牛種布氏菌弱毒疫苗株a19的快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測牛種布氏菌弱毒疫苗株A19的引物組，引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:1-3。本發(fā)明引物組及方法的優(yōu)點如下：1)高效靈敏：在1.5h的時間里，即可完成擴(kuò)增，擴(kuò)增模板的最低檢出限為4.0×10-5ng/μl；2)特異性強(qiáng)：采用Cycling標(biāo)記的熒光探針，特異性針對A19基因組產(chǎn)生熒光擴(kuò)增信號，而對其它種、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常見非布氏菌株，不產(chǎn)生熒光擴(kuò)增信號；3)操作簡便：配置好的Cycleave PCR反應(yīng)體系，置于熒光定量PCR儀中即可完成整個擴(kuò)增及結(jié)果判定過程，不需要通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定；4)高通量：根據(jù)熒光定量PCR儀的檢測孔數(shù)量，可以一次性實現(xiàn)48～384個樣品的檢測。
【專利說明】牛種布氏菌弱毒疫苗株A19的快速檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種牛種布氏菌弱毒疫苗株A19的 Cycleave PCR快速檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 布氏菌病（簡稱"布病"）是由布氏菌引起的一種重要的人畜共患傳染病，不僅給 畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并威脅人類健康。弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段，但弱 毒疫苗的使用往往對布病的診斷和監(jiān)測造成干擾。實現(xiàn)布氏菌弱毒疫苗與野生菌株的鑒 另IJ，對于布病防控工作具有重要現(xiàn)實意義。
[0003] A19株是我國目前在用的布氏菌弱毒疫苗株之一，其鑒別包括血清抗體和病原檢 測兩個方面。A19為光滑型菌株，其LPS含有0-側(cè)鏈，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，對牛有一定的 保護(hù)力，但也使常規(guī)血清學(xué)檢測方法難以區(qū)分疫苗免疫與自然感染。病原分離鑒定，所需營 養(yǎng)條件復(fù)雜，分離培養(yǎng)需在P 2級以上生物安全實驗室進(jìn)行，且難以區(qū)分A19與同生物型的 其它菌株，限制其廣泛應(yīng)用。
[0004] 近年，Real-time PCR技術(shù)發(fā)展迅速，其檢測特異、敏感、操作簡便，為A19的鑒別 提供了新技術(shù)手段。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP)指單個核苷 酸替代、插入或缺失而形成的分子形態(tài)，SNP位點廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌耐藥性基因、細(xì)菌分種 分型、病毒分型等鑒別檢測中。基于Cycling熒光探針的Cycleave PCR方法可以區(qū)分SNP 位點的差異，其檢測具有特異、敏感、快速以及熒光背景低、信噪比高等優(yōu)勢。目前，還沒有 有效的基于Cycling探針鑒別A19的Cycleave PCR擴(kuò)增引物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種牛種布氏菌弱毒疫苗株A19的Cycleave PCR快速檢測 方法，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明首先提供一種用于檢測牛種布氏菌弱毒疫苗株A19的引物組，引物信息如 下：
[0007] ATT-F:CCAGAATGCGAACGGAGATG(SEQ ID N0:1)
[0008] ATT-R:CTTGAGGGCCAGCAGGAG(SEQ ID NO:2)
[0009] ATT-P:GCTCACGGA(SEQ ID NO:3)
[0010] 其中ATT-P的5'端用FAM進(jìn)行標(biāo)記；3'端用Eclipse進(jìn)行標(biāo)記。
[0011] 本發(fā)明還提供一種利用上述的Cycleave PCR引物組檢測A19的方法，包括有如下 的步驟：
[0012] 1)待檢測基因組DNA的提取：用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）提取 細(xì)菌DNA ;
[0013] 2) Cycleave PCR步驟：根據(jù)本發(fā)明設(shè)計A19的Cycleave PCR引物組，加入反應(yīng)體 系中各組分。反應(yīng)程序：95°C 30s ;95°C 5s，55°C 10s，72°C 20s,在72°C進(jìn)行FAM熒光信號 采集，進(jìn)行40個循環(huán)。
[0014] 3)結(jié)果檢測：根據(jù)熒光擴(kuò)增曲線情況，判定檢測結(jié)果。
[0015] 另一方面，本發(fā)明的Cycleave PCR引物組可用于制備檢測試劑盒。
[0016] 本發(fā)明引物組及方法的優(yōu)點如下：1)高效靈敏：在1. 5h的時間里，即可完成擴(kuò)增， 擴(kuò)增模板的最低檢出限為4. 0Xl(T5ng/μ 1 ;2)特異性強(qiáng)：采用Cycling標(biāo)記的熒光探針， 特異性針對A19基因組產(chǎn)生熒光擴(kuò)增信號，而對其它種、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗 及常見非布氏菌株，不產(chǎn)生熒光擴(kuò)增信號； 3)操作簡便：配置好的Cycleave PCR反應(yīng)體系， 置于熒光定量PCR儀中即可完成整個擴(kuò)增及結(jié)果判定過程，不需要通過瓊脂糖凝膠電泳鑒 定；4)高通量：根據(jù)熒光定量PCR儀的檢測孔數(shù)量，可以一次性實現(xiàn)48?384個樣品的檢 測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1 :陽性結(jié)果熒光擴(kuò)增曲線圖，其中：曲線1.陽性對照，即A19基因組的熒光擴(kuò) 增曲線；曲線2.陰性對照，即水的熒光擴(kuò)增曲線。
[0018] 圖2 :Cycleave PCR方法檢測A19基因組DNA的靈敏度檢測熒光擴(kuò)增曲線圖， 其中：曲線1-8. A19基因組DNA的質(zhì)量濃度分別為40ng/y l，4ng/y 1,4. 0X10_1ng/y 1， 4· 0 X 10_2ng/ μ 1，4· 0 X 10_3ng/ μ 1,4· 0 X l(T4ng/ μ 1，4· 0 X 10-5ng/ μ 1,4· 0 X 10_6ng/ μ 1 ; 曲線9.陰性對照。
[0019] 圖3 :CyCleave PCR方法檢測Α19基因組DNA的特異性檢測熒光擴(kuò)增曲線圖，其 中：曲線 l，Brucella suis biovar 1 Sl33〇;曲線 2，B.suis biovar 2Thomsen;曲線3,8· suis biovar 3 686;曲線 4，B. suis biovar 4 40;曲線 5, B. abortus biovar 1 A544; 曲線 6, B. abortus biovar 2 部/8/59 ;曲線 7, B. abortus biovar 3 Tulya ;曲線 8, B. abortus biovar 4 292 ;曲線 9，B_ abortus biovar 5B31%;曲線 10, B. abortus biovar 6 870 ;曲線 11，B_ abortus biovar 7 63/75 ;曲線 12, B. abortus biovar 9C68 ;曲線 13, B. melitensis biovar 1 16M;曲線 14，B_melitensis biovar 2 63/9;曲線 15，B. melitensis biovar 3 Ether ;曲線 16, B_ ovis 63/290 ;曲線 17, B_ canis RM6/66 ;曲線 18, B. neotomae 5K33 ;曲線 19, S2 ;曲線 20, 104M ;曲線 21，M5-90 ;曲線 22, Escherichia coli K99 ;曲 線 23, Pasteurella multocida C48-1 ;曲線 24, Str印tococcus suis ST171 ;曲線 25， Pseudomonas aeruginosa DI-1 ;曲線26，陽性對照；曲線；27,陰性對照。

【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0021] 一、用于檢測A19的Cycleave PCR引物組的設(shè)計
[0022]牛種布魯氏菌A19株于1923年由美國自牛奶中分離，經(jīng)實驗室自然傳代減毒后， 成為一株毒力穩(wěn)定的弱毒菌株，是我國在用的布氏菌弱毒疫苗株之一。S19是在A19的基 礎(chǔ)上篩選出的赤蘚糖醇敏感株，兩者基因組比較，S19較A19存在Ery基因缺失，而我國目 前未推廣S19株弱毒疫苗。本發(fā)明首先根據(jù)GeneBank中公布的S19全基因組序列，經(jīng)與 GeneBank中其它布氏菌株全基因組序列BLAST比對，分析獲得S19SNP位點，再測序鑒定 A19基因組中對應(yīng)SWSNP位點處的核苷酸序列。之后，選擇經(jīng)鑒定存在的A19SNP位點，與 我國布氏菌地方流行株和常用布氏菌弱毒疫苗株相應(yīng)SNP處核苷酸序列測序比較，驗證該 SNP的A19特異性。經(jīng)上述篩選，本發(fā)明獲得Att基因上一處A19特異的SNP位點。
[0023] 本發(fā)明依據(jù)Att基因上A19特異的SNP位點，在其兩翼用CpleaTe?PCR Assay Designer軟件進(jìn)行引物與探針設(shè)計。設(shè)計合適的引物是進(jìn)行PCR反應(yīng)的關(guān)鍵，通過考慮堿 基組成、GC含量、二級結(jié)構(gòu)的形成、Tm值等因素來設(shè)計檢測A19的Cycleave PCR反應(yīng)的引 物及探針。其中，引物用于擴(kuò)增Att片段基因，探針用于檢測該Att片段基因中SNP位點存 在與否。用上述引物及探針進(jìn)行檢測時，當(dāng)布氏菌基因組DNA中，存在SNP位點時，擴(kuò)增后 出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，可判定該模板來源于A1 9株；當(dāng)布氏菌基因組DNA中不含SNP位點或模 板本身為非布氏菌時，擴(kuò)增后不出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線。引物及探針由大連寶生物工程有限公 司合成。引物及探針如表1所示：
[0024] 表 1 :A19 的 Cycleave PCR 引物及探針
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測牛種布氏菌弱毒疫苗株A19的引物組，其特征在于，所述的引物組的 序列信息如下： ATT-F:CCAGAATGCGAACGGAGATG, ATT-R:CTTGAGGGCCAGCAGGAG, ATT-P:GCTCACGGA。
2. 如權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于，所述的ATT-P的5'端用FAM進(jìn)行標(biāo)記； 3'端用Eclipse進(jìn)行標(biāo)記。
3. 權(quán)利要求1所述的引物組在檢測牛種布氏菌弱毒疫苗株A19中的應(yīng)用。
4. 一種利用權(quán)利要求1所述的引物組檢測牛種布氏菌弱毒疫苗株A19的方法，其特征 在于，所述的方法包括有如下的步驟： 1) 待檢測基因組DNA的提取：用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA ; 2. Cycleave PCR步驟：將權(quán)利要求1所述的引物組加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)程序為 95°C 30s ;95°C 5s，55°C 10s，72°C 20s，在72°C進(jìn)行FAM熒光信號采集，進(jìn)行40個循環(huán)； 3) 結(jié)果檢測：根據(jù)熒光擴(kuò)增曲線情況，判定檢測結(jié)果。
5. -種檢測牛種布氏菌弱毒疫苗株A19的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含有 權(quán)利要求1所述的引物組。
【文檔編號】C12N15/11GK104232783SQ201410521587
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】陳義平, 南文龍, 譚鵬飛, 鞏明霞, 張風(fēng)霞, 張悅勇 申請人:中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心