專利名稱：一種柳枝稷的體外繁殖方法
技術領域：
本發明涉及生物能源植物柳枝稷的生物技術領域，進一步涉及一種柳枝稷體外繁殖的方法。
背景技術：
柳枝稷(英文名Switchgrass，拉丁名Panicum virgatum Linn)屬于禾本科，黍屬，是一種多年生的優良牧草，在我國已有悠久的栽培歷史。近幾年來，因其栽培技術簡單，適應性廣，防風固沙能力強，耐瘠薄，生物學產量高，可利用低質地或荒漠化土壤，被國際上確定為替代糧食資源以生產燃料乙醇的首選生物能源植物。目前，世界上以美國為代表的許多國家都投入了大量的人力、物力進行柳枝稷的研究開發。其中，采用生物技術增強柳枝稷的抗逆性，提高光合效率，增加生物學產量，降低木質素含量和提高乙醇產率等方面已成為目前的研究熱點之一。
體外繁殖技術是生物技術的主要組成部分之一，在遺傳轉化體系的建立，優良種質規模的擴張(包括常規品種和轉基因材料)和瀕危物種的繁殖保存等方面都具有十分重要的意義。目前，在柳枝稷的體外繁殖方面，主要采用從人工誘導的愈傷組織中再生植株的傳統方法。然而，與大多數禾本科植物的組織培養相似，柳枝稷在人工誘導愈傷組織方面也存在基因型差異，培養周期長，再生率低，成本較高等缺點，使生物技術在柳枝稷上的應用受到了一定限制。探索一種避開通過愈傷組織再生植株的體外繁殖方法，對柳枝稷的生物技術研究將起到很大的促進作用。

發明內容
針對上述現有柳枝稷體外繁殖技術存在的缺陷或不足，本發明的目的在于，提供一種柳枝稷的體外繁殖方法，以拓寬柳枝稷組織培養和遺傳轉化的基因型范圍，縮短培養周期，提高再生率，降低實驗成本，加速轉基因植株后代的繁殖，推進生物技術在柳枝稷上的廣泛應用。
為了實現上述任務，本發明采用如下的技術解決方案一種柳枝稷的體外繁殖方法，其特征在于，該方法按如下步驟進行步驟一選擇適宜生長發育階段的莖節組織在柳枝稷生長發育至有5～6個節時，去除頂端和基部的2個莖節，人工切取中間3～4個莖節處的莖節組織，莖節組織包含切取莖節的上下區段各1～1.5cm長度。
步驟二誘導初生再生芽對莖節組織進行滅菌，以MBP培養基人工誘導初生再生芽，其中，MBP培養基為MS無機鹽和維生素混合物4.43g/L，麥芽糖30g/L，6-芐基氨基嘌呤3mg/L，瓊脂粉7.5g/L，PH＝5.8，28℃條件下光照培養至再生芽長度為0.5cm～1.5cm。
步驟三叢生芽塊生長點的人工處理沿再生芽基部2mm～3mm處切除再生芽，28℃條件下繼續光照培養至再生芽長度為0.5cm～1.5cm時，再次切除再生芽，重復進行4～5次，至莖節組織處的叢生芽塊直徑為0.5cm左右。
步驟四叢生芽的大量誘導再以MBP培養基對叢生芽塊進行人工誘導，28℃條件下，光照培養至叢生芽長度平均為2.0cm～2.5cm，再生出較大規模的叢生芽。
步驟五叢生芽生根培養沿叢生芽塊基部切取并分離出每個叢生芽，轉入生根培養基SMO中，28℃，光照條件下培養2～4星期至每個叢生芽幼苗高度約為5cm以上，得到再生植株；其中，生根培養基SMO為MS無機鹽和維生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、瓊脂粉7.0g/L，pH＝5.8。
步驟六移栽至溫室或大田將再生植株煉苗3～5天后，移栽至溫室或大田即可。
本發明與傳統的通過人工誘導愈傷組織再生植株的柳枝稷體外繁殖方法相比，在組織培養和遺傳轉化的基因型選擇，培養周期，再生頻率及促進轉基因植株后代的繁殖等方面都取得了較大的提高，效果顯著。具體表現在1.拓寬了柳枝稷組織培養和遺傳轉化的基因型范圍與大多數禾本科植物的組織培養相似，柳枝稷在人工誘導愈傷組織方面也存在基因型差異。因為愈傷組織的分化能力在很大程度上是受基因型影響的，這使柳枝稷組培或轉化材料的選用受到了很大限制，造成目前組培或轉化都集中在個別基因型(目前主要選用的基因型為Alamo)，而這些基因型又并非生產實踐所需要或在生產上應用很有限。育種上要利用導入的外源目的基因，目前還只能采用傳統的常規育種方法如回交、雜交等方法將其轉育到生產上推廣的優良品種中，造成了人力、物力的浪費。本發明利用柳枝稷莖節生長點直接再生植株，不需要經過愈傷組織的分化階段，實踐證明可以利用生產上現有的所有基因型，極大地拓寬了柳枝稷組織培養和遺傳轉化的基因型范圍，為利用生物技術對柳枝稷進行遺傳改良奠定了良好的基礎。
2.提高了柳枝稷的再生頻率柳枝稷愈傷組織的分化能力在很大程度上是受基因型影響的，因此，不同基因型材料的再生頻率存在較大差異。除個別基因型可獲得較高的再生頻率外，大多數材料的再生頻率都較低，個別材料甚至不能獲得再生植株。本發明利用莖節生長點直接再生植株，再生率接近100％，同時獲得再生植株的比例也較傳統愈傷組織培養法大幅度地提高。一般情況下，采用傳統愈傷組織再生法每塊胚性愈傷組織可再生出1～數十個再生植株，而本發明每個莖節生長點平均可再生出50～100個以上的再生植株。如果同時將獲得胚性愈傷組織的概率計算在內(通常柳枝稷胚性愈傷組織得率大多低于10％或更少)，本發明大幅度地提高了柳枝稷的再生頻率。
3.縮短了柳枝稷的培養周期采用傳統愈傷組織再生法，從誘導愈傷組織開始到再生植株移栽至溫室，一般需要120～150天。本發明利用柳枝稷莖節生長點直接再生植株，不需要經過愈傷組織的分化階段，通常只需要80～100天，縮短了柳枝稷的培養周期。
4.降低了實驗成本與傳統的從人工誘導的愈傷組織中再生植株的柳枝稷體外繁殖方法相比，本發明不需要增加額外的昂貴試劑，縮短了培養周期，提高了再生頻率，使實驗成本相應降低。通過計算，較傳統的柳枝稷體外繁殖方法單株再生植株成本可降低50％以上。
5.可迅速擴大轉基因植株的規模利用本發明的柳枝稷體外繁殖方法，結合分子生物學實驗技術，可迅速擴大含有外源目的基因的轉基因植株的規模，為目標基因的功能驗證和利用轉基因技術對柳枝稷進行遺傳改良奠定了一個強有力的基礎。
具體實施例方式
本發明選擇柳枝稷適宜生長階段的莖節組織，在MBP培養基上誘導再生芽，對叢生芽塊生長點進行人工處理，采用人工方法大量誘導叢生芽，叢生芽的生根培養，將再生植株移栽至溫室或大田。具體按如下步驟進行(1)選擇適宜生長發育階段的莖節組織在柳枝稷生長發育至有5～6個節時，去除頂端和基部的2個莖節，人工切取中間3～4個莖節處的莖節組織，每個莖節組織取材包含莖節的上下區段各1～1.5cm長度。
(2)誘導再生芽
a.采用70％質量分數的酒精表面消毒1分鐘；b.采用20％質量分數的商業用次氯酸鈉(加入0.1％的吐溫80)滅菌15分鐘；c.以MBP培養基人工誘導初生再生芽，其中，MBP培養基為MS無機鹽和維生素混合物4.43g/L、麥芽糖30g/L、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)3mg/L、瓊脂粉7.5g/L，PH＝5.8；d.28℃，光照培養7～10天至再生芽長度為0.5～1.5cm。
(3)叢生芽塊生長點的人工處理a.沿再生芽基部2～3mm處切除再生芽；b.將莖節組織重置于MBP培養基上，28℃，光照培養；c.在再生芽長度為0.5～1.5cm時，沿再生芽基部2～3mm處再次切除再生芽；d.重復進行切除培養4～5次，至莖節組織處的叢生芽塊直徑為0.5cm左右。
(4)叢生芽的大量誘導a.將莖節組織轉移至MBP培養基上(MBP培養基配方同上)；b.28℃，光照培養至叢生芽長度平均為2.0～2.5cm，每個叢生芽塊上可再生出較大規模的叢生芽。
(5)叢生芽生根培養a.沿叢生芽塊基部切取并分離出每個叢生芽；b.轉入生根培養基SMO中，28℃，光照條件下培養2～4星期至幼苗高度約為5cm以上，得到再生植株。其中，生根培養基SMO為MS無機鹽和維生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、瓊脂粉7.0g/L，pH＝5.8。
(6)移栽至溫室或大田將再生植株煉苗3～5天后，移栽至溫室或大田即可。
本發明的總體操作流程為選擇適宜生長階段的莖節組織→誘導再生芽→叢生芽塊生長點的人工處理→叢生芽的大量誘導→叢生芽生根培養→移栽至溫室或大田。
以下是發明人給出的具體實施例。
實施例1對Alamo，Blackwell，GA-001A和N.Switchgrass四個柳枝稷品種進行體外繁殖。具體生產過程為(1)切取莖節組織在柳枝稷四個品種分別生長發育至有5～6個節時，去除頂端和基部的2個莖節，人工切取中間3～4個莖節處，每個莖節取材包含莖節處的上下區段各1～1.5cm長度。
每個品種分別切取來源不同植株的莖節組織100個。
(2)誘導再生芽a.將莖節組織置于培養皿中，采用70％質量分數的酒精表面消毒1分鐘；b.棄去酒精，采用20％質量分數的商業用次氯酸鈉(加入0.1％的吐溫80)滅菌15分鐘；c.用無菌水沖洗3次，在MBP培養基上人工誘導初生再生芽，每皿放置2個莖節組織；其中，MBP培養基為MS無機鹽和維生素混合物4.43g/L、麥芽糖30g/L、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)3mg/L、瓊脂粉7.5g/L，PH＝5.8；d.28℃，光照培養7～10天至再生芽長度為0.5～1.5cm。
其中，Alamo有4個莖節未誘導出初生再生芽，Blackwell和GA-001A各有1個莖節組織未誘導出初生再生芽。
(3)叢生芽塊生長點的人工處理a.用無菌刀片沿再生芽基部2～3mm處切除再生芽，注意不能傷及莖節組織的生長點；b.將莖節組織重置于MBP培養基上，28℃，光照培養；c.在再生芽長度為0.5～1.5cm時，沿再生芽基部2～3mm處切除再生芽；d.Alamo重復進行切除培養5次，其余三個品種重復進行切除培養4次，至莖節組織處的叢生芽塊直徑為0.5cm左右。
(4)大量叢生芽的誘導a.將Alamo，Blackwell，GA-001A和N.Switchgrass四個品種的莖節組織連同叢生芽塊轉移至MBP培養基上(MBP培養基配方同上)，每皿放置1個莖節組織；b.28℃，光照培養至叢生芽長度平均為2.0～2.5cm，每個叢生芽塊上可再生出大量的叢生芽。
經過調查，Alamo每個莖節組織的叢生芽塊平均可再生出62.5個叢生芽，Blackwell為96.5個，GA-001A為87.9個，N.Switchgrass為91.3個。
(5)叢生芽生根培養a.沿叢生芽塊基部切取并分離出每個叢生芽；b.將每個叢生芽轉入生根培養基SMO中，28℃，光照條件下培養3～4星期至幼苗高度約為5cm以上，得到再生植株。其中，生根培養基SMO為MS無機鹽和維生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、瓊脂粉7.0g/L，pH＝5.8。
(6)移栽至溫室打開培養瓶封口，將再生植株煉苗3～5天后，移栽至溫室即可。
經過調查，不計在生根培養階段和幼苗階段死亡的叢生芽或幼苗，Alamo共獲得5725株再生植株，Blackwell共獲得9150株再生植株，GA-001A共獲得8371株再生植株，N.Switchgrass共獲得8639株再生植株。
實施例2對導入葉片衰老抑制基因PSAG12-IPT的T1代Alamo轉基因植株進行體外繁殖。具體生產過程為(1)切取莖節組織經過PCR和Southern雜交檢測，鑒定出含有PSAG12-IPT目標基因的T1代Alamo轉基因植株。在轉基因植株生長發育至有6個節時，去除頂端和基部的2個莖節，人工切取中間4個莖節處，每個莖節組織取材包含莖節上下區段各1～1.5cm長度，共切取100個來源不同轉基因植株的莖節組織。
(2)誘導再生芽a.將莖節組織置于培養皿中，采用70％質量分數的酒精表面消毒1分鐘；b.棄去酒精，采用20％質量分數的商業用次氯酸鈉(加入0.1％的吐溫80)滅菌15分鐘；c.用無菌水沖洗3次，在MBP培養基上人工誘導初生再生芽(MBP培養基配方同實施例1)，每皿放置2個莖節組織；d.28℃，光照培養7～10天至再生芽長度為0.5～1.5cm。其中，有2個莖節未誘導出初生再生芽。
(3)叢生芽塊生長點的人工處理a.用無菌刀片沿再生芽基部2～3mm處切除再生芽；b.將莖節組織重置于MBP培養基上，28℃，光照培養；c.在再生芽長度為0.5～1.5cm時，沿再生芽基部2～3mm處切除再生芽；d.重復進行切除培養5次，至莖節組織處的叢生芽塊直徑為0.5cm左右。
(4)大量叢生芽的誘導
a.將Alamo T1代轉基因植株的莖節組織連同叢生芽塊轉移至MBP培養基上，每皿放置1個莖節組織；b.28℃，光照培養至叢生芽長度平均為2.0～2.5cm，每個叢生芽塊上可再生出大量的叢生芽。經過調查，每個莖節組織的叢生芽塊平均可再生出57.3個叢生芽。
(5)叢生芽生根培養a.沿叢生芽塊基部切取并分離出每個叢生芽；b.將每個叢生芽轉入生根培養基SMO中，28℃，光照條件下培養3～4星期至幼苗高度約為5cm以上，得到再生植株。
(6)移栽至溫室打開培養瓶封口，將再生植株煉苗3天后，移栽至溫室即可。
經過調查，不計在生根培養階段和幼苗階段死亡的叢生芽或幼苗，共獲得5227株再生植株。隨機提取50株再生植株的基因組DNA，經過PCR和Southern雜交檢測，50株再生植株全部含有PSAG12-IPT目標基因，表明本發明可以作為柳枝稷轉基因植株后代快速純合和繁殖的有效手段。
權利要求
1.一種柳枝稷的體外繁殖方法，其特征在于，該方法按如下步驟進行步驟一選擇適宜生長發育階段的莖節組織在柳枝稷生長發育至有5～6個節時，去除頂端和基部的2個莖節，人工切取中間3～4個莖節處的莖節組織，莖節組織包含切取莖節的上下區段各1～1.5cm長度；步驟二誘導初生再生芽對莖節組織進行滅菌，以MBP培養基人工誘導初生再生芽，其中，MBP培養基為MS無機鹽和維生素混合物4.43g/L，麥芽糖30g/L，6-芐基氨基嘌呤3mg/L，瓊脂粉7.5g/L，PH＝5.8，28℃條件下光照培養至再生芽長度為0.5cm～1.5cm；步驟三叢生芽塊生長點的人工處理沿再生芽基部2mm～3mm處切除再生芽，28℃條件下繼續光照培養至再生芽長度為0.5cm～1.5cm時，再次切除再生芽，重復進行4～5次，至莖節組織處的叢生芽塊直徑為0.5cm左右；步驟四叢生芽的大量誘導再以MBP培養基對叢生芽塊進行人工誘導，28℃條件下，光照培養至叢生芽長度平均為2.0cm～2.5cm，再生出較大規模的叢生芽；步驟五叢生芽生根培養沿叢生芽塊基部切取并分離出每個叢生芽，轉入生根培養基SMO中，28℃，光照條件下培養2～4星期至每個叢生芽幼苗高度約為5cm以上，得到再生植株；其中，生根培養基SMO為MS無機鹽和維生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、瓊脂粉7.0g/L，pH＝5.8；步驟六移栽至溫室或大田將再生植株煉苗3～5天后，移栽至溫室或大田即可。
全文摘要
本發明公開了一種柳枝稷的體外繁殖方法。具體為在柳枝稷生長發育至有5～6個節時，切取中間3～4個莖節處，在MBP培養基上人工誘導再生芽；對叢生芽生長點人工重復切除處理4～5次至叢生芽塊直徑為0.5cm左右，在新的MBP培養基上誘導獲得較大規模的叢生芽；將再生植株在生根培養基SMO中培養成苗，移栽至溫室或大田。本發明建立的柳枝稷的體外繁殖方法，拓寬了柳枝稷組織培養和遺傳轉化的基因型范圍，縮短了培養周期，提高了再生頻率，降低了實驗成本，同時可以作為柳枝稷轉基因后代快速繁殖的有效手段，為生物技術在柳枝稷上的廣泛應用奠定了基礎。
文檔編號C12N5/04GK101081005SQ20071001826
公開日2007年12月5日 申請日期2007年7月13日 優先權日2007年7月13日
發明者奚亞軍, 劉曙東 申請人:西北農林科技大學