其中已將所述細菌修飾以破壞糖原生物合成途徑。本發明的另一個目的是提供如上所述的細菌，其中通過衰減(attenuation)g/gi5JT和/或g/gCAP操縱子的表達來破壞糖原生物合成途徑。本發明的另一個目的是提供如上所述的細菌，其中通過將g/gSJT和/或g/gC4P操縱子失活來破壞糖原生物合成途徑。本發明的另一個目的是提供如上所述的細菌，其中通過缺失至少一個選自下組的基因來進行g/g^T和/或g/gCAP操縱子的失活g/g仏g/gX、g/gC和g/g丄g/g尸，以及它們的組合。本發明的另一個目的是提供如上所述的細菌，其中通過衰減g/gs基因的表達來破壞糖原生物合成途徑。本發明的另一個目的是提供如上所述的細菌，其中通過將g/gs基因失活來破壞糖原生物合成途徑。本發明的另一個目的是提供如上所述的細菌，其中該細菌屬于埃希氏菌屬(￡^c/zer/c///fl)。本發明的另一個目的是提供如上所述的細菌，其中該細菌屬于泛菌屬本發明的另一個目的是提供如上所述的細菌，其中所述L-氨基酸選自下組芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。本發明的另一個目的是提供如上所述的細菌，其中所述芳族L-氨基酸選自下組L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。本發明的另一個目的是提供如上所述的細菌，其中所述非芳族L-氨基酸選自下組L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-曱硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。本發明的另一個目的是提供產生L-氨基酸的方法，起包括-在培養基中培養如上所述的細菌以將L-氨基酸產生和分泌到培養基中，和-從培養基中收集所述L-氨基酸。本發明的另一個目的是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸選自下組芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。本發明的另一個目的是提供如上所述的方法，其中所述芳族L-氨基酸選自下組L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。本發明的另一個目的是提供如上所述的方法，其中所述非芳族L-氨基酸選自下組L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-曱硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨g吏、L-脯氨酸和L-精氨酸。附圖簡述圖1顯示引物glgCL和glgCR在質粒pACYC184上的相對位置，其用于擴增c^基因。圖3顯示含有失活的g/g^X和g/gC4P操縱子的染色體DNA片段的構建。優選實施方案詳述以下對本發明做詳細的描述。1.本發明的細菌本發明的細菌是腸桿菌科的產生L-氨基酸的細菌，其中已將該細菌修飾從而破壞了糖原生物合成途徑。在本發明中，"產生L-氨基酸的細菌"的意思是這樣的細菌，將該細菌培養在培養基中時，其具有將L-氨基酸產生和分泌到培養基中的能力。本文所用的術語"產生L-氨基酸的細菌"還表示能夠在培養基中產生和引起L-氨基酸積累的細菌，其中積累的L-氨基酸的量大于大腸桿菌的野生型或親本菌抹，例如大腸桿菌K-12，并且優選地表示所述微生物能夠引起在培養基中積累量不少于0.5g/L,更優選不少于1.0g/L的目標L-氨基酸。術語"L-氨基酸，，包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-曱硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸。術語"芳族L-氨基酸"包含L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。術語"非芳族L-氨基酸"包含L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-曱硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸是特別優選的。腸桿菌科包括屬于以下屬的細菌埃希氏菌屬、腸桿菌屬(五"tero6acter)、歐文氏菌屬CErw/m'a)、克雷伯氏菌屬CST/e^/e〃a)、泛菌屬、光4干狀菌屬CP/zotor/za6(iM"、普羅威登其斤菌屬(/VovWewc/a)、沙門氏菌屬(5Wmowe〃a)、沙雷氏菌屬(&rra^)、志賀氏菌屬(幼z'ge〃a)、摩根氏菌屬(Morga"e〃a)、耶爾森氏菌屬(lfem'm'a)等。具體而言，能使用那些根據NCBI(國家生物技術信息中心)數據庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorgmode二Tree&id二1236&lv卜3&keep二l&srchmode二l&unlock)所用分類法歸類于腸才干菌科的細菌。屬于埃希氏菌屬或泛菌屬的細菌是優選的。短語"屬于埃希氏菌屬的細菌"的意思是根據微生物領域技術人員已知的分類法歸類于埃希氏菌屬的細菌。本發明中所用的屬于埃希氏菌屬的細菌的實例包括，但不限于，大腸桿菌(Eco//)。能夠用在本發明中的屬于埃希氏菌屬的細菌沒有具體限制，然而舉例來說,由Neidhardt,F.C.等(^c/zer/c/z/aco//andSa/wo"e〃a妙/n'附wn'Mm，AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonD.C.,1208，表l)描述的細菌包括在本發明中。短語"屬于泛菌屬的細菌"的意思是根據微生物領域技術人員公知的分類法歸類于泛菌屬的細菌。基于16SrRNA的核苷酸序列分析等，成團腸桿菌C&zteraZacferagg/owerara)的某些菌種最近被重新分類于成團泛菌(戶awtoeaagg/omera—、尸a"toeaawawam斯氏泛菌(7^awtoea他"vrar/7'/)等(Int.J.Syst.Bacteriol.,43,162-173(1993))。這些菌林包含在"屬于泛菌屬的細菌"中。短語"已將細菌修飾以具有破壞的糖原生物合成途徑，，的意思是已將細菌以這樣一種方式修飾，以使修飾的細菌與未修飾的細菌相比具有減少的合成糖原的能力，或不能合成和積累糖原。糖原生物合成途徑的破壞可通過衰減基因的表達進行，該基因編碼涉及糖原生物合成的酶，例如GlgB、GlgX、GlgC、GlgA、GlgP和GlgS，并且優選地通過將所述基因失活來進行。短語"衰減g/g萬X和/或g/gC4P操縱子的表達"或"衰減g/gS基因的表達"的意思是將目標操縱子或基因以這樣一種方式修飾，以使修飾的操縱子或基因編碼突變蛋白質，其具有減少的活性。短語"g/g5X和/或g/gCAP操縱子的失活"或"g/gS基因的失活"的意思是，這種修飾的操縱子或基因編碼完全失活的蛋白質。也可能由于缺失基因的部分、移動基因閱讀框、引入錯義/無義突變或修飾基因的鄰近區域(包括控制基因表達的序列，例如啟動子、增強子、衰減子、核糖體結合位點等)，修飾的DNA區域不能天然地表達該基因。能夠通過使用各種已知的方法，包括Northern印跡、定量RT-PCR等測定從該基因轉錄的mRNA的量來評估基因表達水平。能夠通過已知方法，包括SDS-PAGE繼之以免疫印跡測定(Westem印跡分析)等來測定由該基因編碼的蛋白質的量。g/gC基因編碼葡糖-l-磷酸腺苷酰轉移酶(同物異名-B3430)。g/gC基因(gi:16131304;GenBank登錄號NC—000913.2中核香酸3566056至3567351的互補核苷酸；SEQIDNO:l)位于大腸桿菌K-12染色體上的g/g^和g/gX基因之間。g/gC基因的核苷酸序列和由g&C基因編碼的葡糖-l-磷酸腺苷酰轉移酶的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:l和SEQIDNO:2。g/gJ基因編碼糖原合酶(同物異名-B3429)的亞基。g/gj基因(核苷酸位置3,566,056至3,564,623;GenBank登錄號NC—000913.2;gi:49175990)位于大腸桿菌K-12染色體上的g/gP和g/gC基因之間。g/gj基因的核苷酸序列和由g/g^基因編碼的糖原合酶亞基的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12。g/g尸基因編碼糖原磷酸化酶/糖原-麥芽四糖磷酸化酶(glycogen-maltotetraosephosphorylase)(同物異名—B3428、GlgY)的亞基。g/g尸基因(核苷酸位置3,564,604至3,562,157;GenBank登錄號NC—000913.2;gi:49175990)位于大腸桿菌K-12染色體上的和g/gJ基因之間。g/g尸基因的核苷酸序列和由g/g/5基因編碼的糖原磷酸化酶/糖原-麥芽四糖磷酸化酶的亞基的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:13和SEQIDNO:14。g/gZ基因編碼糖原磷酸化酶-極限糊精a-l,6-葡糖水解酶(同物異名-B3431、GlyX)。g/g^基因(核苷酸位置3,569,342至3，567，369;GenBank登錄號NC—000913.2;gi:491759卯)位于大腸桿菌K-12染色體上的g/gC和g/g^基因之間。g/gX基因的核苷酸序列和由g/gX基因編碼的糖原磷酸化酶-極限糊精a-l,6-葡糖水解酶的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。g/gB基因編碼糖原分支酶(同物異名-B3432)。基因(核苷酸位置3,571,525至3,569,339;GenBank登錄號NC_000913.2;gi:49175990)位于大腸桿菌K-12染色體上的g/gX和aW基因之間。g/g^基因的核苷S吏序列和由g/gS基因編碼的糖原分支酶的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。g/gS基因編碼糖原生物合成的^oS-依賴性蛋白(同物異名-B3049)。g/gS基因(核苷酸位置:3,189,961至3,189,761;GenBank登錄號NC—000913.2;gi:49175990)位于大腸桿菌K-12染色體上的和w/JORF之間。基因的核苦^f列和由g/g5"基因編碼的糖原生物合成的^M-依賴性蛋白的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。因為在腸桿菌科的屬或菌抹之間可能存在DNA序列的某些不同，所以染色體上將要缺失的g/gC基因不限于SEQIDNo:l所示的基因，而可以包括SEQIDNo:l的同源基因。因此，由g/gC基因編碼的蛋白質變體可與SEQIDNO.2所示的完整的編碼氨基S吏序列具有不少于80%，優選不少于90%,并且最優選不少于95%的同源性，只要該蛋白質變體在失活之前保持了葡糖-l-磷酸腺苷酰轉移酶的活性。此外，g/gC基因可以是變體，其在嚴緊條件下與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列雜交，或與可從該核苷酸序列制備的探針雜交，只要該變體在失活之前編碼1-磷酸腺苷酰轉移酶。"嚴緊條件"包括那些在該條件下形成特異性雜合體，例如，具有不少于60%，優選不少于70%,更優選不少于80%，還更優選不少于90%，最優選不少于95%的同源性的雜合體，并且不形成非特異性雜合體，例如具有低于上述同源性的雜合體。舉例來說，作為示例的嚴緊條件是在60。C在相當于lxSSC、0.1%SDS，優選0.1xSSC、0.1。/。SDS的鹽濃度洗滌一次，優選兩次或三次。探針長度可以根據雜交條件合適地選擇，并且通常是100bp至1kbp。如上所述對于g/gC基因的相似表述能夠應用于g/gBZ和g/gC4P操縱子的其它基因的變體。基因失活能夠通過常規方法進行，例如使用UV照射或亞硝基胍(N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍)處理的誘變處理、定點誘變、使用同源重組的基因破壞或/和插入畫擊夬失突變(Yu,D.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000，97:12:5978-83)和(Datsenko，K.A.andWanner,B丄.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97:12:6640-45)也稱為"Red-驅動的整合"。由g/gC基因編碼的葡糖-l-磷酸腺苷酰轉移酶活性能夠通過例如由Haugen，T.H.等(J.Biol.Chem.251(24)，7880-5(1976))所述的方法測量。所以，當與親本未修飾的細菌相比時，能夠測定在根據本發明的細菌中葡糖-l-磷酸腺苷酰轉移酶活性的減少或缺失。由g/gj基因編碼的糖原合酶的活性能夠通過例如由Fox，J.等(MethodsEnzymol,,28,539-544(1W2))所述的方法測量。所以，當與親本未修飾的細菌相比時，能夠測定在根據本發明的細菌中糖原合酶活性的減少或缺失。由g/g尸基因編碼的糖原磷酸化酶/糖原-麥芽四糖磷酸化酶的活性能夠通過例如由Graves,D丄和Wang,J.H.(TheEnzymes,7(3rded.)，435-482(1972))所述的方法測量。所以，當與親本未修飾的細菌相比時，能夠測定在才艮據本發明的細菌中糖原磷酸化酶/糖原-麥芽四糖磷酸化酶活性的減少或缺失。由g/gX基因編碼的糖原磷S吏化酶-極限糊精a-1，6-葡糖水解酶的活性能夠通過例如由Jeanningros,R.等(BiochimBiophysActa,438(1),186-199(1976))所述的方法測量。所以，當與親本未修飾的細菌相比時，能夠測定在4艮據本發明的細菌中糖原磷酸化酶-極限糊精oc-l,6-葡糖水解酶活性的減少或缺失。由g/g^基因編碼的糖原分支酶的活性能夠通過例如由Illingworth,B.B.和Brown，D.H.(MethodsEnzymol.，8，395-403(1966))所述的方法測量。所以，當與親本未修飾的細菌相比時，能夠測定在根據本發明的細菌中糖原分支酶活性的減少或缺失。由g/gS基因編碼的糖原生物合成的^W-依賴性蛋白的活性能夠通過glgS缺失突變(glgS-nullmutation)的補全來檢測，所述glgS缺失突變抑制糖原合成，例如由Hengge-Aronis，R，和Fischer,D.(Mol.Microbiol.,6，14,1877-1886(1992))所述。所以，當與親本未修飾的細菌相比時，能夠測定在根據本發明的細菌中糖原生物合成的依賴性蛋白活性的減少或缺失。用于制備質粒DNA、消化和連接DNA、轉化、選4奪寡核苷酸作為引物等的方法可以是本領域技術人員熟知的常規方法。這些方法在例如Sambrook，J.，Fritsch,E.F"禾口Maniatis，T.,"MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中有所描述。產生L-氨基酸的細菌作為本發明的細菌，其被修飾以使g/g^義和/或g/gC4/5操縱子或g/gS基因失活，可以使用能夠產生芳族或非芳族L-氨基酸的細菌。能夠通過將固有地具有產生L-氨基酸的能力的細菌中的g/gSX和/或g/gC4P操縱子或g/gS基因失活來獲得本發明的細菌。或者，能夠通過將產生L-氨基酸的能力賦予已經具有g/gSX和/或g/gC4P操縱子或基因的細菌來獲得本發明的細菌。產生L-蘇氨酸的細菌用于得到本發明的產生L-蘇氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌抹，例如大腸桿菌TDH-6/pVIC40(VKPMB-3996)(美國專利號5，175，107、美國專利號5,705,371)、大腸桿菌NRRL-21593(美國專利號5,939,307)、大腸桿菌FERMBP-3756(美國專利號5,474,918)、大腸桿菌FERMBP-3519和FERMBP-3520(美國專利號5,376,538)、大腸桿菌MG442(Gusyatiner等，Genetika(俄語)，14,947-956(1978))、大腸桿菌VL643和VL2055(EP1149911A)等。菌抹TDH-6是ArC基因缺陷的，也是蔗糖同化性的(sucrose-assimilative),并且仏"基因具有滲漏突變(leakymutation)。所述菌林還在r/z"基因中具有突變，該突變賦予對高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的抗性。菌抹B-3996含有質粒pVIC40,其通過將包括突變基因的&"*5(^操縱子插入由RSF1010衍生的載體而獲得。這種突變型AM基因編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I，其具有基本上脫敏的蘇氨酸反饋抑制。菌抹B-3996于1987年11月19曰以登錄號RIA1867保藏在All-UnionScientificCenterofAntibiotics(NagatinskayaStreet3-A，117105Moscow,RussianFederation)。該菌才朱還于1987年4月7日以登錄號B-3996保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms)(VKPM)(Russia,117545Moscow,1Dorozhnyproezd,.1)。優選地，將本發明所述細菌另外地修飾以增強一種或多種下列基因的表達-突變A"基因，其編碼對蘇氨酸反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I;"/w^基因，其編碼高絲氨酸激酶；-ArC基因，其編碼蘇氨酸合酶；-rZz"基因，其編碼推定的跨膜蛋白質；-a^基因，其編碼天冬氨酸-卩-半醛脫氫酶；和-^;C基因，其編碼天冬氨酸氨基轉移酶(天冬氨酸轉氨酶)；已闡明編碼大腸桿菌天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的A"基因(核苷酸位置337至2799,GenBank登錄號NC—000913.2，gi:49175990)。基因位于大腸桿菌K-12染色體上的AM和ArS基因之間。已闡明編碼大腸桿菌高絲氨酸激酶的基因(核苷酸位置2801至3733,GenBank登錄號NC—000913.2，gi:49175990)。AW基因位于大腸桿菌K-12染色體上的和ArC基因之間。已闡明編碼大腸桿菌蘇氨酸合酶的ArC基因(核苷酸位置3734至5020，GenBank登錄號NC—000913.2,gi:49175990)。ArC基因位于大腸桿菌K-12染色體上的^^基因和戸oX開放閱讀框之間。所有三種基因作為單獨的蘇氨酸操縱子發揮功能。編碼對蘇氨酸反饋抑制具有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變基因，以及和ArC基因，能夠作為一個操縱子從熟知的質粒pVIC40獲得，該質粒存在于產生蘇氨酸的大腸桿菌菌抹VKPMB-3996中。質粒pVIC40在美國專利號5,705,371中有詳細描述。thrA基因存在于大腸桿菌染色體上接近于glnHPQ操縱子的18分鐘處，該操縱子編碼谷氨酰胺運送系統的組分。A"基因與ORF1(y&F基因，核苷酸位置764至1651,GenBank登錄號AAA218541，gi:440181)是相同的，并且位于pexS和om;X基因之間。將表達由ORF1編碼的蛋白質的單位定名為thrA基因(rht:對高絲氨酸和蘇氨酸的抗性)。而且，顯示rht/A23突變是在相對于ATG起始密碼子的位置-1的A取代G的取代(ABSTRACTSofthe17thInternationalCongressofBiochemistryandMolecularBiologyinconjugationwithAnnualMeetingoftheAmericanSocietyforBiochemistryandMolecularBiology,SanFrancisco,CaliforniaAugust24-29，1997,abstractNo.457,EP1013765A)。已經闡明大腸桿菌的asp基因(核苦酸位置3572511至3571408，GenBank登錄號NC—000913.1,gi:16131307)，并且能夠使用基于該基因核苷酸序列制備的引物通過PCR(聚合酶鏈式反應；參見White,T.J.etal.,TrendsGenet5，185(1989))獲得。其它微生物的aW基因能夠以類似的方式獲得。同樣，已經闡明大腸桿菌的aspC基因(核苷酸位置983742至984932，GenBank登錄號NC—000913.1,gi:16128895)，并且其能夠通過PCR獲得。其它微生物的wpC基因能夠以類似的方式獲得。產生L-賴氨酸的細菌屬于埃希氏菌屬的產生L-賴氨酸的細菌的實例包括對L-賴氨酸類似物具有抗性的突變體。L-賴氨酸類似物抑制屬于埃希氏菌屬的細菌的生長，但當L-賴氨酸共存于培養基中時，這種抑制將完全或部分地脫敏。L-賴氨酸類似物的實例包括，但不限于，嗯溶菌素(oxalysine)、賴氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate)、S-(2誦氨乙基)畫L-半胱氨酸(S-(2-aminoethyl)畫L-cysteine)(AEC)、y-曱基賴氨酸(y-methyllysine)、a-氯己內酖胺(a誦chlorocaprolactam)等。乂t這些賴氨酸類似物具有抗性的突變體能夠通過對屬于埃希氏菌屬的細菌施以常規的人工誘變處理而獲得。用于產生L-賴氨酸的細菌菌屬的具體實例包括大腸桿菌AJ11442(FERMBP-1543、NRRLB-12185;參見美國專利號4,346,170)和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，L-賴氨酸的天冬氨酸激酶反饋抑制是脫敏的。可以將菌林WC196作為大腸桿菌的產生L-賴氨酸的細菌使用。該細菌菌抹通過將AEC抗性賦予菌抹W3110來培育，所述菌抹W3110源自大腸桿菌K-12。將所得菌林定名為大腸桿菌AJ13069菌抹，并且于1994年12月6曰保藏在通商產業省工業纟支術院生命工學工業纟支術研究所(NationalInstituteofBioscienceandHuman-Technology,AgencyofIndustrialScienceandTechnology)(目前為獨立行政法人產業技術綜合研究所特許微生物保藏中心(NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,InternationalPatentOrganismDepositary),TsukubaCentral6,1-1，Higashil-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan),并且獲得登錄號FERMP-14690。然后，根據布達佩斯條約的規定于1995年9月29日將其轉為國際保藏，并且獲得登錄號FERMBP-5252(美國專利號5,827,698)。用于得到本發明的產生L-賴氨酸的細菌的親本菌株的實例包括，在其中將編碼L-賴氨酸生物合成酶的一種或多種基因的表達增強的菌抹。涉及L-賴氨酸生物合成的酶的實例包括，但不限于，二氫吡啶二羧酸合酶(^p」)、天冬氨酸激酶(/，C)、二氫吡啶二羧酸還原酶(^pB)、二氨基庚二酸脫羧酶(/，J)、二氨基庚二酸脫氫酶(^//2)(美國專利號6,040,160)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脫氫酶(m力、煙酰胺腺噤呤二核苷酸轉氫酶0L4B)和天冬氨酸酶(os;^)(EP1253195A)。用于得到本發明的產生L-賴氨酸的細菌的親本菌抹的實例還包括酶活性減少或消除的菌株，所述酶催化通過從L-賴氨酸生物合成途徑分支而產生L-賴氨酸以外的化合物的反應。催化通過從L-賴氨酸生物合成途徑分支而產生L-賴氨酸以外的化合物的反應的酶的實例包括高絲氨酸脫氫酶和賴氨酸脫羧酶(美國專利號5,827,698)。產生L-半胱氨酸的細菌用于得到本發明的產生L-半胱氨酸的細菌的親本菌抹的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌抹，例如用編碼反饋抗性絲氨酸乙酰轉移酶的不同cj^E等位基因轉化的大腸桿菌JM15(美國專利號6,218,168,俄羅斯專利申請2003121601);具有過表達的基因的大腸桿菌W3110，所述基因編碼適用于分泌對細胞有毒的物質的蛋白質(美國專利號5,972,663);半胱氨酸脫巰基酶(desulfhydrase)活性降低的大腸桿菌菌林(JP11155571A2);對于由q^S基因編碼的半胱氨酸調節子的正轉錄調節物活性增加的大腸桿菌W3110(WO0127307A1),等。產生L-亮氨酸的細菌得到本發明的產生L-亮氨酸的細菌的親本菌抹的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌抹，例如對亮氨酸有抗性的大腸桿菌菌抹(例如，菌抹57(VKPMB-7386,美國專利6,124,121))或對亮氨酸類似物有抗性的大腸桿菌菌林，所述亮氨酸類似物包括如P-2-噻吩丙氨酸、3-羥基亮氨酸、4-氮雜亮氨酸、5,5,5-三氟亮氨酸(JP62-34397B和JP8-70879A);通過WO96/06926中所述的基因工程方法獲得的大腸桿菌菌抹；大腸桿菌H-9068(JP8-70879A)等。可以通過增強涉及L-亮氨酸生物合成的一種或多種基因的表達來改進本發明的細菌。實例包括/ew^SCD操縱子的基因，其優選地由突變/e"基因代表，所述突變/e^4基因編碼解除L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合酶(美國專利6,403,342)。此外，可以通過增強一種或多種基因的表達來改進本發明的細菌，所述基因編碼從細菌細胞分泌L-氨基酸的蛋白質。這些基因的實例包括b2682和b2683基因(ygaZ/f基因)(EP1239041A2)。產生L-組氨酸的細菌用于得到本發明的產生L-組氨酸的細菌的親本菌抹的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌^^,例如大腸桿菌菌才朱24(VKPMB-5945,RU2003677);大腸一干菌菌才朱80(VKPMB-7270,RU2119536);大腸^干菌NRRLB-12116—B12121(美國專利號4,388,405);大腸桿菌H-9342(FERMBP-6675)和H-9343(FERMBP-6676)(美國專利號6,344,347);大腸桿菌H-9341(FERMBP-6674)(EP1085087);大腸桿菌AI80/pFM201(美國專利號6,258,554)等。用于得到本發明的產生L-組氨酸的細菌的親本菌抹的實例還包括，在其中將編碼L-組氨酸生物合成酶的一種或多種基因的表達增強的菌抹。L-組氨酸生物合成酶的實例包括ATP磷酸核糖基轉移酶(/^G)、磷酸核糖基AMP環水解酶(/z&7)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(/2&/￡)、磷酸核糖基亞胺曱基-5-氨基咪唑曱酰胺核糖核苷酸異構酶(/z/W)、酰胺轉移酶(/7"/7)、組氨醇磷酸氨基轉移酶(/^C)、組氨醇磷酸酶(/^5)、組氨醇脫氫酶(/^Z))等。已知編碼L-組氨酸生物合成酶(/^G,/z/W/^F/)的基因受L-組氨酸抑制，并且因此L-組氨酸產生能力也能夠通過將突變引入ATP磷酸核糖基轉移酶(/^()來有效地增強，該突變賦予對反饋抑制的抗性(俄羅斯專利號2003677和2119536)。具有L-組氨酸產生能力的菌抹的具體實例包括大腸桿菌FERM-P5038和5048，其已經引入攜帶編碼L-組氨酸生物合成酶的DNA的載體(JP56-005099A);引入的大腸桿菌菌抹，所述r/zf是用于氨基酸輸出的基因(EP1016710A);賦予磺胺胍、DL-l,2,4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素抗性的大腸桿菌80菌抹(VKPMB-7270,俄羅斯專利號2U9536)等。產生L-谷氨酸的細菌用于得到本發明的產生L-谷氨酸的細菌的親本菌抹的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌抹，例如大腸桿菌VL334thrC+(EP1172433)。大腸桿菌VL334(VKPMB-1641)是L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營養缺陷型菌抹，其在f/zK:和//"基因中具有突變(美國專利號4,278,765)。通過一般轉導方法使用生長在野生型大腸桿菌菌才朱K-12(VKPMB-7)細胞上的噬菌體P1來轉移基因的野生型等位基因。結果，獲得L-異亮氨酸缺陷型菌林VL334thrC+(VKPMB-8961)。該菌4朱能夠產生L-谷氨酸。用于得到本發明的產生L-谷氨酸的細菌的親本菌抹的實例包括，但不限于，其中編碼L-谷氨酸生物合成酶的一種或多種基因的表達增強的菌林。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的實例包括谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮S臾脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氪酶、丙糖磷酸異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、果糖磷酸激酶和葡糖磷酸異構酶。經修飾以使其檸檬酸合成酶基因、磷酸蹄醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脫氫酶基因的表達增強的菌林的實例包括那些公開于EP1078989A、EP955368A和EP952221A中的菌才朱。用于得到本發明的產生L-谷氨酸的細菌的親本菌抹的實例還包括酶活性減少或消除的菌林，所述酶催化合成L-谷氨酸以外的化合物，并且該合成從L-谷氨酸生物合成途徑分支。這些酶的實例包括異檸檬酸裂合酶、a-酮戊二酸脫氫酶、磷酸轉乙酰酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合酶、曱酸乙酰轉移酶、乳酸脫氬酶和谷氨酸脫羧酶。a-酮戊二酸脫氪酶活性缺陷的或a-酮戊二酸脫氫酶活性減少的屬于埃希氏菌屬的細菌，和用于獲得它們的方法在美國專利號5,378,616和5,573,945中有所描述。具體地，這些菌4朱包括以下所列大腸桿菌W3110sucA::Kmr大腸桿菌AJ12624(FERMBP-3853)大腸桿菌AJ12628(FERMBP-3854)大腸4干菌AJ12949(FERMBP-4881)大腸桿菌W3110sucA::Kmr是通過石皮壞大腸桿菌W3110的a-酮戊二酸脫氫酶基因(在下文中稱為"ra"基因")而獲得的菌抹。該菌抹是a-酮戊二酸脫氫酶完全缺陷的。產生L-谷氨酸的細菌的其它實例包括那些屬于埃希氏菌屬并且對天冬氨酸抗代謝物具有抗性的菌抹。這些菌抹也可以是a-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的，并且包括，例如，大腸桿菌AJl3199(FERMBP-5807)(美國專利號5,908,768)，FFRMP-12379,其額外地具有低L-谷氨酸分解能力(美國專利號5,393,671);AJ13138(FERMBP-5565)(美國專利號6,110,714)等。產生L-谷氨酸的細菌的實例包括屬于泛菌屬的突變菌抹，其是a-酮戊二酸脫氬酶活性缺陷的或具有減少的a-酮戊二酸脫氫酶活性，并且該菌一朱能夠如上所述獲得。這些菌纟朱包括AJ13356(美國專利號6,331,419)。朋awafeAJ13356于1998年2月19日以登錄號FERMP-16645保藏在通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(目前為目前為獨立行政法人產業技術綜合研究所特許纟敬生物保藏中心，Central6,1-1，Higashil匿Chome，Tsukuba-shi,Ibaraki畫ken,305-8566,Japan)。其隨后才艮據布達佩斯條約的規定于1999年1月11日轉為國際保藏，并且獲得登錄號FERMBP-6615。由于aKGDH-El亞基基因(sucA)的石皮壞，a"awa^AJ13356是a-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的。當將上述菌株分離時，曾將其鑒定為成團腸桿菌，并且作為成團腸桿菌AJ13356保藏。然而，根據16SrRNA的核苷酸測序等最近將其重新歸類為i^wtoeaawwafe。盡管AJ13356作為成團腸桿菌保藏在前述的保藏所，但就本說明書而言，將它們描述為尸a"toea朋a^&。產生L-苯丙氨酸的細菌用于得到本發明的產生L-笨丙氨酸的細菌的親本菌抹的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌抹，例如大腸桿菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPMB-8197);大腸桿菌HW1089(ATCC55371),其含有p/z"34基因(美國專利號5,354,672);大腸桿菌MWEC101-b(KR8903681);大腸桿菌NRRLB-12141、NRRLB-12145、NRRLB-12146和NRRLB-12147(美國專利號4，407，952)。同樣，作為親本菌才朱，可以4吏用大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB(FERMBP-3566)、大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERMBP-12659)、大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERMBP-12662)和命名為AJ12604(FERMBP-3579)的大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](EP488424Bl)。此夕卜，也可4吏用屬于埃希氏菌屬的產生L-苯丙氨酸的細菌，其具有由，W基因或基因編碼的蛋白的增強的活性(美國專利申請2003/0148473Al和2003/0157667Al)。產生L-色氨酸的細菌用于得到本發明的產生L-色氨酸的細菌的親本菌抹的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌林，例如可以使用大腸桿菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其為由突變"M基因編碼的色氨酰-tRNA合成酶缺陷的(美國專利號5,756,345);大腸桿菌SV164(pGH5)，其具有化M等位基因和等位基因，所述化M等位基因編碼無絲氨酸反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶，所述frp五等位基因編碼無色氨酸反饋抑制的鄰氨基苯曱酸合酶(美國專利號6,180,373);大腸桿菌AGX17(pGX44)(NRRLB-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRLB-12264)，其為色氨酸酶缺陷的(美國專利號4,371,614);大腸桿菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps，其中產生磷酸烯醇丙酮酸的能力增強(W09708333,美國專利號6，319，696)等。先前，鑒定了編碼膜蛋白的yt^G基因，該基因不涉及任何L-氨基酸的生物合成途徑，并且當該基因的野生型等位基因在微生物中的多拷貝載體上擴增時，賦予所述孩i生物對L-苯丙氨酸和幾個氨基酸類似物的抗性。此外，將額外的拷貝引入各個氨基酸產生菌抹的細胞時，；^^G基因能夠增強L-苯丙氨酸或L-色氨酸的產生(W003044192)。所以將產生L-色氨酸的細菌進一步修飾以具有；^^G開放閱讀框的增強表達是理想的。用于得到本發明的產生L-色氨酸的細菌的親本菌抹的實例還包括，其中一種或多種選自下組的酶的活性增強的菌抹鄰氨基苯曱酸合酶、磷酸甘油酸脫氫酶和色氨酸合酶。鄰氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶都受到L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，所以可將使該反饋抑制脫敏的突變引入這些酶。具有這種突變的菌抹的具體實例包括大腸桿菌SV164,其包含脫敏的鄰氨基苯曱酸合酶，以及轉化體菌抹，其通過將質粒pGH5引入到大腸桿菌SV164中而獲得(WO94/08031)，該菌抹含有突變化M基因編碼的反饋脫敏的磷酸甘油酸脫氬酶。用于得到本發明的產生L-色氨酸的細菌的親本菌抹的實例還包括，其中引入了含有編碼脫敏的鄰氨基苯曱酸合酶的基因的色氨酸操縱子的菌抹(JP57-71397A、JP62-244382A、美國專利號4,371,614)。此外，可以通過增強基因的表達來賦予L-色氨酸產生能力，該基因是色氨酸操縱子Op^4)中編碼色氨酸合酶的基因。所述色氨酸合酶由a和卩亞基組成，其分別由化p4和編碼。產生L-脯氨酸的細菌用于得到本發明的產生L-脯氨酸的細菌的親本菌抹的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌抹，例如大腸桿菌7CmivA(VKPMB-8012),其是//vj基因缺陷的并且能夠產生L-脯氨酸(EP1172433)。可以通過增強涉及L-脯氨酸生物合成的一種或多種基因的表達來改進本發明的細菌。用于產生L-脯氨酸的細菌的這些基因的優選實例包括pra5基因，其編碼L-脯氨酸反饋抑制脫敏的谷氨酸激酶(DE專利3127361)。此外，可以通過增強一種或多種基因的表達來改進本發明的細菌，所述基因編碼從細菌細胞分泌L-氨基酸的蛋白質。這些基因的實例是b2682和b2683基因(ygaZ/Z基因)(EP1239041A2)。具有產生L-脯氨酸的活性、屬于埃希氏菌屬的細菌的實例包括以下大腸桿菌菌4朱NRRLB-12403和NRRLB-12404(GB專利2075056)、VKPMB-8012(俄羅斯專利申請2000124295)、DE專利3127361中所述的質粒突變體、由BloomF.R.等(The15thMiamiwintersymposium,1983,p.34)描述的質粒突變體等。產生L-精氨酸的細菌用于得到本發明的產生L-精氨酸的細菌的親本菌抹的實例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌林，例如大腸桿菌菌抹237(VKPMB-7925)(美國專利申請2002/058315Al)及其含有突變N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌抹(俄羅斯專利申請號2001112869)，大腸桿菌菌抹382(VKPMB-7926)(EP1170358A1),其為產生精氨酸的菌抹，其中引入了編碼N-乙酰谷氨酸合成酶的基因(JP57-5693A)等。用于得到本發明的產生L-精氨酸的細菌的親本菌林的實例還包括，其中將編碼L-精氨酸生物合成酶的一種或多種基因的表達增強的菌抹。L-精氨酸生物合成酶的實例包括N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(wgC)、鳥氨酸乙酰轉移酶(a②T)、N-乙酰谷氨酸激酶OgB)、乙酰鳥氨酸轉氨酶(argZ))、鳥氨酸氨基曱酰轉移酶(wgF)、精氨琥珀酸合成酶O"gG)、精氨琥珀酸裂合酶(wg/Z)和氨曱酰磷酸合成酶。2.本發明的方法
技術領域：
：本發明所述方法是用于產生L-氨基酸的方法，其包括在培養基中培養本發明的細菌以將L-氨基酸產生和分泌到培養基中，以及從所述培養基收集L-氨基酸。在本發明中，從培養基等培養、收集和純化L-氨基酸可按類似于常規發酵方法的方式進行，所述常規發酵方法中使用細菌產生氨基酸。用于培養的培養基可以是合成的或天然的培養基，只要該培養基包括碳源和氮源和礦物質和，如有必要，細菌生長所需的適量營養物。碳源可包括各種糖例如葡萄糖和蔗糖，以及各種有機酸。根據所用微生物同化作用的模式，可以使用醇，包括乙醇和甘油。作為氮源，能夠使用各種銨鹽例如氨和硫酸銨，其它氮化合物例如胺，天然氮源例如蛋白胨、大豆水解物和消化的發酵微生物。作為礦物質，能夠使用單磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈣等。作為維生素，能夠使用硫胺素、酵母提取物等。培養優選地在需氧條件下進行，例如搖動培養，以及通氣攪拌培養，在20至40。C,優選地30至38。C的溫度進行。培養物的pH通常是5至9之間，優選地6.5至7.2之間。能夠用氨、碳酸鈣、各種酸、各種堿和緩沖液調節培養物的pH。通常，1至5天的培養導致液體培養基中目標L-氨基酸的積累。培養之后，能夠通過離心或膜過濾從液體培養基中去除固體例如細胞，隨后能夠通過離子交換、濃縮和/或結晶方法收集和純化L-氨基酸。實施例下面將通過如下非限制性實施例更具體地說明本發明。實施例1構建具有失活的g/gC基因的菌抹1.缺失g/gC基因能夠通過最初由Datsenko,K.A.和Wanner,B丄.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12)，6640-6645)開發的稱為"Red-驅動的整合，，的方法來構建缺失g/gC基因的菌抹。根據這種方法，能夠構建與模板質粒中鄰近g/gC基因的區域和賦予抗生素抗性的基因均互補的PCR引物glgCL(SEQIDNO:3)和glgCR(SEQIDNO:4)。可將質粒pACYC184(NBLGeneSciencesLtd.,UK)(GenBank/EMBL登錄號X06403)用作PCR反應的模板。PCR的條件可以如下變性步驟于95。C持續3分鐘；前兩個循環的概況95°C1分鐘、50。C30秒、72。C40秒；后25個循環的概況95。C30秒、54°C30秒、72°C40秒；最終步驟72。C5分鐘。能夠獲得1093-bpPCR產物(圖1)，并在瓊脂糖凝膠中純化，并且能夠用于大腸桿菌MG1655(ATCC700926)的電穿孔，該大腸桿菌含有具有溫度敏感復制的質粒pKD46。質粒pKD46(Datsenko,K.A.和Wanner,B丄.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97:12:6640-45)包括噬菌體X(GenBank登錄號J02459)的2,154個核苷酸(31088-33241)的DNA片段，并且含有在阿拉伯糖可誘導的P皿B啟動子控制下的XRed同源重組系統的基因(y,P,exo基因)。質粒pKD46是將PCR產物整合到菌株MG1655的染色體上所必需的。電感受態細胞能夠如下制備可將大腸桿菌MG1655的過夜培養物(nightculture)于30。C在補加氨千青霉素(100mg/l)的LB培養基中培養，然后用含有氨千青霉素和L-阿拉伯糖(lmM)的5mlSOB培養基(Sambrook等，"MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))稀釋100倍。可將所得培養物在通氣下于30。C培養至OD6。。-0.6，然后可通過濃縮100倍和用水冷的去離子水洗滌3次來制成電感受態。可使用70)^1細胞和-100ng的所述PCR產物進行電穿孔。電穿孔之后的細胞可與1mlSOC培養基(Sambrook等，"MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))—起于37。C溫育2.5小時，此后可涂布于L-瓊脂上，并且于37。C生長以選擇CmR重組體。然后，為了消除pKD46質粒，可在含Cm的L-瓊脂上于42。C進行兩次傳代，并可測試所得菌落對氨千青霉素的敏感性。2.通過PCR確認g/gC基因缺失能夠通過PCR驗證含有g/gC基因缺失、用Cm抗性基因標記的突變體。位點特異性引物glgCl(SEQIDNO:5)和glgC2(SEQIDNO:6)能夠在用于驗證的PCR中使用。PCR驗證的條件可為如下變性步驟于94。C持續3分鐘；30個循環的扭無況94。C30秒、54。C30秒、72°C1分鐘；最終步驟72°C7分鐘。在使用親本菌抹MG1655glgC+作為模板的反應中可獲得的PCR產物應長為1471bp。在使用突變MG1655AglgC::cat菌抹作為模板的反應中可獲得的PCR產物應長為1197bp(圖2)。實施例2由大腸桿菌VL334thrC+-AglgC產生L-谷氨酸產生L-谷氨酸的大腸桿菌菌抹VL334thrC+(EPH72433)染色體上的g/gC基因的缺失能夠通過常規的熟知的方法進行，例如，從MG1655AglgC::cat菌株通過P1轉導進行，以獲得菌抹VL334thrC+-AglgC。已將菌株VL334thrC+于2004年12月6日以登錄號VKPMB-8961保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)(Russia,117545Moscow,1Dorozhnyproezd,1)，然后于2004年12月8日轉為根據布達佩斯條約的保藏。兩種菌抹，VL334thrC+和VL334thrC+-AglgC,都能夠在L-瓊脂平板上于37。C生長18-24小時。然后，可將一環細胞轉移至含有2ml發酵培養基的試管中。所述發酵培養基(pH7.2)應含有葡萄糖(60g/1)、硫酸銨(25g/1)、KH2P04(2g/l)、MgS04(1g/l)、硫胺素(O.lmg/ml)、L-異亮氨酸(70fig/ml)和CaC03(25g/l)。葡萄糖和CaC03應該分別滅菌。培養可于30。C搖動進行3天。培養之后，產生的L-谷氨酸量能夠通過紙層析(液相組成丁醇-乙酸-水=4:1:1)測定，隨后用茚三酮(ninhydrin)(1%丙酮溶液)染色，并且在含0.5%CdCl2的50%乙醇中進一步洗脫所述化合物。實施例3由大腸桿菌702ilvA-AglgC產生L-脯氨酸產生L-脯氨酸的大腸桿菌菌抹702ilvA(VKPMB-8012,俄羅斯專利申請2000124295,EP1172433)染色體上的g/gC基因的缺失能夠通過如上所述常規的熟知的方法進行，以獲得菌4朱702ilvA-AglgC。已將菌抹702ilvA于2000年7月18日以登錄號VKPMB-8012保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)(Russia,117545Moscow,1Dorozhnyproezd，1)。兩種大腸桿菌菌^^，702ilvA和702ilvA-AglgC，都能夠在L-瓊脂平板上于37°C生長18-24小時。然后可將這些菌抹在如上所述的相同條件下培養。實施例4由大腸桿菌237-AglgC產生L-精氨酸產生L-精氨酸的大腸桿菌菌株237(VKPMB-7925)染色體上的g/gC基因的缺失能夠通過如上所述常規的熟知的方法進行，以獲得菌林237-AglgC。已將菌林237于2000年4月10日以登錄號VKPMB-7925保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)(Russia,113545Moscow,1Dorozhnyproezd,1)，然后于2001年5月18日轉為根據布達佩斯條約的保藏。兩種大腸桿菌菌抹，237和237-AglgC,都能夠在L-瓊脂平板上于37°C生長18-24小時。然后可將這些菌抹在如上所述的相同條件下培養。實施例5由大腸桿菌57-AglgC產生L-亮氨酸產生L-亮氨酸的大腸桿菌菌株57(VKPMB-7386,美國專利6,124,121)染色體上的g/gC基因的缺失能夠通過如上所述常規的熟知的方法進行，以獲得菌抹57-AglgC。已將菌抹57于1997年5月19日以登錄號VKPMB-7386保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)(Russia,117545Moscow,1Dorozhnyproezd,1)。兩種大腸桿菌菌抹，57和57-AglgC,都能夠在L-瓊脂平板上于37°C生長18-24小時。然后可將這些菌株在如上所述的相同條件下培養，只是培養基中不添加異亮氨酸。實施例6由大腸桿菌JM15(ydeD)-AglgC產生L-半胱氨酸產生L-半胱氨酸的大腸桿菌菌抹JM15(ydeD)染色體上的g/gC基因的缺失能夠通過如上所述常規的熟知的方法進行，以獲得菌抹JM15(ydeD)-AglgC。大腸桿菌JM1S(美國專利6，218,168)的衍生物大腸桿菌JM15(ydeD)，能夠用具有;^feD基因的DNA轉化，該基因編碼膜蛋白并且不涉及任何L-氨基酸的生物合成途徑(美國專利5,972,663)。用于評估L-半胱氨酸產生的發酵條件在美國專利6,218,168的實施例6中有詳細描述。實施例7由大腸桿菌B-3996-AglgC產生L-蘇氨酸產生L-蘇氨酸的大腸桿菌菌林B-3996(VKPMB-3996)染色體上的g/gC基因的缺失能夠通過如上所述常規的熟知的方法進行，以獲得菌抹B-3996-AglgC。兩種大腸桿菌菌抹，B-3996和B-3996-AglgC，都能夠在L-瓊脂平板上于37°C生長18-24小時。然后可將這些菌抹在如上所述的相同條件下培養。實施例8由大腸桿菌AJ11442-AglgC產生L-賴氨酸產生L-賴氨酸的大腸桿菌菌抹AJ11442(FERMBP-1543，NRRLB-12185)染色體上的g/gC基因的缺失能夠通過如上所述常規的熟知的方法進行，以獲得菌抹AJ11442-AglgC。將菌抹AJ11442于1981年5月1日保藏在FermentationResearchInstitute,AgencyofIndustrialScienceandTechnology(目前為獨立行政法人產業技術綜合研究所特許微生物保藏中心，TsukubaCentral6,1-1，Higashi1-Chome,Tsukuba-shi，Ibaraki-ken,305-8566，Japan)并且獲得登錄號FERMP-5084。然后才艮據布達佩斯條約的規定于1987年10月29日將其轉為國際保藏，并獲得登錄號FERMBP-1543。兩種大腸桿菌菌才朱，AJ11442和AJ11442-AglgC,都能夠在L-瓊脂平板上于37。C生長18-24小時。然后可將這些菌抹在如上所述的相同條件下培養。實施例9由大腸桿菌AJ12739-AglgC產生L-苯丙氨酸產生L-苯丙氨酸的大腸桿菌菌林AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPMB-8197)染色體上的g/gC基因的缺失能夠通過如上所述常規的熟知的方法進行，以獲得菌抹AJ12739-AglgC。已將菌株AJ12739于2001年11月6曰以登錄號VKPMB-8197保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)(Russia:117545Moscow,1Dorozhnyproezd,1》兩種大腸桿菌菌林，AJ12739和AJ12739-AglgC,都能夠在L-瓊脂平板上于37。C生長18-24小時。然后可將這些菌抹在如上所述的相同條件下培養。實施例10構建含有失活的g/g^X和g/gC4/M喿縱子的菌抹1.缺失g/gj5JT和g/gCAP操縱子通過最4刀由Datsenko,K.A.禾口Wanner,B丄.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12),6640-6645)開發的稱為"Red-驅動的整合"的方法來構建缺失g/gfiX和g/gC4P操縱子的菌林。根據這種方法，構建了與模板質粒中鄰近g/gBX和g/gCAP操縱子的區域和賦予抗生素抗性的基因均互補的PCR引物glgBXCAPL(SEQIDNO:7)和glgBXCAPR(SEQIDNO:8)。將質粒pACYC184(NBLGeneSciencesLtd.,UK)(GenBank/EMBL登錄號X06403)用作PCR中的模板。PCR條件在實施例1中有詳細描述。將在瓊脂糖凝膠中純化的1152-bpPCR產物用于大腸桿菌MG1655(ATCC700926)的電穿孔，該大腸桿菌含有具有溫度敏感復制的質粒pKD46,如實施例1所述。2.通過PCR驗證g/g5Z和g/gC4P操縱子的缺失通過PCR來驗證缺失g/gfiJT和g/gC4尸操縱子并且用Cm抗性基因標記的突變體。將位點特異性引物glgBXCAPl(SEQIDNO:9)和glgBXCAP2(SEQIDNO:IO)在用于驗證的PCR中使用。PCR驗證的條件在實施例1中描述。在使用親本菌抹MG1655glgBXCAP+作為模板的反應中獲得的PCR產物長為9425bp。在使用突變菌株MG1655AglgBXCAP::cat作為模板的反應中獲得的PCR產物長為1208bp(圖3)。實施例11由大腸桿菌菌抹B-3996-AglgBXCAP產生L-蘇氨酸為了測試g/gBX和g/gCAP操縱子的失活對產生蘇氨酸的影響，將來自上述大腸桿菌菌抹MG1655AglgBXCAP::cat染色體的DNA片段通過Pl轉導(Miller,J.H.ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLab.Press,1972,Plainview，NY)轉移至產生蘇氨酸的大腸桿菌菌抹B-3996。兩種大腸桿菌菌抹，B-3996和B-3996-AglgBXCAP,都在L-瓊脂平4反上于37。C生長18-24小時。為了獲得種子培養物，將所述菌林在旋轉搖床(250rpm)上在20x200-mm試管中于32。C培養18小時，該試管含有補加4%葡萄糖的2mlL-肉湯(L-broth)。然后將發酵培養基用0.21ml(10%)種子材料接種。發酵在20x200-mm試管中在用于發酵的2ml基本培養基中進行。將細胞于32。C以250rpm振蕩培養65小時。培養之后，使用以下流動相丁醇-乙酸-水=4:1:1(v/v)通過紙層析測定培養基中積累的L-蘇氨酸的量。將茚三酮(2%)的丙酮溶液用作顯色試劑(visualizingreagent)。將含有L-蘇氨酸的點(spot)剪下，將L-蘇氨酸用0.5%CdCl2水溶液洗脫，并且通過分光光度法于540nm估計L-蘇氨酸的量。十個獨立的試管發酵的結果示于表1。發酵培養基的組成(g/l)如下葡萄糖80.0(NH4)2S0422.0NaCl0.8KH2P042.0MgS04-7H200.8FeS04.7H200.02MnS045H200.02辟u胺素HC10.0002酵母提取物1.0CaC0330.0將葡萄糖和硫酸鎂分別滅菌。CaC03通過180。C2小時干熱滅菌。將pH調節至7.0。在滅菌后將抗生素加入培養基。如下表1中所示，與B-3996相比，B-3996-AglgBXCAP引起較高的L-蘇氨酸積累量。實施例12由大腸桿菌WC196-AglgBXCAP產生L-賴氨酸為了測試g/g5Z和g/gC4P操縱子的失活對產生L-賴氨酸的影響，將來自上述大腸桿菌菌株MG1655AglgBXCAP::cat染色體的DNA片段通過P1轉導(Miller,J.H.ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLab.Press,1972,Plainview,NY)轉移至產生L-賴氨酸的大腸桿菌菌抹WC196(FERMBP-5252)。為了獲得種子培養物，將兩種大腸桿菌菌抹WC196和WC196-AglgBXCAP在旋轉搖床(250rpm)上在20x200-mm試管中于32°C培養18小時，該試管含有2ml與下述發酵培養基相比稀釋兩倍的培養基。然后用0.21ml(10%)種子材料接種發酵培養基。發酵在20x200-mm試管中在用于發酵的2ml基本培養基中進行。將細胞在32。C以250rpm振蕩培養24小時。培養之后，使用以下流動相丁醇-乙酉吏-水=4:1:1(v/v)通過紙層析測定培養基中積累的L-賴氨酸的量。將茚三酮(2%)的丙酮溶液用作顯色試劑。將含有L-賴氨酸的點剪下，將L-賴氨酸用0.5。/。CdCl2水溶液洗脫，并且通過分光光度法在540nm估計L-賴氨酸的量。十個獨立試管發酵的結果示于表2。發酵培養基的組成(g/l)如下葡萄糖40.0(NH4)2S0424.0KH2P041.0MgS04.7H201.0FeS047H200.01MnS04.5H200.01酵母提取物2.0CaC0330.0將葡萄糖、-疇酸鉀和^琉酸鎂分別滅菌。CaC03通過180。C2小時干熱滅菌。將pH調節至7.0。如下表2中所示，與WC196相比，WC196-AglgBXCAP引起較高的L-賴氨酸積累量。盡管已參照本發明的優選實施方案詳細描述了本發明，^旦對本領域內的技術人員顯而易見的是，可在不背離由本發明范圍的前提下進行各種修改，以及使用等價物。本文中所有引用的參考文獻作為本申請的一部分并入以作參考。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>工業適用性根據本發明，能夠提高腸桿菌科細菌的芳族L-氨基酸或非芳族L-氨基酸的產量。權利要求1.腸桿菌科的產生L-氨基酸的細菌，其中已將所述細菌修飾，因而將糖原生物合成途徑破壞。2.根據權利要求l的細菌，其中通過衰減g/gSX和/或g/gC4P操縱子的表達來破壞所述糖原生物合成途徑。3.根據權利要求l的細菌，其中通過將g/gSX和/或g/gC4尸操縱子失活來破壞所述糖原生物合成途徑。4.根據權利要求3的細菌，其中所述g/gSZ和/或g/gC4P搡縱子的失活通過缺失選自下組的基因來進行g/g5、g/gX、g/gC、g/g丄g/gP和它們的組合。5.根據權利要求1的細菌，其中通過衰減g/gS基因的表達來破壞所述糖原生物合成途徑。6.根據權利要求1的細菌，其中通過將g/gS基因失活來破壞所述糖原生物合成途徑。7.根據權利要求l的細菌，其中所述細菌屬于埃希氏菌屬。8.根據權利要求l的細菌，其中所述細菌屬于泛菌屬。9.根據權利要求1的產生L-氨基酸的細菌，其中所述L-氨基酸選自下組芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。10.根據權利要求9的產生L-氨基酸的細菌，其中所述芳族L-氨基酸選自下組L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。11.根據權利要求9的產生L-氨基酸的細菌，其中所述非芳族L-氨基酸選自下組L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-曱硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。12.產生L-氨基酸的方法，包括-在培養基中培養根據權利要求1的細菌以將所述L-氨基酸產生和分泌至培養基中，和-從培養基中收集所述L-氨基酸。13.根據權利要求12的方法，其中所述L-氨基酸選自下組芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。14.根據權利要求13的方法，其中所述芳族L-氨基酸選自下組L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。15.根據權利要求13的方法，其中所述非芳族L-氨基酸選自下組L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-曱硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。全文摘要本發明提供使用腸桿菌科的細菌，尤其是屬于埃希氏菌屬或泛菌屬、具有破壞的糖原生物合成途徑的細菌產生L-氨基酸的方法。文檔編號C12N1/00GK101107355SQ20068000268公開日2008年1月16日申請日期2006年1月18日優先權日2005年1月19日發明者埃卡特里納·A·斯利文斯卡亞,埃爾韋拉·B·沃羅希洛瓦,尤里·I·科茲洛夫,康斯坦丁·V·里巴克申請人:味之素株式會社