本發明涉及間充質干細胞
技術領域：
，特別涉及一種檢測人胎盤胎兒側間充質干細胞抗氧化能力的方法。
背景技術：
：：間充質干細胞(Mesenchymastemcell,MSCs)，由于其強大的抗氧化及抗炎能力，目前已得到廣泛的關注。MSCs作為成體干細胞的一種，可以從多種組織細胞中分離出來，體外擴增后可用于人體疾病的治療。間充質干細胞在抗氧化方面的應用，基于以下特性：(1)能夠分泌抗氧化酶類物質抑制機體氧化反應；(2)能夠分泌小分子物質清除機體氧化自由基。MSCs在體外無血清培養的過程中，可以分泌抗氧化酶類以及其他小分子物質釋放到培養上清中。收集其培養上清進行抗氧化指標的檢測，可以發現其具有一定抗氧化能力，并可以清除氧化自由基，但具體的抗氧化成分還有待研究。氧化應激是諸多疾病的始動因素。機體在遭受氧化損傷后，由于氧化應激作用會產生活性氧簇(Reactiveoxygenspecies,ROS)，其中主要包括清除二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)、羥自由基(·OH)、超氧陰離子(O2—)、一氧化氮離子(NO2—)、過氧化氫離子(H2O2)等。正常生理狀況下，人體內自由基的產生和清除處于動態平衡狀態，自由基也是人體不可或缺的物質，參與有氧呼吸電子傳遞，細胞信號傳導和基因調控、誘導細胞增殖和凋亡、維持內環境穩態、維持個體的正常生長發育及抵抗細菌、病毒和癌癥等方面起著重要作用。然而，當機體遭受外來刺激時，會導致機體遭受氧化應激，自由基就會大量產生打破平衡，而多余的自由基就會攻擊生物膜引發一系列的自由基鏈反應，引發機體蛋白質，酶，脂質和核酸的氧化損傷，進而引發疾病。臨床現已證明多種疾病與自由基相關，主要包括：(1)神經退行性疾病：帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)、肌萎縮側索硬化癥(ALS)、亨廷頓病(HD)和中風等；(2)心腦血管疾病：動脈粥樣硬化、高血壓、缺血性心臟病等；(3)癌癥：膀胱癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等癌癥；(4)糖尿病，系統性紅斑狼瘡，骨質增生異常綜合癥，風濕性關節炎、白內障、哮喘、小兒肺炎，缺血再灌注損傷等其他疾病相關。因此，在治療此類疾病時，針對其發病機制的抗氧化以及清除自由基方面的治療變得尤為重要，或許可以推測，如果外界干預治療可以清除機體多余的氧化自由基，便可以在根本上治愈此類疾病，療效可以優于當前臨床治療上針對于疾病表現所采取的治療措施，以“本”代“標”。當前關于間充質干細胞的大多數研究主要針對于間充質干細胞本身的抗炎作用以及其多向分化能力，而一些動物實驗證明間充質干細胞同樣具有抗氧化作用。SALLYM.SHALABY等人將大腸桿菌通過氣管進入到大鼠體內，造成大鼠急性肺損傷模型，然后將骨髓來源的間充質干細胞通過尾靜脈注射到大鼠體內，結果顯示：間充質干細胞能明顯減輕大鼠肺損傷，且接受間充質干細胞的實驗組大鼠血清的抗氧化酶類物質，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等與對照組相比均有不同程度的提高。ShirongNi等也同樣在體內實驗中證實了間充質干細胞具有修復損傷肺組織的能力，且此修復能力是通過Nrf2抗氧化信號通路進行的。而究其作用機制，有些觀點認為間充質干細胞的抗氧化能力是通過其旁分泌作用發揮功能的。間充質干細胞在分裂增殖的過程中，會向外周分泌微泡/外泌體，其表面攜帶小分子蛋白，此類小分子可以通過調控抗氧化信號通路來發揮抗氧化作用，或者分泌一些抗氧化酶類物質，酶類抗氧化物在銅、鋅、錳、鐵等輔因子的協助下通過分解或消除自由基以達到抗氧化的目的，此過程反應復雜、需多步才能完成，其間可能會引發自由基鏈反應，產生新的自由基或氧化物。因此，申請人認為不僅間充質干細胞在體內治療中可以發揮作用，其在體外培養過程中將抗氧化活性物質分泌到培養基中，所得的培養上清也具有抗氧化作用。為此，提供一種檢測間充質干細胞培養上清的清除自由基能力以及其中的抗氧化酶活性的方法。技術實現要素：：本發明的目的旨在拓展間充質干細胞在臨床治療方面的應用，為臨床上間充質干細胞的無細胞治療提供依據，提供一種檢測人胎盤胎兒側間充質干細胞無血清培養所得上清抗氧化能力的方法。為實現上述目的，本發明采取以下技術方案：一種檢測人胎盤胎兒側間充質干細胞抗氧化能力的方法，該方法是應用人胎盤胎兒側間充質干細胞培養上清作為實驗對象，檢測所述培養上清中人胎盤胎兒側間充質干細胞分泌的抗氧化成分的抗氧化能力，從而間接推斷出人胎盤胎兒側間充質干細胞及其培養上清中的抗氧化能力，為其后期的研究及應用提供依據。上述檢測人胎盤胎兒側間充質干細胞抗氧化能力的方法，包括如下步驟：從胎盤中提取人胎盤胎兒側間充質干細胞得原代人胎盤胎兒側間充質干細胞；將原代人胎盤胎兒側間充質干細胞進行培養得第一代間充質干細胞，并進行凍存；收集不同個體的第一代間充質干細胞，復蘇后進行體外培養至第六代，收集第二代到第六代無血清培養上清，檢測其總抗氧化能力、清除自由基能力以及抗氧化酶類物質活性。上述方法具體步驟為：(1)人胎盤間充質干細胞的分離從人胎盤中取得胎兒側胎盤，將其剪碎后經過漂洗、離心、離心上清收集、過篩后得到原代人胎盤胎兒側間充質干細胞；(2)原代人胎盤胎兒側間充質干細胞的原代培養將原代人胎盤胎兒側間充質干細胞培養10～15天，待局部融合度達到80％后進行傳代，得到第一代間充質干細胞，并進行凍存；(3)第一代間充質干細胞的傳代培養復蘇第一代間充質干細胞至培養皿中，使用無血清培養基培養至80％融合后收集上清，部分凍存后進行傳代培養至第六代，每代次收集上清離心分裝后于-80℃凍存，進行檢測；(4)將檢測得到的各組數據采用SPSS19.0統計軟件，分別進行樣本組與空白對照組相比，觀察所得數據是否有統計學差異。上述檢測內容主要包括：①總抗氧化能力(T-AOC)測定：上清中的抗氧化物質可以將Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質形成穩定的絡合物，通過比色法測定出其抗氧化能力的高低。由于抗壞血酸/維生素C(VC)是已知并公認的抗氧化物質，故在預實驗中首先檢測出所得上清的大致范圍，再用培養基配制成不同濃度的VC溶液，檢測其抗氧化活性，然后選取其數值為上清抗氧化能力2倍左右的VC溶液作為后續實驗的標準陽性對照，同時使用空白培養基作為陰性對照。正式實驗中，采用此法分別檢測對照組、VC組以及間充質干細胞上清的總抗氧化能力。②清除二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)能力的檢測：DPPH·是一種以氮為中心的自由基，含有一個單電子，在517nm處有強烈的吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色，加入培養上清后，測定清除DPPH·而引起的吸光度的減少可以反映其抗氧化能力的強弱。本實驗采用此法分別檢測對照組、VC組以及間充質干細胞上清的清除DPPH·自由基的能力。③抑制羥自由基(·OH)能力：羥自由基是一種氧化能力很強的自由基，其性質很活潑，氧化各種有機物和無機物的速率極快，是造成組織脂質過氧化、核酸斷裂、蛋白質和多糖分解的主要因素，與機體衰老、腫瘤、輻射孫損傷和細胞吞噬能力有關。Fenton反應是最常見的產生羥自由基的化學反應，H202的量和Fenton反應產生的·OH量成正比，當給予電子受體后，用griess試劑顯色，形成紅色物質，其呈色與·OH的多少成正比關系。依據此原理檢測出對照組、VC組以及間充質干細胞上清的抑制羥自由基的能力。④抗超氧陰離子自由基(O2—)能力：此實驗模擬機體中黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應系統，產生超氧陰離子自由基，加入電子傳遞物質及gress顯色劑，使反應體系呈現紫紅色，可用分光光度計測其吸光度。當抗超氧陰離子的物質可抑制該反應使超氧陰離子自由基減少，故比色時顏色變淺；依據形成物的顏色深淺計算出抑制或產生超氧陰離子自由基的能力強弱。依據此原理檢測出對照組、VC組以及間充質干細胞上清的抗超氧陰離子自由基(O2—)的能力。⑤超氧化物歧化酶(SOD)活力測定：SOD是人體內清除超氧陰離子自由基的酶，在維持機體自由基平衡上有重要作用。本實驗通過模擬黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶系統產生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現紫紅色，用可見光分光光度計測定其吸光度。當被測樣本中含SOD時，則亞硝酸鹽減少，比色管吸光度值降低。依據此原理檢測出對照組、VC組以及間充質干細胞上清的超氧化物歧化酶活力。⑥谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性測定：谷胱甘肽過氧化物酶(GSH—PX)是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解的酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對氫過氧化物的還原反應。一般認為它在細胞內能清除有害的過氧化物代謝產物，阻斷脂質過氧化鏈鎖反應，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子呈現較穩定的黃色，在412nm處測其吸光度即可算出GSH的量。依據此原理檢測出對照組、VC組以及間充質干細胞上清谷胱甘肽過氧化物酶的活力。以上各組數據采用SPSS19.0統計軟件，分別進行實驗組和VC組與對照組進行兩樣本均數比較，P＜0.05時認為差異具有統計學意義。本發明的有益效果在于：該方法通過測定人胎盤間充質干細胞培養上清的抗氧化能力，進而推斷間充質干細胞的總體抗氧化能力，為后續的實驗奠定基礎。由其結果得知：(1)在總抗氧化能力方面，人胎盤間充質干細胞培養上清具有一定的抗氧化能力，其中總抗氧化能力(T-AOC)約相當于30-70μmol/LVC的總抗氧化能力，且其總抗氧化能力與空白對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.05)；(2)在清除自由基能力上，人胎盤間充質干細胞培養上清在清除DPPH·、·OH和O2—自由基上均具有一定作用，且其清除自由基能力與空白對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.05)；(3)在抗氧化酶類活性測定上，人胎盤間充質干細胞培養上清中可以檢測到超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GDH-PX)活性，且與空白對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.05)。附圖說明：圖1是本發明中不同濃度VC的總抗氧化能力的標準曲線圖；圖2是本發明中對照組、VC組以及樣本組的總抗氧化能力的對比圖；圖3是本發明中對照組、VC組以及樣本組的清除二苯基苦基苯肼自由基能力的對比圖；圖4是本發明中對照組、VC組以及樣本組的抑制羥自由基能力的對比圖；圖5是本發明中對照組、VC組以及樣本組的抗超氧陰離子自由基能力的對比圖；圖6是本發明中對照組、VC組以及樣本組的超氧化物歧化酶活力的對比圖；圖7是本發明中對照組、VC組以及樣本組的谷胱甘肽過氧化物酶活性的對比圖。具體實施方式：通過下面的實施例可以對本發明進行進一步的描述，然而，本發明的范圍并不限于下述實施例。本發明檢測人胎盤胎兒側間充質干細胞抗氧化能力的方法，包括如下步驟：S1：人胎盤間充質干細胞的分離及原代培養(1)將胎盤放入無菌托盤中，剝離外層薄膜，利用已消毒的手術剪將胎兒側胎盤剪至厚度約為0.5cm的組織塊，此過程盡量避開血管，立即浸泡至含有雙抗(兩性霉素、鏈霉素)的PBS中，漂洗三次至液體變為透明或微紅；(2)將上述組織剪至碎末狀，并始終保持組織濕潤，將組織塊轉入50ml無菌離心管中，根據收集的組織量加入相應的膠原酶A(5mg/ml)，放入37℃水浴中消化2h；(3)收集上述上清至離心管中，PBS重懸沉淀的細胞團塊，加速度為9，離心力為500g進行離心，當離心力接近500g時，加速度降至1并按停止離心取上清，此操作重復3次；(4)將收集的上清離心(500g/min，10min)，棄去上清，加入DMEM培養基使細胞重懸，并進行過篩，即100μm濾網過篩后再置于40μm濾網進行過篩；(5)將過篩后的懸液離心(1000r/min，4min)，棄去上清，加入間充質干細胞無血清培養基使細胞重懸，并將細胞懸液接種到已包被的10cm培養皿中，放入37℃，5％CO2細胞培養箱中培養，即得原代間充質干細胞；(6)剩余的細胞使用凍存液重懸后轉入凍存管中，放入凍存盒，-80℃過夜后轉入液氮罐中保存，即原代間充質干細胞；(7)10-15天內觀察步驟(5)中培養的細胞，觀察到原代間充質干細胞呈梭形或多角形，待局部融合度達80％后進行傳代及凍存，此時細胞為第一代間充質干細胞。S2：第一代間充質干細胞的傳代培養及培養上清收集(1)取9ml原代間充質干細胞無血清完全培養基加入到已包被的10cm培養皿中，放入37℃，5％CO2細胞培養箱中平衡；(2)從液氮罐中取出第一代間充質干細胞，37℃水浴復蘇后與2ml培養基完全混合，離心去除上清，加入1ml培養基重懸細胞，接種到已平衡至37℃的培養皿中，放入培養箱中培養；(3)48h后鏡下觀察細胞融合率約為80％時，收集培養上清，離心后去除死細胞，再將上清按需進行分裝，與-80℃進行保存；此次收集的即為第二代間充質干細胞上清；(4)培養皿中的細胞使用37℃的PBS沖洗后，使用間充質干細胞專用消化酶進行消化，并按照1：3進行傳代，其中2/3細胞進行凍存，1/3細胞用于傳代，培養時間同樣為48h，細胞融合率達到80％；(5)按照以上操作收集第三代至第六代間充質干細胞培養上清，以上操作為培養及收集單個個體的樣本，本發明重復三個人的樣本。S3：人胎盤間充質干細胞培養上清的各項抗氧化指標的檢測(1)各項抗氧化指標檢測前，先將第二代至第六代間充質干細胞上清取出，放入4℃融解，使用前平衡至室溫；(2)不同濃度VC及樣本組(三個不同個體第二代至第六代上清)的總抗氧化能力(T-AOC)的檢測稱取m＝0.176gVC，雙蒸水配制VC母液，即VC母液＝1000μmol/L；再按照下表1配制不同濃度的VC溶液，溶劑為間充質干細胞完全培養基：C母取樣量(μl)加入培養基量(μl)VC終濃度(μmol/L)0100001099010209802040960408092080100900100200800200每個樣本測定包含測定管和對照管，各設置三次平行重復。測定管需要將100μl樣品加入反應體系中，再與已加入反應體系的對照管同時置于37℃中水浴30min后加入顯色終止液，最后向對照管中加入100μl樣品，混勻后靜置10min，在520nm處測定各管吸光度值。根據公式：計算出各樣本總抗氧化能力。由圖1、圖2所示，不同濃度VC及樣本組的總抗氧化能力的檢測結果對比可知：人胎盤間充質干細胞培養上清具有一定的抗氧化能力，其中總抗氧化能力(T-AOC)約相當于30-70μmol/LVC的總抗氧化能力，且其總抗氧化能力與空白對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.05)。(3)VC組、對照組、樣本組(三個不同個體第二代至第六代上清)DPPH·清除率的測定DPPH溶液配制：稱取DPPH顆粒0.01g于少量無水乙醇混合，充分攪拌溶解，再以50％乙醇為溶劑定容至50ml，配制成0.2g/L母液，臨時使用時用50％乙醇稀釋10倍成DPPH溶液，按下式加樣；每組三次平行重復：A0：3.5mlDPPH溶液+0.5ml試樣溶劑A：3.5mlDPPH溶液+0.5ml試樣B：3.5mlDPPH溶液的溶劑(50％無水乙醇)+0.5ml試樣根據公式：DPPH·自由基清除率(％)＝[1-(A-B/A0)]*100％(4)對照組、VC組以及樣本組(間充質干細胞上清)的抑制羥自由基(·OH)能力的測定實驗分為空白管、標準管、對照管和測定管，每管平行測定三次；其中空白管使用雙蒸水作為對照，標準管使用0.03％H2O2作為對照。測試前先將各試劑在37℃中水浴平衡，且需在37℃水浴中將各組樣品加入反應體系，準確反應1min后加入顯色劑，混勻后室溫放置20min，在波長為550nm處測定各管吸光度值。根據公式：計算出各管抑制羥自由基能力。(5)對照組、VC組以及樣本組(間充質干細胞上清)的抗超氧陰離子自由基(O2—)能力的測定實驗分為對照管、標準管和測定管，每管平行測定三次；其中空白管以雙蒸水作為對照，標準管以0.15mg/ml的VC標準品作為對照，測定管則加入上清樣品。將各組樣品加入反應體系后，37℃水浴40min后加入顯色劑，混勻后室溫放置10min，在波長為550nm處測定各管吸光度值。根據公式：計算出各管抗超氧陰離子活力單位。由圖3～圖5所示，對照組、VC組以及樣本組(間充質干細胞上清)在清除自由基能力的測定結果可知：人胎盤間充質干細胞培養上清在清除DPPH·、·OH和O2—自由基上均具有一定作用，且其清除自由基能力與空白對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.05)。(6)對照組、VC組以及樣本組(間充質干細胞上清)的超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定實驗分為對照管和測定管，每管平行測定三次。其中空白管以雙蒸水作為對照，測定管則加入上清樣品。將各組樣品加入反應體系后，37℃水浴40min后加入顯色劑，混勻后室溫放置10min，在波長為550nm處測定各管吸光度值。根據公式：計算出各管SOD活力。(7)對照組、VC組以及樣本組(間充質干細胞上清)的谷胱甘肽過氧化物酶(GDH-PX)活性的測定實驗分為酶促反應和顯色反應兩階段進行①酶促反應：實驗分為非酶管和酶管，每管平行重復三次。其中酶管需在37℃水浴前加入待測樣品，而非酶管在水浴后加入待測樣品。酶促反應完成后充分混勻，3800r/min離心10min，取上清1ml做后續顯色反應。②顯色反應：實驗分為空白管、對照管、非酶管和酶管，每管平行重復三次。其中空白管加入GSH標準溶劑應用液，標準管加入20μmol/L的GSH標準液，非酶管和酶管分別加入1ml酶促反應所得上清。將上述樣品顯色反應體系后，混勻后室溫放置15min，在波長為412nm處測定各管吸光度值。根據公式：計算出各管GSH-PX活力單位。由圖6、圖7所示，對照組、VC組以及樣本組(間充質干細胞上清)在抗氧化酶類活性測定結果可知：人胎盤間充質干細胞培養上清中可以檢測到超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GDH-PX)活性，且與空白對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.05)。當前第1頁1 2 3