來自冷凍的臍帶組織的活細胞的制作方法

文檔序號：433173閱讀：433來源：國知局

專利名稱：來自冷凍的臍帶組織的活細胞的制作方法
技術領域：
本發明聚焦于從臍帶(UC)結締組織中收獲一群快速增殖的人細
胞；處于成骨、軟骨形成、生脂和生肌條件中的這樣的細胞的培養物；如它們缺少細胞表面組織相容性抗原所示的，證明了在這些細胞群中高百分比的細胞是無免疫能力的；以及這些細胞用作多能祖細胞的來源用于多種基于細胞的治療的能力。更特別地，本發明涉及冷凍的組織作為上述有價值的祖細胞來源的應用。
背景技術：
UC是在原腸胚形成(三胚層形成)后所最初形成的一種結構。當折疊開始時，胚盤經卵黃和尿嚢血管通過原始中腸(胚胎起源)與原始卵黃嚢(胚胎外起源)相連接，所述血管接著發育形成臍血管(Haynesworth 等，1998; Pereda和Motta, 2002; Tuchmann-Duplessis等，1972)。這些血管被稱為臍帶膠質(WJ)的通常被認為是主要由胚外來源的原始間充質組織所支持并被其環繞(Weiss， 1983)。在妊娠期間，從該早期開始UC生長直至變成在分娩中所見的30-50cm的臍帶。因此，預計 WJ不僅含有已在文獻(參見下文)中描述的成纖維細胞樣或肌成纖維細胞樣細胞，還含有能產生在胚胎和胎兒發育期間為支持臍帶生長所必需的擴增體積的WJ的細胞的祖細胞群。
Thomas Wharton首次描述了 WJ，其在1656年出版了他的論文 Adenographia (Wharton TW. Adenographia. Freer S.譯(1996). Oxford, U.K.: Oxford University Press, 1656; 242-248)。隨后，其被定義為由分散于由包括透明質酸在內的蛋白聚糖(Schoenberg等，1960)和不同類型的膠原(Nanaev等，1997)組成的無定形基質中的細胞所組成的膠狀的、松散的粘液性結締組織。分散于該基質中的細胞已被描迷為是在萎陷的臍帶中呈星狀以及在擴張的臍帶中拉長的"成纖維細胞樣" (Parry, 1970)。最初在基質中觀察到平滑肌細胞(Chacko和Reynolds, 1954),盡管Parry(1970)對此有爭議，他將它們描述為在表面上類似于平滑肌細胞的有些"不尋常的成纖維細胞"。此后，在1993年Takechi等(1993)對這些細胞進行免疫組織化學研究之前，4艮少進行鑒定這些細胞的工作。他們將這些細胞描述為是"在無定形基質中"具有長胞質突的紡錘狀或星狀以及膠原纖維波形網絡"的"成纖維細胞樣"(Takechi 等，1993)。為了免疫組織化學染色，他們使用了針對肌動蛋白和肌球蛋白(胞質可收縮蛋白)、波形蛋白(胚胎間充質起源的成纖維細胞特有的)以及結蛋白(特異于肌原性起源的細胞)的第一抗體，以便確定哪些類型的肌球蛋白與WJ成纖維細胞相關。他們觀察到高水平的化學上可提取的肌動球蛋白；盡管成纖維細胞含有胞質肌動球蛋白，但是它們對肌動蛋白或肌球蛋白沒有染色，而WJ成纖維細胞則對兩者染色陽性。此外，觀察到對于波形蛋白和結蛋白兩者染色陽性，得出WJ中這些改變的成纖維細胞來源于原始間充質組織的結論(Takechi等，1993)。隨后，Nanaev等(1997)更近一些的研究證實了在早產臍帶中增殖的間充質細胞祖細胞的五步分化。他們的發現支持了肌成纖維細胞存在于 WJ基質中的提議。WJ細胞的免疫組織化學鑒定表明非常類似于已知是骨形態發生中成骨細胞主要來源的周細胞，并且還可以在培養物中形成稱為集落形成單位-成骨細胞(CFU-O)(Aubin, 1998)的骨小結(bone nodules) (Canfield等，2000)。
等(Mitchell等，2003)描述了一種方法，其中他們首次取出并棄去臍血管以收獲殘留的組織。然后將包括殘留的WJ(由于臍血管完整地包裹在 WJ中，因此WJ中的一部分已與血管一起丟棄)和羊膜上皮的殘留的組織切塊以產生被轉移到組織培養i中的小的組織碎片。接著將這些組織碎片用作為細胞從中遷移到培養基上的原始外植體。
在另一篇出版物中，Romanov等(2003)指出他們成功地從臍帶血管系統中分離了間充質干細胞樣細胞，盡管他們還指出他們的培養物不含有來自WJ的細胞。具體來說，自臍靜脈內部他們使用了單次15分鐘的膠原酶消化，其產生了混合的一群血管內皮和內皮下細胞。 Romanov等表明在7天后少量成纖維細胞樣細胞出現在該細胞收獲物中。
同樣，美國專利5，919,702描述了一種從人UC的WJ中分離"前軟骨細胞"的方法，以及它們用于產生軟骨的用途。具體來說，該方法包括沿縱向在臍帶上切開1英寸的切口，剝離血管并'拉出，，然后棄去，并將WJ收集在無菌容器中，在其中切成2-3mi^切片供培養用。在一種優選的方法中，通過將WJ的2-3mn^切片放置于培養亞底部的載玻片上，用另一片載玻片覆蓋，并培養10-12天以便使'前軟骨細胞，遷移到培養亞表面，從而分離細胞。
在2005年7月7日公開的美國專利申請US2005/0148074中,Davies 等描述了從被稱為血管周圍區的特定區中的臍帶膠質分離獨特的祖細胞群。在該區中的臍帶膠質位于臍帶血管外壁上或與之結合，當血管從臍帶切離時仍保持與它們結合。該祖細胞群具有非常短的倍增時間，并包含具有多種有價值的特性的祖細胞，包括多能細胞以及產生包括脂肪、骨、軟骨、肌肉和內皮組織在內的多種間充質組織的細胞；自發分化為骨形成成骨細胞的細胞；和缺少MHC I類和II類標記的細胞。獲得自人臍帶血管系統的血管周圍區中臍帶膠質的祖細胞在此稱為 HUCPVCs。
因此，預示臍帶組織是祖細胞以及用于組織工程學和其他醫學方法的其他細胞的重要來源。當前實踐容許臍帶來源的細胞在低溫條件下得以更長時間的保存，并從其中回收活細胞。然而，迄今所開發的
臍帶細胞自身。因::在需要從臍4組織中回:活細胞情況下，、:臍帶組織是新鮮時，通常在臍帶提取24小時之內，技術人員必須迅速行動來處理臍帶組織，使得所需的組織能被提取，并且所需的細胞亦能分離、培養并冷凍保存，期間那些細胞仍有活性。顯然，提供一種容
發明概述
現已證實活細胞可回收自已冷凍的臍帶組織。因此，本發明考慮到在分娩后的基礎上低溫"儲藏"上述組織的習慣，提供了一種用于從冷凍的臍帶組織中按需提取活細胞的穩定方法。
更特別地，并根據其的一個方面，本發明包括獲得分娩后臍帶組織，以及冷凍分娩后臍帶組織的步驟。在一個優選的方面中，使用一種包括獲得包含活細胞的臍帶組織，將臍帶組織與含有含血清細胞培養基和低溫防護劑的低溫防護溶液組合，并對組合物進行冷凍處理，其中組合物首先在容許低溫防護劑滲入組織的時間和溫度下作為液體冷卻，然后冷凍該冷卻的組合物，并接著在低溫條件下保存冷凍的組合物的步驟的方法，本發明適用于保持存在于臍帶組織中細胞的存活力。
根據其的另一個方面，本發明提供了一種用于從臍帶組織中獲得活細胞的方法，包括以冷凍形式獲得上述組織，解凍所冷凍的組織并從解凍的組織中提取活細萬包的步驟。在一個優選的方面中，^吏用一種包括獲得冷凍的臍帶組織，并任選地低溫保存，特別是通過本發明的方法低溫保存，解凍所冷凍的組織，洗滌解凍的組織以除去低溫防護劑并從所得到的組織中提取活細胞的步驟的方法，本發明適用于從臍帶組織中回收活細胞。
因此，在其的另一個方面中，本發明提供了一種用于從臍帶組織中獲得活細胞的方法，其中該細胞提取自之前冷凍的臍帶組織。
在一個進一步的方面中，本發明提供了以冷凍狀態及任選地以低溫保存狀態存在的臍帶組織，所述臍帶組織包含只要是通過本發明的方法制備就能以存活狀態回收的祖細胞。
在本發明的一個相關方面中，提供了以包含多個容器和注明每個容器內含物的目錄的組織庫形式存在的臍帶組織，其中每個容器包含所述冷凍的臍帶組織的樣品。在一個特定的實施方案中，容器為適合于低溫保存的容器。
在一個進一步的方面中，本發明提供了一種包括從之前冷凍的臍帶組織中獲得活細胞，并從那些活細胞中選擇是祖細胞的細胞的步驟
的方法。在一個特定的方面中，祖細胞為HUCPVCs，并且本發明提供了一種用于從冷凍的臍帶組織中回收活HUCPVCs的方法，包括步驟1)獲得冷凍的臍帶組織，該冷凍的臍帶組織任選地為低溫保存的臍帶組織，其中臍帶組織為具有締合的血管周圍臍帶膠質的新鮮的、分離的人臍帶血管或其片段，并已通過包括下述步驟的方法得以制備
a) 獲得所述臍帶組織，
b) 將臍帶組織與含有含血清細胞培養基和DMSO的^氐溫防護溶液組合，
c) 對組合物進行冷卻處理，其中組合物在容許DMSO滲入組織的時間和溫度下作為液體^皮冷卻，
d) 冷凍所冷卻的組合物以提供冷凍的臍帶組織，并任選地，
8e)在低溫條件下保存所冷凍的臍帶組織一段時間；并接著
2) 使冷凍的臍帶組織解凍；
3) 處理解凍的臍帶組織以用水置換DMSO;以及
4) 消化與保存的血管締合的臍帶膠質(Wharton's jelly)以釋放活HUCPVCs。
參考附圖本發明的方面現將得到更詳細的描述，其中附圖簡述

圖1是一張呈現人UC中三種不同的組織區域的光學顯微照片；
圖2是一張膠原酶溶液中環狀血管的典型例圖3是一張已粘附于聚苯乙烯組織培養表面上的分離自WJ的細胞
的光學顯微照片；
圖4是一張圖解說明CFU-0最初形成的光學顯微照片；
圖5是一張圖解說明成熟的CFU-0的光學顯微照片；
圖6顯示在35mm聚苯乙烯組織培養皿上于UV熒光下的四環素
標記的CFU-O;
圖7圖解說明了并排放置的相同的四環素標記的CFU-0的相差光學顯微照片和熒光顯微照片；
圖8是一張在組織培養聚苯乙烯表面上的成熟的CFU-O的掃描電鏡照片；
圖9是一張暴露作為基礎的基質的CFU-0橫切面的掃描電鏡照
片；
圖10是一張位于CFU-0前緣的輕度礦化的膠原纖維的掃描電鏡
照片；
圖11是一張通過分化成骨細胞鋪在聚苯乙烯界面上的非膠原基質
(被視為小球狀體)的掃描電鏡照片；
圖12是一張包含成熟的CFU-0中心的重度礦化的膠原的掃描電鏡照片；
圖13圖解說明了流式細胞術數據，顯示WJ來源的細胞有77.4°/0是MHCI和MHC II陰性；圖14是一張骨小結橫切片的Masson三色染色的黑白復制圖，顯示了已陷入膠原中的細胞(骨細胞)的分布，以及多層周圍細胞，其中的一部分為復雜的(elaborated)細胞外基質所包圍；
圖15顯示了與定向骨祖細胞亞群和總的骨祖細胞亞群擴增有關的粘附的血管周圍WJ群的潛在擴增；
圖16顯示了從0至144小時的血管周圍WJ細胞的增殖，圖解說明了具有從0至24小時的延滯期、從24至72小時的對數期以及/人72至120小時的平臺期的正常生長曲線。在整個培養期內倍增時間為24小時，期間在對數期內倍增時間為16小時；
圖17顯示了超過5次傳代的WJ細胞的主要組織相容性復合體(MHC)的表達，它們表達的改變歸因于凍融，而隨后的表達則歸因于再培養；
圖18顯示了 HUCPVCs的CFU-F頻率；
圖19顯示了從PO至P9的HUCPVCs的倍增時間。HUCPVCs顯示從P2至P8有20小時的相對穩定且快速的倍增時間；以及
圖20顯示了 HUCPVCs的增殖，顯示在30天的培養中可產生〉1014個細胞。隨著該快速擴增，可在24天的培養中產生1,000個治療劑量(TDs);
圖21顯示了膠原酶濃度和消化時間對細胞收獲的影響；以及圖22提供了顯示從低溫保存中回收并在含青霉素G(167單位/ml)、慶大霉素(50^ig/ml)和兩性霉素B(0.3嗎/ml)的5% FBS和a-MEM中于組織培養處理的表面上培養后第4天(圖A)和第9天(圖B),通過臺盼藍排除確定為活的細胞的存在的光學顯微照片。圖C是一張顯示用于比較當之前沒有冷卻、在浸沒于10。/。DMSO后冷凍臍帶時所獲得結果的光學顯微照片。
發明詳述
在一個方面中，本發明涉及用于保存臍帶組織的方法。該實踐使與其來源對象組織相容的細胞的未來利用得以可能，例如由于醫學原因如細胞或組織修復或再生所產生的未來需要。
在本發明中，臍帶組織是分娩后獲得的，并進行了冷凍，然后將冷凍的臍帶組織保存作為活細胞的未來來源。為從該冷凍的組織中獲得活細胞，使組織得以解凍，然后提取以提供當培養時顯示存活力的細胞。
本發明的方法可應用于多種臍帶組織，如包括血管壁和內皮的血管系統、臍帶膠質、羊膜上皮等。獲得上述組織所的臍帶可以是來自任何哺乳動物的臍帶，并優選獲得自人臍帶。在本發明的一個實施方案中，臍帶組織是臍帶膠質。在一個優選的實施方案中，該組織是與臍帶血管系統(優選人臍帶血管系統)的血管周圍區締合的臍帶膠質。在
本發明的另一個實施方案中，臍帶組織是血管組織。在一個優選的實施方案中，該組織為具結合了與血管周圍區締合的臍帶膠質的血管組織。在一個特別優選的實施方案中，待冷凍的臍帶組織為血管系統(即血管)以及締合的臍帶膠質，當該血管系統從切除的臍帶中除去時該臍帶膠質仍與之締合。上述臍帶組織包括全長的完整血管系統、單根血管、血液已任選地除去的其縱切片形式以及上述組織的橫切片。
因此，在本發明的所有方面中，優選的臍帶組織為具有位于其外壁上或與之締合的臍帶膠質(即位于臍帶血管周圍區中的臍帶膠質)的人臍帶組織中的血管。位于該特定區中的臍帶膠質是上述并進一步詳述于下的祖細胞的豐富來源。該臍帶膠質與血管壁如此緊密地締合，以致于在操作上難以將其與血管壁分離。盡管如此，該血管周圍臍帶膠質自身以及不帶有締合的血管的回收在技術上仍是可行的，本發明因此進一步包括上述分離的血管周圍臍帶膠質作為臍帶組織用作用于隨后的活祖細胞收獲的待冷凍的以及任選地低溫保存的源材料的應用。
臍帶組織被期望作為分娩后組織，并在任選解剖以提供具有上述特性的組織后新鮮獲得，然后以備冷凍。期望地，臍帶組織從收獲起
約24小時內進行加工，如此提取的組織從收獲起至少約72小時之內、更優選48小時之內以及特別是24小時之內被冷凍并期望地進入低溫保存。在此期間可冷卻該新鮮組織，并按照標準操作期望地進行洗滌以及任選地進行消毒滅菌，但不應在此期間進行如本文中所指明要求的冷凍，使得細胞存活力不受不利影響。
在優選的實施方案中，其中要被保存的臍帶組織為具有締合的血管周圍臍帶膠質的臍帶血管，可如下文所詳述的以及Davies等在US2005/0148074中所描述的對該血管進行提取。簡言之，通過輕輕地
ii將血管從已縱向開口的臍帶中拉出獲得具有締合的臍帶膠質的完整臍
帶血管，并橫向切割以產生1-3英寸(如約4cm)長的血管片段。該處理去除了臍帶中大部分的臍帶膠質，但在與所提取的血管締合的血管周圍區中留下了臍帶膠質。例如使用夾鉗、縫合線等將血管末端打結以防止血管中殘留的任何血液漏出。此外或在備選方案中，可通過在適合的載體如鹽水或緩沖鹽水(如PBS)中反復漂洗除去血管中的血液。
染物存在。在除去血液的情況下,i當理解可用于保存的臍帶血管片
段不僅包括通過橫向切割血管所產生的片段，還包括通過縱向切割所產生的片段，尤其是橫向切割，會產生作為原本是管狀片段的條帶的片段。具有血管周圍臍帶膠質的所有形式的臍帶血管片段都能用于本發明的方法中。
為了在活細胞可以回收的條件下保存組織，將臍帶組織置于適合于冷凍處理的載體中，例如任何適合于低溫保存的載體中。任選地，載體進一步包含適合于細胞培養的補充物。在一個實施方案中，載體包括二曱亞砜(DMSO),如10-30% DMSO,如15-25% DMSO,包括20%DMSO。在另一個實施方案中，其中載體包括細胞培養補充物，DMSO以載體體積的1-25%,如5-20°/。，如8-15°/。，即約10%存在。在另一個實施方案中，補充物為基于血清的補充物，如胎牛血清。在一個特定的實施方案中，按體積自身包含有5-20%(如10%或15%)的FBS的胎牛血清培養基以載體體積的75-99%,如80-95%,即約90%的存在。在一個更進一步的特定實施方案中，按體積載體包含90%的10Q/qFBS溶液和10% DMSO。
在本發明的一個特別優選的方面中，用于冷凍以及任選的低溫保存的組織制備通過分階段的、過渡的冷卻處理得以進行，該冷卻處理
#:特別設計以使低溫防護劑能滲入組織，從而在保存過程中充分地保護組織以及存在于其中的細胞，并能置換在冷凍下會損傷組織和細胞的水。特別是，優選的冷凍/低溫保存方法使用了如上所述包含低溫防護劑和細胞營養培養基如補充有血清的細胞培養基的低溫防護溶液。低溫防護劑可以是任何保護組織以及存在于其中的細胞免于冷凍及結水所造成的破壞作用的液體試劑或試劑溶液。最優選地，低溫防護劑
為二甲亞砜(DMSO)。在備選方案中，低溫防護劑可以是甘油或甘油和DMSO的混合物。甘油可以與關于DMSO在本文中所列的相同的方式及相同的濃度使用。DMSO的特性使之特別適合用于本發明的低溫保存方法中。
存在于低溫防護溶液中優選的補充血清的培養基為胎牛血清 (FBS)。可選地，該培養基可包含任何適合于細胞培養的營養培養基，如DMEM、 M 199、 RPMI 1640等，其添加有血清補充物如FBS、人血清等。一般來說，僅僅取決于所選擇的營養培養基的類型，該培養基的血清成分應包含約5-30%血清，如10-20%血清。如上所述，優選的低溫防護溶液按體積包含約10% DMSO和約90%的培養基，如FBS。
為制備用于冷凍及隨后低溫保存的組織，可將組織與低溫防護溶液組合，并在對于低溫防護劑滲入組織從而期望地置換了締合水有效的一段時間和溫度下作為液體冷卻。為了該目的，在此組織為具有血管周圍臍帶膠質的臍帶血管片段時，該組織適合于在約4C的溫度下保持約15-60分鐘，例如20-40分鐘以及優選30分鐘。更低的溫度是4支不理想，因為在低于該溫度下DMSO會凝固并且減少組織滲入。更高的溫度是適合的，但還是期望使用較低的溫度以便在操作期間減緩臍帶中的代謝過程。冷卻期可以改變。期望權衡輕重使得給予低溫防護劑足以滲入組織的時間，同時減少臍帶操作過程時間。一般而言，冷卻時間應當不少于約10分鐘并且可接近于最高達60分鐘或更久。
在冷卻處理期間，根據標準操作，組織可溫育于任何合適的容器中，例如離心管，如50mL體積的離心管。當組織為具有血管周臍帶膠質的臍帶血管時，每一容器可容納約5-10個血管片段。不讓容器塞滿是有用的，能使得DMSO滲入不受阻礙。
在冷卻后，對血管進行冷凍處理。期望地，在將冷卻的組織轉移到低溫容器之后進行該處理，使得冷凍的組織能隨后易于轉移至低溫保存。在一個實施方案中，容器由可被消毒的不易碎的聚合物(例如聚丙烯等)制成，并以管或其他可接受的形式提供，所述其他可接受的形式適合于容納可移除的蓋子以使在保存期間該容器能駐留樣品并使該樣品在其后能放出。最值得期望的是，每一低溫容器包含一份組織樣
品，如在組織為具有血管周圍臍帶膠質的臍帶血管的情況下每一容器包含一個血管片段。所謂的低溫管是適合的，如聚乙烯袋。如此，將冷卻的血管轉移到低溫容器中，并與體積足以優選完全浸沒組織的新鮮的^f氐溫防護溶液組合。
接著，通過將樣品置于冷凍單元中冷凍所制備的組織，其中冷凍單元的溫度可控制在冷凍該組織所必需的低溫下。在一個實施方案中，
將包含組織和溶液的容器置于冷凍機中以將溫度降低至約-70C,如在約-40C下，持續至少約6小時，如至少約8-12小時。最優選地，使用控速-70C冷凍才幾進4亍冷凍。
應當理解冷凍的組織能直接用作為從中回收活細胞的起始材料。這樣的冷凍材料當保持在-70C下時，可顯示出至少某些細胞活性，并因此應可相對迅速地得到使用，從而避免了在該溫度下隨時間過去可能發生的細胞死亡。更優選地，根據本發明的方法，將冷凍的組織置于低溫保存中，即在細胞代謝處于停滯的溫度下保存。
因此，在組織冷凍后，優選以業已開發用于保存類似細胞和組織的方法將含有冷凍的組織的容器轉移至低溫保存。適宜地，在約-180C 至-200C下將容器保存于液氮的氣相中。在備選方案中，冷凍的細胞可低溫保存于除液氮之外的介質中，如液態二氧化碳或液態卣化碳。
組織樣品可在該低溫狀態中駐留幾天、幾周、幾個月或幾年的一 |殳長時間用于當需要祖細胞來源時從中取出祖細胞。
需要時，可利用根據本發明的回收方法獲得駐留在保存的組織中的活細胞。更特別地，首先獲得處于低溫保存的容器中的組織并解凍以使得隨后低溫防護劑的除去得以進行。該組織可例如在溫度通常不超過40C的溫水浴中解凍。10C-40C的溫度是適合的，以及37C的溫度是所期望的。一旦解凍，在37C下約5-15分鐘，如IO分鐘，就可將組織轉移至例如50mL管的容器中，并洗滌組織以稀釋或除去 DMSO。期望地通過將組織浸沒于冷的液體中，利用冷的(如冷卻的，例如4。C)液體如水或緩沖鹽水如PBS進行該洗滌。期望地，避免對該組織的過分洗滌，使得對細胞的沖擊或損傷最小化。浸沒的組織可在冷凍機中保持又一段時間以使通過水對低溫防護劑進行進一步的稀釋和置換得以進行，并接著通過添加更多的冷的液體進行進一步的稀釋。
接著，利用與為從新鮮的臍帶組織中回收活細胞所建立的實踐操作相同的實踐操作，所得到的恢復的組織可用于回收駐留在該組織中的活細胞。因此，本發明的方法能從已冷凍并低溫保存的臍帶組織中回收活細胞?？衫萌魏我环N為該目的所建立的技術來證實這樣的細胞的存活力。便利地，可通過臺盼藍排除(一種鑒定不能排除該染料的
死細^^的方法)簡單地或以一種更復雜的方法通過^r測BrdU的摻入以證實發生DNA合成來證實所回收的細胞的存活力。因此，關于細胞在本文中使用的術語"活的"指細胞具有活性代謝，以及對于基于粘附培養的細胞所進一步期望地顯示的，對培養基質的粘附特性和隨后的播散和增殖。上述存活力的一個例子示于圖22中，特別是圖A和B 中，其顯示了活HUCPVCs的播散和增殖現象特性。
在本發明的特定實施方案中，回收自保存的臍帶組織的活細胞為祖細胞。在其他特定的實施方案中，如本文中所舉例說明的，活的右L 細胞回收自與保存的臍帶血管或其片段締合的血管周圍臍帶膠質。
應當理解本發明的保存和回收方法使包含多個容器(每一容器都包含臍帶組織樣品)的保存收集物或"庫"中臍帶組織的組構變成可能。這樣的臍帶組織樣品的收集物或庫構成了本發明的另一個實施方案。每一組織庫都會附有關于每種樣品的目錄指示，任何與每種樣品相關的有用信息如樣品來源，例如關于供者個體以及可能的其遺傳史或病史，保存日期，生產該樣品的機構或個人的身份等。利用該手段，組織庫可作為儲庫(repository)用于組織及其內在細胞的未來使用，并且該目錄可用于選擇供特定患者或為治療特定醫學狀況使用的特定的組織和細力包。
在保存的組織為具有血管周臍帶膠質的臍帶血管或血管片段的情況下，為回收活的祖細胞，可參考在我們共同未決的國際專利申請 WO04/072273(公開于2004年8月26日)和US 2005/0148074中所描述的方法，上述專利文獻在此并入作為參考。更特別地，這樣的祖細胞從新鮮的臍帶組織中的分離以及它們的特性和最終用途描述如下。這些祖細胞稱為人臍帶血管周圍細胞或"HUCPVCs"。
所提到的參考文獻教導了一種從人臍帶的臍帶膠質中提取細胞的方法，其產生了以快速增殖、存在骨祖細胞和包括不顯示兩種主要組織相容性標志中任何一種(人白細胞抗原(HLA)雙陰性)的細胞在內的其他人祖細胞為特征的獨特細胞群。該細胞群是生長成骨和其他結締組織包括軟骨、脂肪和肌肉的祖細胞的有用來源，并為了治療目的用于自體和同種異體轉移祖細胞給患者。更特別地，該方法提供了一種臍帶膠質提取物，其中該提取物包含人祖細胞，并且是通過酶消化在有用地稱為血管周圍臍帶膠質區的區域中鄰近人臍帶的血管系統的臍帶膠質所獲得的。處于該血管周圍區中且祖細胞提取自其中的組織還可稱為血管周圍組織。該提取方法適宜地產生了基本上無臍帶血的細胞、UC上皮細胞或內皮細胞以及來源于臍帶血管結構的細胞的提取物，在此血管結構被規定為小動脈或
靜脈血管的內膜(tunicaeintima)、中膜和外膜。所得到的提取物也不同于分離自已與血管結構相分離的大量臍帶膠質組織的其他臍帶膠質提取物。
因此，該方法提供了一種用于獲得人祖細胞的方法，包括從根據本發明所獲得的臍帶膠質提取物分離細胞的步驟'
-Jr 、、t祖乂斗7 :S! J f li關右工仗悉fl六瞎該萬/S:拔伏J通2iJ^"喬什咎丁附市/J父/^
胞群，包括骨祖細胞群和MHC -/-祖細胞群，
所提取的祖細胞群具有在粘附條件下i1
得的粘附細胞群的特征。在另一個實施方案中，所提取的祖細胞群具
"粘附后，，)(PA)細胞群的特征。該PA級分是通過將最初鋪板的 HUCPVCs的上清液轉移到新的T-75燒瓶中以容許到目前為止未粘附的細胞粘附于培養表面所得到的。使用這種新的T-75燒瓶重復該操作，將其培養基轉移到另一個新的T-75燒瓶中以便收獲任何殘留的PA細胞。該PA細胞群包含當在粘附條件下培養時，快速增殖并自發形成骨小結和脂肪細胞的祖細胞亞群。這種技術提供了一種增加分離自酶消化細胞群的粘附細胞產量的手段。
需的補充物的情況下培養時分化為骨細胞的特性的定向骨祖細胞群。
還提供了一種用于產生包括骨組織、軟骨組織、脂肪組織和肌肉組織的結締組織的方法，其包括讓獲得自臍帶膠質提取物的細胞處于有助于那些細胞分化為期望的結締組織表型的條件下的步驟。在這方面，本發明進一步提供了這樣的細胞在基于細胞的治療中的應用，所述治療包括細胞移植介導的醫學狀況、疾病和病癥的治療。還提供了一種組合物及其在組織工程化中的應用，所述組合物包
遞送至所選擇的組織部位的載體。
提供了一種臍帶膠質(WJ)的提取物，其作為包含包括骨祖細胞以及無免疫能力的細胞的人祖細胞的快速增殖細胞群的來源。
所提取的細胞群可稱為人臍帶血管周(HUCPV)細胞。該HUCPV細胞群構成了在其表型上是獨特的，特別是為包含在其中的多種細胞亞群所揭示的多能祖細胞的豐富來源。被提取的細胞所來源的臍帶膠質的血管周圍區可被稱為血管周組織。
當在本文中使用時，術語"祖細胞"指在控制和/或規定的條件下會分化為給定表型細胞的細胞。因此，骨祖細胞是一種當在為這樣的定向和分化所建立的條件下培養時，會定向為成骨細胞譜系并最終形成骨組織的祖細胞。"無免疫能力的"或"非免疫原性的"祖細胞是一種具有與I類和II類主要組織相容性復合體(MHC)有關的表面抗原陰性表型的細胞。這樣的祖細胞在本文中還被稱為HLA雙陰性或MHC -/-。
提取自WJ的HUCPV細胞群還具有"快速增殖"的特征，其指在用于祖細胞擴增的標準條件下，相對于其他已知的祖細胞群，所提取的細胞生長的速度。根據本文中所呈現的實驗結果以及如圖16中所示的，應當理解祖細胞群可在至少約25小時之內，以及在快達7-15小時之內倍增，并因此較其他已知的骨祖細胞群和提取自WJ的其他祖細胞群擴增快得多。
細胞和細胞群可通過從人臍帶的WJ中提取獲得。和現有技術不同，這樣的細胞提取自締合即鄰近臍帶血管系統外壁的WJ。與臍帶血管系統外表面締合或非常鄰近的臍帶膠質位于稱為血管周圍區的區域中，且當從臍帶中切離血管(如從臍帶中提取臍帶膠質或從臍帶中提取血管以及締合的臍帶膠質)時通常與該血管系統保持締合。已顯著地發
現位于該血管周圍區中且在現有技術實踐中通常被棄去的臍帶膠質是具有本文中所描述的特性的祖細胞的豐富來源。因此，利用了來自該
臍帶膠質的血管周圍區的組織作為稱為HUCPVCs的有用的人祖細胞來源。在實施方案中，HUCPV細胞群的特點在于存在具有許多指示功能性間充質細胞(非造血)表型的標志(即CD45-、 CD34-、 SH2+、 SH3+、 Thy-l+和CD44+)的祖細胞。特別有意義的是，該細胞群的特點在于通常作為3G5抗體陽性的容納細胞(harbouring cells),該抗體是一種指示周細胞的標志。所提取的細胞群通常是一種在形態學上同質的成纖維細胞群，其表達a-肌動蛋白、結蛋白和波形蛋白，并提供非常有用的來源，期望細胞亞群可通過操縱培養條件并基于例如細胞分選原理和技術選擇獲得自所迷來源。
為從人臍帶中提取這樣的血管周圍細胞，要注意在提取過程期間避免提取臍帶血細胞、UC上皮細胞或內皮細胞以及來源于臍帶血管結構的細胞，在此血管結構被少見定為動脈或靜脈血管的內膜、中膜和外膜?？赏ㄟ^在解剖前仔細地沖洗并洗滌臍帶，接著小心地將血管從臍帶中解剖出來，就能獲得基本上不含有這些不需要的細胞的提取物。還可小心地將這些血管從周圍的臍帶組織拉出來，在這樣的情況下將血管周圍組織與血管相切離。應當理解要小心以避免提取這些不需要的細胞，它們仍有可能少量存在于所得到的提取物中。可接受的前提條件是它們以如此低的以致于不千擾本文中所呈現的觀察結果的頻率
細胞集落的觀察、CFU-F、 CFU-0和CFU-A形成的頻率和速度以及對在培養的細胞群中所觀察到的HLA表型的表征。
位于血管周圍區中的組織是鄰近臍帶血管系統外壁的臍帶膠質，并且通常位于由血管外壁向外延伸約3mm的區域內。適宜地，該靶提取區可位于三條血管中任何一條的外壁向外延伸約2mm,如約lmm的范圍內。利用實施例中所描述的技術能容易地實現從該區中提取WJ。在該技術中，血管用作為WJ的載體，并且血管本身亦可用作為提取祖細胞的基質。因此，通過外科手術或手工從已充分洗滌從而基本上除去所有臍帶血污染物的新鮮的臍帶上將具有血管周圍組織薄覆蓋層的臍帶血管切離。然后在含有適合于消化期望細胞所駐留的血管周圍組織的膠原基質的酶的提取介質如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中于約37°C下溫育具有鄰近的血管周圍組織的血管或其切片。為了該目的，用約
0.1mg/mL-10.0mg/mL或更多，如0.5mg/mL濃度的膠原酶進行消化是適合的。酶的類型、濃度和溫育時間可以改變，并且可通過在所選擇
18的條件下監測細胞表型和細胞群的產生，從而簡單容易地確定可選的
提取條件。舉例來說，在約3小時(如1-5小時)的較短的消化時間內， 4mg/mL(如l-4mg/mL)的較高的膠原酶濃度也是適合的。在提取期間，打結或剪去血管末端，并可將其懸掛在提取介質上以避免血管中所包含的物質污染介質。因此，應當理解臍帶膠質提取物基本上不含有臍帶血細胞、臍帶上皮細胞、血管內皮細胞和血管平滑肌細胞。
根據本發明，這樣的組織被冷凍并優選地低溫保存，并以一種容許從所保存的組織提取活的HUCPV祖細月包的方式從冷凍或〗氐溫狀態恢復。
其他可用于該分離步驟的消化酶為0.1-10mg/ml透明質酸酶、 0.05-10mg/ml胰蛋白酶以及EDTA。盡管較便宜的備選方案是使用 0.5mg/ml消化18-24小時，但最佳的膠原酶濃度為4mg/ml，消化時間為3小時。另一種膠原酶濃度的備選方案是如圖21中所舉例說明的。期望地，如圖21中所示，在血管開始降解時或降解之前停止消化，取決于膠原酶濃度該降解在不同的時間點出現。
在0.5mg/mL月交原酶提取介質中約24小時，如12-36小時，如18-24 小時后，或在4.0mg/mL膠原酶提取介質中約3小時后，移除血管，留下含有人祖細胞的血管周圍組織提取物。在用于祖細胞擴增的標準條件下擴增這些細胞。這些細胞能例如在聚苯乙烯上被選擇以選取粘附細胞，例如在聚苯乙烯皿或燒瓶中，并接著保持在適合的培養基中。如Baksh等在WO 02/086104(其內容在此并入作為參考)中所舉例描述的，無論有否之前的粘附細胞選擇，都可在攪動的懸浮液的條件下培養所提取的細胞用于擴增。
所提取的HUCPVCs群可在粘附條件下培養，并回收駐留于上清液中的非粘附細胞用于進一步的培養。這些"粘附后，，細胞的特征在于是一種具有自發形成骨小結和脂肪細胞傾向的細胞亞群。因此，該方法提供了一種提取自血管周圍組織的分離的祖細胞群，這些細胞具有形成包括骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌肉細胞在內的幾種分化細胞類型中的至少一種的傾向，其中這樣的祖細胞構成了在粘附條件下培養的HUCPVCs的非粘附級分。通過在粘附條件下培養血管周圍組織提取的HUCPVCs、選擇非粘附的細胞群并接著在對(l)擴增所述細胞群或(2)導致其分化為期望細胞表型有用的條件下培養該非粘附的細胞群，從而獲得這樣的細胞。用于其中的培養條件是如本文中所例證的對這樣的擴增和分化已建立的那些條件。
可在標準的粘附培養條件下培養并擴增HUCPV亞群。如本文中所揭示的，這樣的粘附細胞群已知包含無免疫能力的或非免疫原性的祖細胞以及間充質祖細胞。
可利用已建立的技術直接或在擴增之后保存存在于提取物中的細胞以提供富集所給定表型的細胞的能擴增的細胞亞群。因此，進一步提供了血管周圍組織提取的富集多能的間充質祖細胞、骨祖細胞的細
胞群，富集無免疫能力的祖細胞的細胞群以及富集無免疫能力的多能和骨祖細胞的細胞群。此外，細胞可被富集以只選擇對周細胞標志3G5 陽性的那些細胞，該選擇利用了其3G5抗體，以及只選擇對MHCI類和II類標志中任何一種或兩種陰性的那些細胞。還可通過針對其他表面標志的選擇富集細胞群，如通過耗竭那些帶有CD45的細胞以例如除去造血細月包。
如圖17中所顯示的，通過凍融改變了祖細胞群中MHC標志的分布。新鮮的細胞剛一傳代，MHC雙陰性細胞的頻率就相對恒定地/微小增加。然而，在冷凍后鋪板的細胞中祖細胞群中的MHC雙陰性細胞的頻率明顯增加了。因此，在祖細胞群中，MHC雙陰性表型的細胞進一步的特征在于具有冷凍后頻率增加的傾向。通過首先制備細胞等分試樣，然后將細胞制備物保存一段期望的時間，以這種常用的方法進行這樣的冷凍。應當理解如果需要的話這樣的細胞可保存許多年。
該方法通過獲得如本文中所描述的血管周圍組織提取物或其富含 MHC雙陰性細胞的級分，對該提取物或其級分進行冷凍，并接著培養該冷凍的細月包，/人而具有產生MHC雙陰性3且細胞的用途。如所注意到的，所得到的細胞在人受試者中能潛在地用于誘導組織形成或修復。
獲得自提取物或其適合的富集級分的細胞群直接或在它們擴增之后用于提供分化的細胞群。所有適合于它們分級分離和富集以及適合于它們擴增的方法都在現有技術中得以建立。例如，擴增可在諸如IL-3 和干細胞因子的因子以及本領域中已知的類似試劑的存在下進行。佳_ 用為從其中生長骨組織所建立的條件，可讓細胞群以及特別是其中的
骨祖細胞分化。值得注意的是，故稱為定向骨祖細胞的來源于祖細月包群培養的骨祖細胞亞群已顯示在成骨補充物不存在下的分化能力。可選地，在補充有一種或多種刺激骨生成的試劑如地塞米松的培養基中培養骨祖細胞。此外，還可用適合于刺激分化為其他間充質細胞來源
的結締組織(Caplan, 1991),包括軟骨、肌肉、腱、脂肪等的補充物培養祖細胞，所有操作都與本領域中的標準操作一致。
作為細胞群中細胞的體外培養的備選實踐，應當理解可體內移才直細胞以直接在患者中誘導期望組織形成。為了患有不同骨狀況、疾病和病癥，尤其包括骨折和骨質疏松的患者的利益，通過該途徑，經移植骨祖細胞提供了骨原位形成。這樣的治療還可應用于減弱其他結締組織例如但不限于軟骨、脂肪和肌肉的疾病。存在于細胞群中的無免疫能力的祖細胞在這方面上是特別有價值的，因為基本上減弱了可預計在它們移植之后發生的排異反應。
為了在移植中使用，細胞可作為進一步包含用于將它們遞送至一皮選擇用于工程化的組織部位的載體的組合物提供。細胞以對于預期戔文果有效的劑量存在。預計有效的細胞劑量將處于每劑103-107個細胞，如104- 106個細胞，如2 x 105個細胞。根據所建立的用于遞送活細月包的方法，組合物中被選擇用于那些細胞遞送的載體可以改變。在實施方案中，細胞被用于骨組織工程化的目的。在一個實施方案中，細月包與以用來將細胞作為植入物定位在缺損或折斷或經外科手術準備接受該植入物的骨部位的支架材料形式的載體一起存在。多種材料適合作為載體用于該目的。在一個特定的實施方案中，載體由諸如磷酸鈣、 PLGA或它們的混合物的可再吸收材料形成。可使用等效材料，只要它們能讓細胞在組合物形成和遞送期間保持存活并且在植入部位是生理學上相容的即可。
其他適合于祖細胞遞送的載體包括諸如PBS和包括透明質酸、明膠等的凝膠的載體，等效物也是有用的，前提條件是它們具有細胞存活力必需的pH和其他特性。
還應當理解細胞用作為宿主用于遞送基因表達產物給期望的組織部位。換句話說，可對細胞進行遺傳工程化以接受并表達基因，所述基因表達后產生了在組織修復方法中有用的產物，如不同的生長因子，就骨組織來說，所述生長因子可有效地包括PTH、 BMPs、降鈣素等。細胞還可被開發作為轉基因細胞用于其他目的，如通過導入改變細月包表型的基因以使該細胞更強壯或更適合于給定的最終用途。本發明的實施方案描述于下列實施例中。從人臍帶膠質中收獲祖細胞
在加拿大多倫多Sunnybrook & Women's College醫院，從剛分娩的
足月剖宮產嬰兒中收集uc。通過外科醫生將uc轉移到含有培養基
(80%a-MEM、 20%抗生素)的無菌容器中，并馬上運送到位于多倫多大學生物材料和生物醫學工程學院(Biomaterials & Biomedical Engineering, University of Toronto)的我們的實驗室。
從這一刻開始所有操作都在生物學安全工作櫥中無菌進行。在石粦酸鹽緩沖鹽水(PBS) (-Mg2+,國Ca,中洗滌UC三次，盡可能多地除去 UC血液，然后移回具有培養基的容器中。用無菌剪刀剪下大約6 cm 長的臍帶并置于無菌軟木解剖板上。將剩余的臍帶(30-45 cm)送回填充培養基的容器中并置于37。C保溫箱中。將該6 cm臍帶切片逆著其螺旋'扭開，，并釘住兩端以暴露出UC上皮光滑且直的表面。使用精細手術剪沿UC長度方向將UC切開大約l-2mm深以暴露WJ。從每條切開上皮的'皮瓣，開始，使用解剖刀的鈍緣從其內表面挑出WJ,并4丁住挑離的上皮(大約0.5mm厚)。該步驟產生了暴露的WJ,并帶有從頭到尾直的而非沿其縱軸成螺旋形的包埋在其中的三條血管。小心地不斷地用37。C PBS沖洗切片。用鑷子分離一條血管的一個末端，沿WJ 長度方向將其挑出直至其游離于大部分的WJ基質為止?？蛇x地，拿著鑷子可將中間一條的血管從基質中剝離，并在朝著其末端的任何一個方向上從基質中挑離。一旦為任何一種方法所釋放，血管就被大約 l-2mm的帶細胞WJ基質圍繞著。然后用手術鉗或蚊式夾(mosquito clip) 夾住或縫合解剖出血管的兩端以形成'環，，封閉液體進出血管的通道。馬上將該'環，與剪刀一起放置于含有0.5mg/ml膠原酶PBS(-Mg2、 -。&2+)溶液的50ml管中，并置于37。C保溫箱中。以類似方式解剖出剩余的兩條血管，成環并同樣置于保溫箱的膠原酶溶液中。在除去血管后，就能容易地從上皮上解剖出構成血管周圍組織的WJ條帶并置于具有膠原酶溶液的50ml管中。然后在生物危害廢棄物容器中處理剩余的上皮層。將相同的實驗方案用于剩余的30-45cm的UC,產生了 15-25 管的'環，或血管周圍組織條帶。臍帶膠質祖細胞培養的開始
在18-24小時后，借助于附在其上的吊夾或縫線以及移液管移除 '環，，然后用PBS稀釋剩余的懸浮液2-5次并在1150rpm下離心5 分鐘以獲得作為管底沉淀的細胞級分。在除去上清液后，在室溫下將細胞重懸于8倍體積的4%NH4C1中5分鐘，以便裂解^f壬何紅細月包污染物。然后在1150rpm下再離心懸浮液5分鐘以分離作為沉淀的細胞級分，并除去上清液。在借助于血細胞計數器對細胞計數后，將它們直接鋪板于T-75 cn^聚苯乙烯組組織培養亞上，并在37°C下溫育24-72 小時以便讓細胞粘附于聚苯乙烯表面。之后每隔2天更換一次培養基。
利用上述方法再次產生了詳述于下的結果，但其中所進行的基于膠原酶的消化為在4mg/mL下3小時，在2mg/ml下6小時以及在 lmg/mL下12小時。
7天后利用0.1%胰蛋白酶溶液傳代粘附細胞，此刻如通過光學顯微鏡所觀察到的它們顯示80-90%匯合，并如在相差顯微鏡下所揭示的以及通過預期的光學性質改變所顯示的，證明了 '礦化的，積聚物形成。剛一傳代，就以4xl(^個細胞/cm2將細胞鋪板于35mm組織培養聚苯乙烯皿或6孔平板的經補充的培養基(SM) (75% a-MEM或D-MEM、 15%FBS、 10%抗生素)中，并用l(T8MDex、 5mM卩-GP和50 pg/ml抗壞血酸處理以測試這些細胞的成骨能力。對于原本稱為'骨小結，形成的CFU-O，在培養的第2、 3、 4和5天觀察這些平板。
為了測試這些細胞的軟骨形成能力，在1150rpm下離心2xl05個細胞5分鐘以便獲得作為沉淀的細胞。一旦除去上清液，就將細胞保持在補充有10 ng/ml轉化生長因子-(3(TGF-p)(以及任選地補充有10々M地塞米松)的SM中。每隔2天更換一次經補充的培養基，保持培養3-5 周，此刻收獲它們用于組織學(通過用100/。中性福爾馬林緩沖液(NFB) 固定)、包埋于石蠟中、切成6nm切片以及為膠原II的存在(抗體染色) 以及氨基葡聚糖的存在(阿爾新藍染色)進行染色。為了評價細胞的生脂分化能力，將它們最初于6孔平板的SM(含有D-MEM)中培養，每隔2 天更換一次培養基，直至它們達到60%匯合為止。此刻用生脂誘導培養基(AIM) (88% D-MEM、 3。/。FBS、 33^M生物素、17pM泛酸鹽、5pM PPAR-y、 100nM牛胰島素、lpM地塞米松、200^M異丁基甲基黃嘌呤和10%抗生素)更換培養基。每隔2天更換一次AIM,持續10天，此
23刻在10% NFB中固定細胞并用油紅O(其將脂肪細胞的脂質泡染成紅色)染色。最后，為了評價細胞的生肌能力，將它們最初于T-75cn^組織培養燒瓶的SM(含有D-MEM)中培養，直至它們達到80-90%匯合為止，此刻用生肌培養基(MM) (75% D-MEM、 10% FBS、 10%馬血清、 50(iM氬化可的松和10%抗生素)更換培養基。每隔2天更換一次MM。培養3-5周后，從培養表面移出細胞(參見傳代培養實驗方案)，裂解細胞以便獲得它們的mRNA,并通過rtPCR評價幾種生肌基因的存在，所述生月/L基因包括MyoG、 MyoDl、 Myf5、肌球蛋白重鏈、成月/L蛋白和結蛋白。
已采用了另一種對于獲得血管周圍組織來源的祖細胞培養物有用的方法，使用了下列實驗方案
1. 從剖宮產患者中獲得無菌臍帶(UC)并轉移到生物學安全工作櫥中，置于培養基(80。/oa-MEM、 20%抗生素)中。
2. 在無菌的37。C磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌UC3次。
3. 使用鋒利的剪刀將UC切成大約l-2英寸的切片。
4. 在無菌37。C PBS中洗滌每一UC切片2次以盡可能多地除去殘留的臍帶血(UCB)。
5. 分離一個UC切片置于干燥的無菌皿上。
6. 利用兩副一蔽子，夾持大約2mm間隔的上皮，并彼此拉離，撕裂上皮。
7. 夾住上皮，沿著UC切片的長度方向持續撕裂上皮，暴露底下的WJ。
8. 類似于步驟6，持續撕裂上皮為'條帶，，直至大約一半的上皮撕掉為止。
9. 臍血管應當通過WJ清晰可見，并且血管末端松散地搭UC 切片的切口上。
10. 通過用一副鑷子夾住上皮的剩余部分，并用另一副鑷子夾住血管的末端，可將血管從帶有環繞其的血管周圍組織(PVT)
的大部分WJ中"拉出"。
11. 對每一條血管重復該處理，直至所有三條血管都不含有底下的WJ基質為止。
12. —旦釋放，就將每一條血管置于37。CPBS中。13. 對每一UC切片重復步驟5-12,直至所有的血管都分離于無菌的充滿37°C PBS的燒杯中為止。
14. 然后，通過將每條血管單獨置于清潔的、無菌表面上，利用縫合線打雙結將血管末端連接在一起形成'環，。
15. —旦所有的血管都已連接成環，就將環置于無菌的50ml管中的0.5mg/ml膠原酶溶液中。在備選的方案中，并根據本發明，可冷凍血管，低溫保存并接著恢復，利用本發明的方法保持駐留的祖細胞(HUCPVCs)的存活力，還可利用步驟 15中一開始的方法回收駐留在解凍和處理的臍帶組織中的活的纟且細月包。
16. 將該50ml管置于旋轉器中，于37。C, 5%。02的保溫箱中過夜。
17. 第二天，用lml胎牛血清(FBS)滅活膠原酶，并將環從懸浮液中移除。
18. 用PBS稀釋殘留的懸浮液，在1150rpm下離心5分鐘，并棄去上清液。
19. 然后在室溫下將沉淀重懸于8倍體積的4%NH4C1中5分鐘以裂解所有紅細胞污染物，接著在1150rpm下離心5分鐘，并棄去上清液。
20. 將保留在沉淀中的細胞重懸于經補充的培養基(SM) (75% a-MEM、 15% FBS、 20%抗生素)中，并在血細胞計數器上對等分試樣計數，
21. 接著，將細胞懸浮液鋪板于T-75組織培養聚苯乙烯燒瓶上，并使之增殖。
22. 2天后，從燒瓶中將上清液轉移到新的T-75燒瓶中，以便收獲"粘附后"(PA)細胞。
23. 2天后，從第一 PA燒瓶中將上清液轉移到新的T-75燒瓶中，以-使收獲任何殘留的PA細月包。
24. 每隔2天更換一次所有三個T-75燒瓶中的SM,直至細胞達到亞匯合(l-2周)為止，此刻它們是傳代培養的(傳代的)。
完整的臍帶血管的低溫保存本發明容許從低溫保存的臍帶組織中回收活細胞，使用了下列例
證性的方法
冷凍
如上所述分離單條臍帶血管，并如上所述用縫合線將血管末端打結形成環。將血管置于15mL聚丙烯管中，每一聚丙烯管含有5mL的由90。/。胎牛血清(FBS)和10。/o二曱亞砜(DMSO)組成的低溫保存培養基。然后將制備好的管置于-70C冷凍機中過夜，并在第2天轉移到液氮中進行長期保存。
解凍
在保存3天后將含有所制備的樣品的管從液氮中移出，并立刻置于37C水浴中。一旦完全解凍，大約5分鐘，就將樣品環置于如上所述的膠原酶消化介質中并放置在37C保溫箱的旋轉架(rotisserie)中。在18-24小時溫育后，移除被消化的血管，并使用上述方法分離祖細胞。亦如上所述，在鋪于組織培養平板上并在5-15% FBS補充的培養基中培養之后，通過臺盼藍排除鑒定活細胞。
如下所述還開發了一種改良的方法。使用如上所述的取出技術從臍帶上取出具有締合的臍帶膠質的血管并切成約1-2英寸或約4cm長的片段。然后將取出的血管片段(約5-10個片段/管，以避免擁擠)置于 50mL離心管的100/oDMSO和90。/oFBS(冷卻的，@4。C)t，每條血管 lmL?？墒褂貌煌暮寤旌衔锘驌胶臀锶〈?0% FBS,如10%血清(FBS或其他)和80% DMEM或其他適合于細胞培養的培養基。接著
液中的血管片段的管。然后將管取出，并將血管轉移到被稱為低溫管的低溫保存容器中。一條血管片段添加到一個管中。向含有血管的低溫管添加每4cm血管切片lmL或足以完全浸沒血管的低溫防護溶、液 (如上所述90%血清，10%DMSO)。
接著將低溫管藏的血管片段置于控速冷凍機中過夜(約6-12小時)，降溫溫度并保持在約-70。C。此后，將管轉移到液氮儲存(氣相)中，標記用于識別，并在-196"C下保持約1周。
26為解凍血管，從液氮儲存中移出低溫管。從低溫管中取出血管，
并在3/C水浴中讓其解凍10分鐘。接著將血管片段轉移到50mL管中，并在冷的(4C)PBS中洗涂，每條血管片段使用約lmL的PBS。然后在 4。C下于水箱中溫育含有處于PBS中的血管片段的管，以除去DMSO。然后加倍每個管中冷的PBS的量，并在水箱中將管溫育額外的5分鐘。在該步驟后，特別是根據本文中進一步描述的祖細胞提取、培養和分化技術，血管片段就隨時可作為活的祖細胞包括HUCPVCs的來源。
為證實活細胞可回收自如此保存的組織，對血管片段進行如上所迷的消化步驟，根據圖22所描述的將所釋放的細胞鋪板，并使用臺盼藍排除在ViCell-XR機器中對細胞計數。在此之后，將確定為活的細胞^ 鋪于如本文中所提及的標準培養基中，并如圖22A和B中所示的證實它們形成集落和增殖的能力。
該方法產生了生物學等價于從標準消化步驟中取出的細胞的細胞。
已嘗試了其他方法，包括將解剖出的組織浸沒于10%DMSO中，然后的步驟是在-70C下冷凍，接著低溫保存。如圖22C中所示，這些方法產生了非常少的活細胞。
3且細力包測定細胞增殖測定
在每周一次的傳代步驟中(每隔6天發生一次)，將3 x 104個細胞< 的等分試樣鋪于24塊6-孔組織培養聚苯乙烯平板的每個孔中。在培養的第1、 2、 3、 4、 5和6天，對6-孔平板中的4個孔進行傳代并計數細胞。對這些細胞的指數擴增進行作圖，并計算在這些培養中細胞的平均倍增時間。結果示于圖16中。注意到在整個培養過程中PVWJ細胞培養的倍增時間為約24小時。在對數期，值得注意的是倍增時間為 16小時。將其與文獻所寺艮道的骨髓間充質細胞的約33-36小時(Conget 和Minguell, 1999)以及來源于脂肪組織的間充質干細胞的約3.2天(Sen 等，2001)的倍增時間相比較。為了觀察具有連續傳代的增殖，將3xl05 個細胞鋪于4個T-75燒瓶(n-4)中并用SM補料，每隔2天更換一次。在培養6天后，傳代培養細胞(參見上述傳代培養實驗方案)，并借助于血細胞計數器計數。將3xl05個細胞的等分試樣接種于4個新的T-75 燒瓶中，培養6天，并重復計數步驟。對于4個臍帶樣品從PO至P9 重復該步驟。
圖18圖解說明了 HUCPVCs的CFU-F頻率。1:300的頻率明顯高于對其他間充質祖細胞源所觀察到的，包括新生兒BM (1:104) (Caplan, 1991)和臍帶血來源的"不受限制的體千細胞"(USSCs) (Kogler等， 2004),其出現頻率為l:2xl08。圖19圖解說明了連續傳代時HUCPVCs 的增殖率。在P0最初的60小時倍增時間下降到在Pl的38小時，從 P2-P8其下降并自身保持在20小時。此后細胞開始進入衰老并且它們的增殖速度開始快速下降。有趣的是，當在培養的最初30天期間觀察時(圖20),在30天內HUCPVCs產生了 2xl0"個細胞。由于一個治療劑量(TD)定義為2xl()5個細胞(Horwitz等，1999) (Horwitz EM, Prockop DJ, Fitzpatrick LA, Koo WW, Gordon PL, Neel M等Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med 1999; 5:309- 313.), 因此在10天的培養中HUCPVCs可產生1 TD，并且在24天的培養中產生了 1,000 TDs。
如圖15中所示，血管周圍組織來源的祖細胞包含不同的祖細胞亞群。在該細胞群中，存在特征在于如本文中所示的在誘導這樣的分化^ 通常所需的培養補充物不存在下，如在地塞米松存在下培養，具有形成骨小結能力的所謂的"定向，，骨祖細胞。因此，這些定向骨祖細月包自發分化形成骨小結。還包含在祖細胞群中的是當在必需因子如地塞米松、P-磷酸甘油和抗壞血酸存在下培養時可被誘導形成骨小結的成骨細胞。因此，描繪于圖15中的"總成骨祖細胞，，亞群誘導了 "定向成骨祖細胞，，群以及"未定向成骨祖細胞"群，并揭示了沿著成骨分化途徑可被誘導分化的細胞總數。在"定向"和"未定向，，細胞群之間的實際比率為大約1:1，并且在"總成骨祖細胞"群和"定向成骨相_ 細胞，，群之間這樣的比率為約2:1。如下所述進行祖細胞成骨特性的分析。
還已觀察到細胞的軟骨形成、生脂和生肌分化。盡管自發觀察到成骨分化和偶然的生脂分化，但僅在用于相應表型的特定誘導條件下培養時才觀察到其他表型。連續稀釋和CFU-F測定
將HUCPVCs的1 x 105、 5xl04、 2.5 x104、 1 x 104、 5xl03、 lx 10S稀釋物接種在6-孔組織培養平板(Falcon弁353046)上并每隔2天補料 SM —次。在培養的第10天計數每個孔中包含>16個細胞的集落的數目，并在第14天確-〖人。從而，將CFU-F頻率(產生一個集落所需的細胞平均數目)確定為1 CFU-F/300個鋪板的HUCPVCs?；谠擃l率，計算提供300 HUCPVCs所需的單位體積(對3條臍帶的每一條重復三次)，將8倍增加的單位體積的HUCPVCs接種在6-孔平板的單個孔中。再一次，在培養的第10天計數包含>16個細胞(CFU-Fs)的集落以測定釆用增加接種的CFU-F頻率。
CFU-0測定
在每周一次的傳代步驟期間，將測試細胞群的等分試樣直接鋪于組織培養聚苯乙烯中的骨形成培養基上，該骨形成培養基含有75% a-MEM, 15。/。FBS(StemCell批號S13E40)，含有青霉素G(167單位/ml)、慶大霉素(50jig/ml)和兩性霉素B(0.3ixg/ml)的10%抗生素儲液，和Dex (1(T8M), p-磷酸甘油(5mM)以及L-抗壞血酸(50ug/ml),細胞接種密度為1 x 1(^個細胞/cm2。每隔2天對培養物再補料一次，持續12天。保持培養物直至觀察到作為骨小結檢測到的礦化的小結區為止(通常3 天)，此刻在最后一次培養物再補料中用含四環素培養基對培養物再補料，然后在Karnovsky氏固定劑中固定并準備用于分析。在相差和UV 焚光下用Leitz Aristoplan顯微鏡(Esselte Leitz GmbH & Co KG, Stuttgart, Germany)觀察四環素標記的培養物，并用Hitachi S-2000掃描電鏡在15 kV的加速電壓下來產生證實存在形態學上可辨認的骨基質的圖像。
CFU-C測定
為了測試這些細胞的軟骨形成能力，在1150卬m下離心2xl()S個細胞5分鐘以便獲得作為沉淀的細胞。一旦除去上清液，就將細胞保持在補充有10ng/ml轉化生長因子-P(TGF-(3)(以及任選地補充有1(T7M 地塞米松)的SM中。每隔2天更換一次經補充的培養基，保持培養物3-5周，此刻收獲它們用于組織學(通過用10%中性福爾馬林緩沖液 (NFB)固定)、包埋于石蠟中、切成6 pm切片以及為膠原II的存在(抗體染色)以及氨基葡聚糖的存在(阿爾新藍染色)進行染色。染色證實在誘導條件下形成軟骨細胞。
CFU-A測定
為了評價細胞的生脂分化能力，將它們最初于6孔平板的SM(含有D-MEM)中培養，每隔2天更換一次培養基，直至它們達到60%匯合為止。此刻用生脂誘導培養基(AIM)(88。/。D-MEM、 3% FBS、 33^M 生物素、17pM泛酸鹽、5pMPPAR-Y、 100nM牛胰島素、1^M地塞米松、200pM異丁基曱基黃噤呤和10%抗生素)更換培養基。每隔2天更換一次AIM,持續10天，此刻在10%NFB中固定細胞并用油紅O(其將脂細胞的脂質泡染成紅色)染色。染色證實了不僅在誘導條件下，還在這些條件不存在的情況下(即自發地)形成了脂肪細胞。
CFU-M測定
為了評價細胞的生肌能力，將它們最初于T-75 cn^組織培養燒瓶的SM(含有D-MEM)中培養，直至它們達到80-90%匯合為止，此刻用生肌培養基(MM) (75% D-MEM、 10%FBS、 10%馬血清、50jiM氫化可的松和10%抗生素)更換培養基。每隔2天更換一次MM。在培養3-5 周后，從培養表面移出細胞(參見傳代培養實驗方案)，裂解以便獲得它們的mRNA,并通過rtPCR評價幾種生肌基因的存在，所述生肌基因包括MyoG、 MyoDl、 Myf5、肌球蛋白重鏈、成肌蛋白和結蛋白。結果證實在這些誘導條件下存在肌細胞。
數據分析四環素染色
在終止前添加四環素(9 pg/ml)到培養物中。在終止時，在Karnovsky 氏固定劑中固定細胞過夜，然后通過UV-激發的熒光成像觀察小結區礦物成分的四環素標記。
掃描電子顯微術(SEM)
30通過首先將CFU-0培養物置于70%、 80%、 90%和95%乙醇中1 小時，然后浸沒于100%乙醇中3小時，制備用于SEM的CFU-O培養物的代表性樣品。接著在臨界點干燥它們。用PolaronSC515 SEM涂層系統將大約3 nm的金層'踐涂在樣品上，然后在Hitachi S-2000掃描電鏡中于15kV的加速電壓下在不同的放大倍率下觀察。將所產生的圖像用于證實形態學上可辨認的骨基質的存在。
用于HLA-分型的流式細胞術
在含有2% FBS(StemCell批號S13E40)的PBS中洗滌>1 x 105個細胞的測試細胞群，并在4。C下重懸于具有飽和濃度(1:100稀釋)的下列綴合的小鼠IgGl HLA-A， B， C-PE和HLA-DR, DP, DQ-FITC的 PBS + 2% FBS中30分鐘。用PBS + 2% FBS洗滌細胞懸浮液兩次，用 l貼/ml 7-AAD(BD Biosciences)染色并重懸于PBS + 2% FBS中用于在使用ExpoADCXL4軟件(Beckman-Coulter)的流式細胞儀(XL，Beckman-Coulter， Miami, FL)上的分析。陽性染色定義為超過來自于用匹配的同種型抗體(FITC-和PE-綴合的小鼠IgGl, k單克隆同種型抗體標準物， BD Biosciences)染色的對照細胞群的〉99Q/o的細胞所獲得的水平的熒光信號發射。對于每一樣品，收集至少10,000個列表形式(listmode)的事件。在EXP0 32 ADC分析軟件中產生所有的圖。
除HLA分型之外，還評價了 HUCPV細胞群的其他標志，結果如
下標志表達
CD105《SH2》
CD73 (SH3>
CD90 (Thy1>
CD44+ +
CD"7(c-kit)15% +
MHCI75% +
MHCII-
CD106(VCAM1)-
STR01-
CD123(IL"3)
SSEA"4-
OcM-
-
CD34-
CD235a (血型糖蛋白A)-
CD45-
結果
骨小結集落的光學顯微照片
圖3、 4和5圖解說明了在第3天和第5天CFU-O存在于培養物中。它們證實了環繞在小結區域周圍的"成纖維細胞樣"細胞的匯合層由產生骨基質的多角形細胞的'聚集物，所代表。在Dex(+)和Dex(-) 培養物中都觀察到了這些CFU-O,并在連續傳代期間顯示類似的形態學。
CFU-0培養物的四環素標記
培養物的四環素標記用于標記與骨的生物礦化階段有關的新形成的磷酸釣。通過將培養物暴露于紫外線顯示，培養物的四環素標記與礦化小結區符合。圖6和7描繪了祖細胞培養第3天和第5天的四環素標記的CFU-O培養物。這些圖像是通過UV-激發的熒光成像產生并拍照的。
掃描電子顯孩i術
對于礦化膠原基質的形成，在SEM下觀察CFU-O,其證實了從最初的膠原形成階段到成熟的CFU-0中稠密礦化的基質的CFU-O形成。圖8、 9、 10、 11、 12和14是CFU-0的掃描電鏡照片。流式細胞術和HLA-分型
鑒定表現兩種主要組織相容性復合體(MHCs)的細胞表面抗原的流式細胞術證實了 77.4%的分離的細胞群為MHC -/-。圖13圖解說明了相對于陰性對照的流式細胞術結果。圖17顯示了在祖細胞群中凍融對 MHC-A細胞頻率的影響。對該凍融影響的研究如下
在含有2% FBS的PBS中洗滌>1 x 105個細胞的測試細胞群，并在 4°C下重懸于具有飽和濃度(1:100稀釋)的下列綴合的小鼠IgGl HLA畫A, B, C-PE(BD Biosciences #555553,批號M076246) (MHC 1)、 HLA-DR, DP, DQ-FITC(BD Biosciences #555558，批號M074842) (MHC II)和CD45國Cy-Cychrome(BD Biosciences # 555484,批號0000035746) 的PBS + 2% FBS中30分鐘。用PBS + 2% FBS洗滌細l包懸浮液兩次，并重懸于PBS + 2% FBS中用于在使用ExpoADCXL4軟件 (Beckman-Coulter)的流式細月包4義(XL， Beckman國Coulter, Miami, FL) 上的分析。陽性染色定義為超過來自于用匹配的同種型抗體(FITC- 、 PE-和Cy-cy chrome-綴合的小鼠IgGl ， k單克隆同種型標準物，BD Biosciences)染色的對照細胞群的>99%的細胞所獲得的水平的熒光信號發射，其通過人BM樣品的陽性熒光得以證實。對于每一樣品，收集至少10,000個列表形式(listmode)的事件。在EXPO 32 ADC分析軟件中產生所有的圖。
傳代培養和細胞接種
7天后利用0.1%胰蛋白酶溶液傳代培養(傳代)粘附細胞，此刻如通過光學顯微鏡所觀察到的它們顯示80-90%匯合。剛一傳代，就通過流式細胞術觀察到細胞表達MHC-A, B, C、 MHC-DR、 DP、 DQ和CD45。然后以4xl03個細胞/ci^將它們鋪于T-75組織培養聚苯乙烯燒瓶的SM 中，并用10-8MDex、 5mMp-GP和50 pg/ml抗壞血酸處理以測試這些細胞的成骨能力。在為了 CFU-O或骨小結形成的培養的第2、 3、 4、 5 和6天觀察這些燒瓶。還對任何來自傳代步驟的殘留細胞進行低溫保存供未來使用。
細胞的低溫保存在由90% FBS, 1()0/o二曱亞砜(DMSO)(SigmaD-2650,批號11K2320) 組成的lml總體積中制備lxl()S個PVT細胞的細胞等分試樣，并移液到lml聚丙烯低溫管形瓶中。將管形瓶置于-70。C冷凍機中過夜，第二天轉移到-150。C冷凍機中進行長期保存。在低溫保存一周后，解凍PVT 細胞并通過流式細胞術觀察MHC-A, B， C、 MHC-DR, DP， DQ和 CD45的表達。使用了另一種實驗方案，其中在一周低溫保存后解凍 PVT細胞，再培養一周，接著通過流式細胞術再次分析傳代培養中 MHC-A， B, C、 MHC-DR, DP， DQ和CD45的表達。
結果示于圖17中。注意到通過幾次傳代新鮮細胞群中MHCV-的頻率仍得以保持。當在傳代后于-150。C冷凍新鮮的細胞1周并立刻分析MHC表型時，該被分析的細胞群顯示顯著增加的MHC -A表型細胞頻率。因此，通過冷凍，MHC-A表型的細胞能有效地富集自PVT細胞群。剛一傳代前述冷凍細胞的培養物，就能實現更進一步的富集。特別是，并如圖17中所見的，低溫保存的細胞的笫一次傳代增加1411(:-/-細胞的相對群體至大于50%,并且繼續冷凍和傳代的那些細胞產生了大于80%、 85%、 90%和95%的MHC-A群。由于它們的非免疫原性特性，在人類治療中冷凍的PVT細胞自身可能是非常有用的。
粘附后HUCPV細胞級分的收獲
可以如下方式增加回收自血管周圍組織的祖細胞的產量。為了收獲HUCPVCs的"粘附后"(PA)級分，將最初接種的HUCPV收獲物的上清液重新鋪于新的T-75燒瓶上，并在37。C, 5%(302下溫育2天。然后用新鮮的SM補料最初接種的HUCPV燒瓶。2天后，將上清液再次轉移到新的T-75燒瓶中，并給粘附的細胞補料新鮮的SM。最后，吸出第三次接種的燒瓶的上清液，并給燒瓶補料新鮮的SM (因此，對于每一臍帶，產生了 3個燒瓶最初接種的燒瓶、第一PA級分和第二 PA級分)。類似于與最初接種的細胞相比較所見的這些細胞的相同的特性，證實了通過分離這些PA級分獲得了更高的細胞產率。類似于最初接種的HUCPVCs,這些PA細胞在培養中具有快速的增殖速度、自發產生骨小結，并能被誘導分化為其他三種細胞系軟骨、脂肪和肌肉。
包含^!L細力包的組織工^呈^:組合物
34在該實施例中，將細胞與以通常用于骨工程化領域的CAP/PLGA 形式存在的載體結合。為了接種CAP/PLGA支架，將它們切成5mmx 5mm的圓柱體。然后，將200 pl的2x10s HUCPVCs的懸浮液置于無菌的1.5mleppendorf管中，并將支架放入該懸浮液中。利用改變的移液管口(具有5 mm的吸口直徑)，吸入細胞懸浮液并通過往復移液操作徹底洗滌支架幾次。然后，在37。C, 5%(302下將支架在該懸浮液中溫育 4小時，以容許細胞與支架附著。4小時后，從懸浮液中取出支架并置于無組織培養處理的24-孔平板的各個孔中，補料lml的SM并在37。C， 5%C02下溫育14天，每隔2天更換一次SM。然后將支架在Karnovsky 氏固定劑中固定并準備用于SEM分析(見上)。在14天培養后， HUCPVCs完全覆蓋了支架。
如所述的，通過在適合于這樣的分化的條件下培養，PVT祖細胞群還可用于產生間充質細胞以及除骨之外的組織。為了產生脂肪細胞，例如，制備104個細胞/cm2濃度的祖細胞并鋪于3 5 mm組織培養亞中。細胞在前脂肪細胞培養基(PM)(DMEM/Ham'sF-10(l:l， v/v)、 10%胎牛血清、15 mM HEPES、 100 U/ml青霉素、100嗎/ml鏈霉素、0.25 ^g/ml 兩性霉素B)中培養3天。在3天后，除去PM，并將生脂培養基 (DMEM/Ham's F-10營養肉湯，1:1， v/v; HEPES緩沖液(15 mM);胎牛血清(3%);生物素(33MVI)、泛酸鹽(17 P-M)、人胰島素(100nM)、地塞米松(0.5 H-M)、 PPARY激動劑(1H-M)和抗生素)補料給細胞，接著培養3天。在誘導3天后，除去生脂培養基，并將培養物于脂肪細胞培養基(AM) (DMEM/Ham's F-10 (1:1， v/v)、 3。/。胎牛血清、1 地塞米松、100nM人胰島素、33pMD-生物素、17pM泛酸鈉、15 mM HEPES、 100U/ml青霉素，100 pg/ml鏈霉素，0.25 (xg/ml兩性霉素B) 中培養，每隔3天定期補料，確保僅除去一半的培養基，再補料相等體積的AM,因為如果除去所有的培養基，脂細胞會浮起。在四次補料 (12天)后，細胞看起來環繞著脂質小滴?？赏ㄟ^用油紅O和尼羅紅染色證實間充質細胞分化為脂細胞的陽性鑒定。
類似地，可利用以104個細胞/^112濃度制備并鋪于35 mm組織培養皿中的細胞懸浮液產生軟骨細胞。為促進軟骨形成，在沒有血清以及具有轉化生長因子-|33下培養細胞。在培養期間細胞沉淀發展為多層的富集基質的形態學，并且在組織學上顯示增加的富集蛋白多糖的細胞外基質。
為了產生成肌細胞，制備104個細胞/ c m濃度的細胞懸浮液并鋪于 35 mm組織培養皿中。將細胞在補充了 15。/。胎牛血清(FBS)的MCDB 120培養基的中保持1周(成肌細胞增殖培養基，MPM)。在1周時，基礎培養基(MPM)中血清水平下降至2%(成肌細胞分化培養基，MDM), 并在7天后終止培養。用適當的培養基對培養物再補料，一周三次。
因此，應當理解本發明提供了可作為活的人祖細胞有效來源的低溫保存的臍帶組織，所述活的人祖細胞具有用于產生不同的結締組織，包括骨以及無免疫能力的且理想地用于移植給人患者以治療結締組織狀況，包括骨疾病和病癥的祖細胞的特性。該人祖細胞產生自從鄰近臍帶血管外壁伸出的稱為血管周圍區的人臍帶膠質特定區域的提取物。提取自該區域的細胞群顯示了值得注意的特性，包括快速增殖、細胞形態改變，為如下事實所證明在所有的傳代培養燒瓶(大約7-10 次倍增)中第7天前出現細胞集落形成和不添加成骨補充物到培養基中出現骨小結形成，以及相對高頻率的MHC雙陰性細胞，剛一培養已冷凍的細胞其頻率就增加。
當在本文中使用時，術語"約"指為該術語所限定的值+/-10%的值。因此，"約-70C"的溫度可指載63C-77C范圍內的溫度。
下列文獻在此并入作為參考
引用的參考文獻
Aubin,JE， 1998, Bone stem cells: J Cell Biochem Suppl, v. 30-31， p. 73-82.
Canfield，AE, M J Doherty, B A AshtoA 2000， Osteogenic potential of vascular pericytes, in JE Davies (ed), Bone Engineering: Toronto, EM Squared, Inc., p. 143-151.
Caplan,AI， 1991， Mesenchymal stem cells: J Orthop,Res， v. 9, p. 641-650,
Chacko，AW, S R M Reynolds, 1954, Architecture of deistended'and nondistended human umbilical cord tissues, with special reference to the arteries and veins.: C咖egie Institution of Washington, Contributions to Embryology, v. 35， p. 135-150,Conget,P, J J Minguell, 1999， Phe加typical and ftmctional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells: J.Cell Physiol, v. "1, p. 67-73.
Haynesworth，SE, D Reuben, AI Caplan, 1998, Cell-based tissue engineering therapies: the influence of whole bo3y physiology.: Adv Drug Deliv Rev, v. 33， p. 3-14.
Kogler，G， S S咖ken, J A Airey， T Trapp， M Muschen^ N Feldhahn^ S Liedtke, R V Sorg， J Fischer, C Rosenbaum, S Gresdiatj A Knipper， J Bender, O Degjstirici, J Gao， A I Caplan， E J Colletti， G Almeida-Porad^ H W Muller， E Zanj幼i， P Wemet, 2004， A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential: J Exp.Msd., v. 200， p. 123-135.
Mitchell，KE， M L Weiss， B M Mitchell, P Martin, D Davis, L Morales, B Helwig， M Beerenstrauch, K Abou-Easa， T Hildreth， D Troyer, 2003， Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia: Stem Cells, v. 21, p. 50~60.
Pany,EW， 1970， Some electron microscope observations on the mesenchymal structures of fiill-term umbilical cord: Journal of Anatomy, v. 107， p. 505-518.
Pereda,J, P M Motta， 2002， New advances in human embryology: raorphofimctional relationship between the embryo and the yolk sac: Medical'Electron Microscopy, v. 32， p. 67-78.
Romanov,YA, V A Svintsitskaya， V N Smimov， 2003， Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: Candidate ^ISC-like cells from umbilical cord: Stem Cells， v. 21， p, 105-110.
Schoenberg，MD， A Hinman, R D Moore， l鄰O, Studies on connective tissue V, Feber formation in Wharton's Jelly.: Laboratory Investigation^ v. 9， p. 350-355,
Sen，A， Y R Lea-Currie， D Sujkowska^ D M Franklin^ W O Willcison^ Y D Halvorsen， J M Gimible， 2001， Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous: J.Cell Biochem., v. 81， p. 312-319.
Takechi，Kj Y Kuwabara, M Mizuno， 1993, Ultrastructural and immunohistochemical studies of Wharton's jelly umbilical cord cells: Placenta, v. 14， p. 235-245.
Tuchmann-Duplessis，H， G David, P Haegel， 1972， Illustrated Human Embryology, New York, Springer-Verlag p. 54-61.
Weiss，L， 1983, Histology: cell and tissue biology, New York, Elseiver Biomedical, p. 997-998.
Wharton，TW, 1656, Adenographia， Translated by Freer S. (1996). Oxford, U.K., Oxford University Press, p. 242-248,
3權利要求
1. 用于從冷凍的臍帶組織回收活細胞的方法，包括步驟1)獲得低溫保存的臍帶組織，其中臍帶組織已通過包括下述步驟的方法得以制備a)獲得包含活細胞的臍帶組織，b)將臍帶組織與含有含血清細胞培養基和低溫防護劑的低溫防護溶液組合，和c)對組合物進行冷卻處理，其中組合物在容許低溫防護劑滲入組織的時間和溫度下作為液體被冷卻，d)冷凍所冷卻的組合物以提供冷凍的組織，并任選地接著e)在低溫條件下保存所冷凍的組織；2)使冷凍的臍帶組織解凍；3)處理解凍的臍帶組織以用水置換低溫防護劑；以及4)從這樣處理的臍帶組織中回收活細胞。
2. 用于保留存在于臍帶組織中的細胞的存活力的方法，包括步驟a) 獲得包含活細胞的臍帶組織，b) 將臍帶組織與含有含血清細胞培養基和低溫防護劑的低溫防護溶液組合；c) 對組合物進行冷卻處理，其中組合物在容許低溫防護劑滲入組織的時間和溫度下作為液體^皮冷卻，d) 冷凍所冷卻的組合物，并任選地，接著e) 在低溫條件下保存所冷凍的組合物。
3. 才艮據權利要求1或2的方法，其中低溫防護劑為DMSO。
4. 根據權利要求1或2的方法，其中細胞培養基為胎牛血清。
5. 根據權利要求1或2的方法，其中低溫防護溶液按體積計包含 5-25。/。DMSO和75-95%胎牛血清。
6. 根據權利要求5的方法，其中低溫防護溶液是10%DMSO和 90%胎牛血清。
7. 根據權利要求l-6任一項的方法，其中臍帶組織是具有包含祖細胞的血管周圍臍帶膠質的臍帶血管或其片段。
8. 根據權利要求7的方法，其中臍帶組織是人臍帶組織。
9. 根據權利要求7或8的方法，其中臍帶組織基本上不含有血液。
10. 根據任一前述權利要求的方法，其中在約4C下進行至少20 分鐘的冷卻處理。
11. 根據任一前述權利要求的方法，其中在約-70C下進行冷凍處理。
12. 根據任一前述權利要求的方法，其中在約-196C下進行低溫保存。
13. 根據權利要求1和3-12任一項的方法，其中在約37C下進4亍解凍處理。
14. 根據權利要求1和3-13任一項的方法，其中通過在約4C下浸沒于水或緩沖液中處理解凍的臍帶。
15. 根據權利要求1和3-14任一項的方法，其中回收自保存的臍帶的活細胞為人臍帶血管周圍細胞。
16. 根據權利要求15的方法，其中通過消化臍帶膠質回收活細胞。
17. 以低溫保存狀態存在并包含能以存活狀態回收的祖細胞的臍帶組織，其通過根據權利要求2-14任一項的方法所制備。
18. 根據權利要求17的臍帶組織，以包含多個容器和注明每個容器內含物的目錄的組織庫形式存在，其中每個容器包含所述臍帶組織的樣品。
19. 根據權利要求17或權利要求18任一項的臍帶組織，其中臍帶組織為具有包含祖細胞的血管周圍臍帶膠質的臍帶血管或其片段。
20. 從冷凍的臍帶組織回收活HUCPVCs的方法，包括步驟1)獲得低溫保存的臍帶組織，其中臍帶組織為具有締合的血管周圍臍帶膠質的新鮮的、分離的人臍帶血管或其片段，并已通過包括下述步驟的方法得以制備a) 獲得所述臍帶組織，b) 將臍帶組織與含有含血清細胞培養基和DMSO的低溫防護溶液組合，c) 對組合物進行冷卻處理，其中組合物在容許DMSO滲入組織的時間和溫度下作為液體凈皮冷卻，d) 冷凍所冷卻的組合物，和e) 在低溫條件下保存所冷凍的組合物一段時間；并接著2) 使保存的臍帶組織解凍；3) 處理解凍的臍帶組織以用水置換DMSO;以及4) 消化與保存的血管締合的臍帶膠質以釋放活HUCPVCs。
全文摘要
從冷凍的臍帶組織提取活的祖細胞。在實施方案中，臍帶組織是具有血管周圍臍帶膠質的血管，并且所提取的祖細胞是HUCPVCs。
文檔編號C12N5/08GK101479377SQ200680053313
公開日2009年7月8日申請日期2006年12月21日優先權日2005年12月22日
發明者拉胡爾·薩魯加瑟, 簡·恩尼斯, 約翰·E·戴維斯申請人:簡·恩尼斯;拉胡爾·薩魯加瑟;約翰·E·戴維斯

完整全部詳細技術資料下載