專利名稱：一種基于拉曼光譜檢測人乳腺癌細胞mcf-7的細胞探針復合物及其制備方法
技術領域：
本發明屬于細胞檢測技術領域，具體而言，涉及ー種利用表面增強拉曼信號檢測人乳腺癌MCF-7細胞的細胞探針復合物及其制備方法。
背景技術：
癌癥是導致人類死亡的ー種重要原因，據世界衛生組織統計，毎年約有700萬人死于各類癌癥疾病。在女性當中，乳腺癌是ー種發病率最高的癌癥疾病，且近年來乳腺癌的發病率呈明顯上升趨勢，2008年全球乳腺癌的發病率高達41. 4%。乳腺癌的早期診斷和治療對于降低乳腺癌死亡率，提高疾病患者5年存活率具有極其重要的意義。癌癥是ー種控制細胞生長増殖機制失常而引起的疾病，其發生與發展與細胞的狀態密切相關。在各類癌癥疾病中，癌細胞的生長與分裂速度遠遠超過正常細胞，還會局部侵入周遭正常組織，甚至經由體內循環系統或淋巴系統轉移到身體其他部分。因此，發展ー種可靠的、靈敏的檢測人乳腺癌細胞的方法對于實現乳腺癌的早期診斷、篩查、治療及預后意義重大。在當前的乳腺癌醫學診斷方法中，影像技術是ー種最為常見的有效方法。但是影像技術也有其明顯的不足，如難以分辨ー些病理性特征相同或相近的癌細胞，難以靈敏的檢測到癌癥早期癌細胞水平較低時的癌變細胞等。而提高檢測的特異性及靈敏度對于癌癥的早期診斷治療作用重大，因此越來越多的工作傾向于從單細胞、單分子水平上對癌細胞進行檢測。目前對單細胞研究的技術主要包括熒光光譜技術、掃描探針顯微技木、微流控技術、毛細管電泳技術等，但大多數技術存在侵入性，會對細胞產生破壞。光學技術具有無侵入、無電離輻射、允許多種模式成像、可獲得實時與定量等多種信息的特點，在生命科學研究中占有越來越重要的地位。目前已經在生物醫學領域中得到應用的光譜技術主要有紫外可見吸收光譜、紅外光譜、熒光光譜、拉曼光譜等。拉曼光譜與其它光譜相比具有ー些突出的優點，如穩定性高、不易猝滅、可用紅光激發、對生物樣品損壞小、不受生物樣品自身熒光及水的干擾等，因而尤其適合于細胞樣品的研究。提高拉曼光譜方法的靶向性對于提高檢測的特異性和靈敏度十分重要。癌細胞的細胞膜表面通常具有ー些與正常細胞不具有的蛋白或者糖基，常用的標志物包括表皮生長因子受體、磷酸酶及葉酸受體等。適體(aptamer)是用配體指數富集法系統演化(SELEX)技術從人工體外合成的隨機寡核苷酸序列庫中反復篩選得到的能以極高的親和カ和特異性與靶分子結合的一段寡核苷酸序列，可以與蛋白質甚至整個細胞發生特異性結合作用。將這些癌細胞標志物的核酸適體進行表面增強拉曼的功能化并與癌細胞相互作用，可實現基于表面增強拉曼光譜的高靈敏度、高特異性的癌細胞靶向檢測
發明內容
本發明的目的是提供一種拉曼光譜檢測人乳腺癌細胞MCF-7的細胞探針復合物及其制備方法，通過開發一種功能化的乳腺癌細胞適體-納米復合材料(Au-Ag-aptamer),并基于所述納米復合材料制成細胞探針復合物(Rh 6G-Au-Ag-aptamer),由于納米復合材料具有強的表面拉曼增強作用，適體和細胞表面標志物間的強的專ー性作用，細胞探針復合物對人乳腺癌細胞MCF-7有高度的選擇性，可用于基于表面增強拉曼信號的乳腺癌細胞MCF-7的高靈敏度、高特異性檢測。完成上述發明任務的技術方案是
一種基于拉曼光譜檢測人乳腺癌細胞MCF-7的細胞探針復合物(Rh6G-Au-Ag-aptamer)，其特征在于，所述的探針復合物以核酸適體(S2.2，序列為5’ -GCAGTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G - 3’)為模板，其堿基上沉積金/銀雙金屬合金納米粒子，納米粒子表面固載拉曼信號分子羅丹明6G。所述的細胞探針復合物Rh 6G-Au_Ag-aptamer其粒徑約為20 120nm。所述的細胞探針復合物Rh 6G-Au-Ag_aptamer按以下方法合成
將核酸適體S2. 2溶解在磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7. 4)中，加入一定體積比的NaAuCl4和AgNO3溶液(體積比I飛1)，混合并攪拌均勻，在暗處放置12小時以上，置于紫外燈下光照5 min至60 min,形成Au-Ag-aptamer納米復合物；將羅丹明6G (Rh 6G)溶液加入到Au-Ag-aptamer納米復合物分散液中，避光攪拌后離心處理，用PBS洗滌除去未吸附的Rh6G分子,得到所述的探針復合物(標記為Rh 6G-Au-Ag-aptamer)。所述的Rh 6G-Au-Ag-aptamer納米探針復合材料的制備方法具體包括以下步驟
1)將核酸適體(S2.2，序列為 5，-GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3，)用 O. Imo I/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7. 4)溶解，濃度為300 ng/mL ；
2)將一定量的NaAuCl4(lmmol/L)和AgNO3 (lmmol/L)溶液按一定體積比混合(體積比廣5 :1)，將混合液加入到I)所述的核酸適體溶液中，在4°C下連續攪拌O. 5 - 2小時，并在暗處避光保存12h以上，使Au3+和Ag+吸附到核酸適體的堿基上得到Au3+-Ag+-aptamer復合物；
3)將Au3+-Ag+-aptamer復合物在波數為254nm的紫外燈下光照5min-60min,溶液顏色由無色逐漸變為藍色，得到Au-Ag-aptamer納米復合物；
4)將Rh6G溶液加入到Au-Ag-aptamer納米復合物分散液中，控制Rh 6G的最終濃度為I μ mol/L的,在4°C下避光攪拌Ih,離心處理后(轉速為10000轉/分，時間10 min),用
O.I mol/L PBS溶液(pH 7. 4)洗漆去除未吸附的Rh 6G分子，得到Rh 6G-Au-Ag-aptamer探針復合物。所述的步驟2)中，混合后核酸適體溶液中Ag+與核酸適體堿基的物質量比優選為1:5。本發明利用光催化的方法對人乳腺癌MCF-7細胞適體進行功能化，在適體核酸鏈上合成金和銀的雙金屬合金納米粒子(Au-Ag NPs)，并修飾上拉曼信號分子Rh 6G制備得到MCF-7細胞拉曼光譜檢測的分子探針，利用適體與MCF-7細胞的特異性靶向結合能力及適體表面的金/銀雙金屬合金納米粒子對Rh 6G分子拉曼信號的增強作用，可用于對MCF-7細胞的有效檢測。核酸適體S2. 2與MCF-7細胞具有特異性靶向結合能力，有關核酸適體S2. 2可參、見· C. Yu, Y. Hu, J. H. Duan, ff. Yuan, C. Tang, H. Y. Xu, X. D. Yang, Plos One,2011，6，e24077。
所述的探針復合物具有高度的與人乳腺癌細胞MCF-7的靶向結合能力，及高的表面增強拉曼活性。該探針復合物的表面增強拉曼光譜上存在羅丹明分子的特征吸收峰。可按以下所述的方法,將Rh 6G-Au-Ag_aptamer探針復合物與MCF-7細胞作用并進行增強拉曼光譜檢測
I)人乳腺癌細胞MCF-7的培養將MCF-7細胞貼壁生長于DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle medium)培養液中，其中含牛胚胎血清10%(v/v)、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μ g/mL，在37°C、5%的培養箱中培養。觀察細胞生長，當細胞長到90%左右使進行傳代。傳代吋，去除培養液，用PBS溶液洗滌3次，加入I mL O. 25%的胰蛋白酶37 °C恒溫消化3min，取適量細胞懸液加入新培養基中繼續培養，隔天換液，用細胞計數器控制細胞個數在IX IO5個/mL,除去培養液，用PBS溶液洗滌3次后，細胞待用。2)將所述Rh 6G-Au-Ag-aptamer探針復合物在PBS溶液中(pH 7.4)中分散濃度為O. lmg/mL，取100 μ L加入到I)中所述的細胞中，在室溫下孵育30 min，依次用3 mL PBS溶液洗滌細胞3-5次，去除未和細胞作用的探針復合物。3)在所述步驟2)中的細胞中，加入I mL O. 25%的胰蛋白酶，室溫下消化3 min,在1000轉/分下離心10 min，去除上清液，加入I mL PBS，使其形成均勻的細胞懸液，取10μL該細胞懸液將其滴涂到新鮮制備的云母片表面，避光保存，采用表面增強拉曼光譜技術檢測MCF-7細胞，檢測波長為785 nm，檢測波數范圍為400-4000 cnT1，采集時間為10 S。按照以上方法制得的Rh 6G-Au-Ag_aptamer復合物在透射電鏡圖上典型情況下呈DNA鏈狀分布，與細胞作用后，對細胞的表面進行表面增強拉曼光譜檢測，圖譜上出現明顯的信號分子Rh 6G的特征拉曼信號峰。本發明具有以下優點本發明的基于表面增強拉曼信號的人乳腺癌MCF-7細胞的探針復合物Rh 6G-Au-Ag-aptamer納米復合物對MCF-7細胞有高的特異性識別能力和拉曼信號增強能力，通過對拉曼信號的監測可實現對MCF-7癌細胞的檢測。該細胞探針及其檢測方法具有特異性強、靈敏度高等特點，在生理學、病理學、臨床學的研究中具有重要意義。


圖I Au-Ag-aptamer納米復合物的透射電鏡圖。圖2 Rh 6G-Au-Ag_aptamer復合物探針與MCF-7細胞作用后，細胞表面的透射電鏡圖。圖3基于探針復合物表面增強拉曼信號的人乳腺癌MCF-7細胞的拉曼光譜圖。
具體實施例方式實施例I
將核酸適體(S2. 2，序列為 5’ -GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3，)用 O. Imol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7. 4)溶解，濃度為 300 ng/mL ;將 lmol/L 的 NaAuCl4 和 Imol/L AgNO3溶液按體積比為1:1混合均勻后，加入到核酸適體溶液中，該混合液中Au3+、Ag+及堿基的物質量比為1:1:5，將該混合液在4°C下連續攪拌O. 5 - 2小吋，并在暗處避光保存12h,將其轉移至IcmXlcm的石英比色皿中，在波數為254 nm的紫外燈下光照30min,得到Au-Ag-aptamer納米復合物；配置O. I mol/L的Rh 6G甲醇溶液，并將其加入到Au-Ag-aptamer納米復合物分散液中，控制Rh 6G的最終濃度為I μ mol/L的,在4°C下避光攪拌lh，以10000轉/分的轉速離心10 min，用O. I mol/L PBS溶液(pH 7. 4)洗滌沉淀共3遍,去除未吸附的Rh 6G分子,得到Rh 6G-Au_Ag-aptamer探針復合物，TEM照片顯示所得的復合物呈鏈狀分布，粒徑均一，約為20 nm。實施例2
將核酸適體(S2. 2，序列為 5’ -GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3，)用 O. Imol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7. 4)溶解，濃度為 300 ng/mL ;將 lmol/L 的 NaAuCl4 和 Imol/L AgNO3溶液按體積比為2:1混合均勻后，加入到核酸適體溶液中，該混合液中Au3+、Ag+ 及堿基的物質量比為2:1:5，將該混合液在4°C下連續攪拌0. 5 - 2小吋，并在暗處避光保存12h,將其轉移至IcmXlcm的石英比色皿中，在波數為254 nm的紫外燈下光照30min,得到Au-Ag-aptamer納米復合物；配置0. I mol/L的Rh 6G甲醇溶液，并將其加入到Au-Ag-aptamer納米復合物分散液中，控制Rh 6G的最終濃度為I μ mol/L的,在4°C下避光攪拌lh，以10000轉/分的轉速離心10 min，用0. I mol/L PBS溶液(pH 7. 4)洗滌沉淀共3遍,去除未吸附的Rh 6G分子,得到Rh 6G-Au_Ag-aptamer探針復合物,TEM照片顯示所得的復合物呈鏈狀分布，粒徑均一，約為40 nm。實施例3
將核酸適體(S2. 2，序列為 5’ -GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3，)用 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7. 4)溶解，濃度為 300 ng/mL ;將 lmol/L 的 NaAuCl4 和 Imol/L AgNO3溶液按體積比為4:1混合均勻后，加入到核酸適體溶液中，該混合液中Au3+、Ag+及堿基的物質量比為4:1:5，將該混合液在4で下連續攪拌0. 5 - 2小時，并在暗處避光保存12h,將其轉移至IcmXlcm的石英比色皿中，在波數為254 nm的紫外燈下光照30min,得到Au-Ag-aptamer納米復合物；配置0. I mol/L的Rh 6G甲醇溶液，并將其加入到Au-Ag-aptamer納米復合物分散液中，控制Rh 6G的最終濃度為I μ mol/L的,在4°C下避光攪拌lh，以10000轉/分的轉速離心10 min，用0. I mol/L PBS溶液(pH 7. 4)洗滌沉淀共3遍,去除未吸附的Rh 6G分子,得到Rh 6G-Au_Ag-aptamer探針復合物,TEM照片顯示所得的化合物呈鏈狀分布，粒徑均一，約為100 nm。實施例4
實施例4中，除在紫外燈下光照時間為5 min，其他操作均與實例3相同，TEM照片上顯示出有極少量顆粒狀物質存在。實施例5
實施例5中，除在紫外燈下光照時間為15 min，其他操作均與實例3相同，TEM照片上顯示出有少量顆粒狀物質存在，未呈鏈狀分布。實施例6
實施例6中，在紫外燈下光照時間為60 min，其他操作均與實例3相同，化合物出現聚沉現象，TEM照片顯示所得的化合物呈樹枝狀。
實施例7
將實施例3制備的Rh 6G-Au-Ag-aptamer探針復合物與MCF-7細胞作用，利用表面增強拉曼光譜技術檢測 MCF-7細胞。首先培養MCF-7細胞將MCF-7細胞貼壁生長于DMEM (Dulbecco，s modifiedEagle medium)培養液中，其中含牛胚胎血清10%(v/v)、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μ g/mL，在37°C、5%的培養箱中培養。觀察細胞生長，當細胞長到90%左右使進行傳代。傳代吋，去除培養液，用PBS溶液洗滌3次，加入I mL O. 25%的胰蛋白酶37°C恒溫消化3min，取適量細胞懸液加入新培養基中繼續培養，隔天換液，用細胞計數器控制細胞個數在IX IO5個/mL,除去培養液，用PBS溶液洗滌3次后，細胞待用。將實施例3中所制得的Rh 6G-Au-Ag-aptamer探針復合物在PBS溶液中(pH 7. 4)中分散，濃度為O. lmg/mL，取100 μ L分散液加入到I X IO5個MCF-7細胞中，在室溫下孵育30 min，用吸管吸去未和細胞作用的探針復合物，并用3 mL PBS溶液洗滌細胞3_5次。將和探針復合物作用后的細胞用I mL O. 25%的胰蛋白酶在室溫下消化3 min,以1000轉/分離心10 min后，去除上清液，再加入I mL PBS溶液，使其形成均勻的細胞懸液，取10 μ L該細胞懸液將其滴涂到新鮮制備的云母片表面，采用表面增強拉曼光譜技術檢測MCF-7細胞，檢測波長為785 nm，波數范圍400-4000 cnT1，采集時間為10 S。實驗結果表明，MCF-7細胞的拉曼光譜圖上出現到明顯的拉曼信號分子Rh 6G的拉曼峰。實施例8
將實施例1、2制備得到的Rh 6G-Au-Ag-aptamer探針復合物在與實施例7相同的條件下與MCF-7細胞作用，利用表面增強拉曼光譜技術檢測MCF-7細胞。實驗結果表明它們拉曼光譜圖上也能夠得到特征峰位置相似、但強度較為弱的Rh 6G的拉曼信號。
權利要求
1.一種基于拉曼光譜檢測人乳腺癌細胞MCF-7的細胞探針復合物，其特征在于，所述的探針復合物以序列為5’ -GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G - 3’的核酸適體S2. 2為模板，其堿基上沉積金/銀雙金屬合金納米粒子，納米粒子表面固載拉曼信號分子Rh 6G。
2.根據權利要求I所述的細胞探針復合物，其特征在于，所述的細胞探針復合物其粒徑為20 120nm。
3.根據權利要求I所述的細胞探針復合物，其特征在于，所述的細胞探針復合物按以下方法合成將核酸適體S2. 2溶解在pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入體積比I飛1的NaAuCl4和AgNO3溶液，混合并攪拌均勻，在暗處放置12小時以上，置于紫外燈下光照5 min至60 min,形成Au-Ag-aptamer納米復合物；將Rh 6G溶液加入到Au-Ag-aptamer納米復合物分散液中，避光攪拌后離心處理，用PBS洗滌除去未吸附的Rh 6G分子，得到所述的探針復合物。
4.一種權利要求I所述的人乳腺癌細胞MCF-7的細胞探針復合物的制備方法，其特征在于，將序列為5’ -GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3’的核酸適體S2. 2溶解在pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入體積比I飛I的NaAuCl4和AgNO3溶液，混合并攪拌均勻，在暗處放置12小時以上,置于紫外燈下光照5 min至60 min,形成Au-Ag-aptamer納米復合物；將Rh 6G溶液加入到Au-Ag-aptamer納米復合物分散液中，避光攪拌后離心處理，用PBS洗滌除去未吸附的Rh 6G分子，得到所述的探針復合物。
5.根據權利要求4所述的人乳腺癌細胞MCF-7的細胞探針復合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將序列為5’ - GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G - 3’ 的核酸適體 S2. 2 用 O. Imo I/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7. 4)溶解，濃度為300 ng/mL ； 2)將lmol/LNaAuCl4和lmol/L AgNO3溶液按體積比I 5 1混合，并加入到步驟I)中的核酸適體溶液中，在4°C下連續攪拌O. 5 - 2小時，并在暗處避光保存12h以上，使Au3+和Ag+吸附到核酸適體的堿基上，得到Au3+-Ag+-aptamer復合物； 3)將Au3+-Ag+-aptamer復合物在波數為254nm的紫外燈下光照5min-60min,溶液顏色由無色逐漸變為藍色，得到Au-Ag-aptamer納米復合物； 4)將Rh6G溶液加入到Au-Ag-aptamer納米復合物分散液中，控制Rh 6G的最終濃度為lymol/L，在4°C下避光攪拌lh，離心處理后用O. I mo I/L PBS溶液(pH 7. 4)洗滌去除未吸附的Rh 6G分子,得到所述的探針復合物Rh 6G-Au-Ag-aptamer。
6.根據權利要求5所述的人乳腺癌細胞MCF-7的細胞探針復合物的制備方法，其特征在于，所述的步驟2)中，混合液中Ag+與適體DNA的堿基的物質量比為1:5。
全文摘要
本發明公開了一種基于拉曼光譜檢測人乳腺癌細胞MCF-7的細胞探針復合物及其制備方法。所述的探針復合物以和MCF-7細胞靶向作用的核酸適體為模板，通過光催化方法在其DNA鏈的堿基上沉積金和銀的雙金屬合金納米粒子，并在納米粒子表面固載拉曼信號分子羅丹明6G(Rh6G)。透射電子顯微鏡照片顯示探針復合物的結構為鏈狀，并具有和MCF-7細胞靶向結合的能力。將MCF-7細胞和所述的探針復合物作用，其拉曼光譜出現羅丹明6G的特征吸收峰，能有效、靈敏及特異性的檢測人乳腺癌MCF-7細胞。
文檔編號C12N15/115GK102621125SQ20121008037
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月24日 優先權日2012年3月24日
發明者吳萍, 張卉, 蔡稱心 申請人:南京師范大學