專利名稱：：一種基因微鏈載體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及基因載體
技術領域：
，尤其是涉及一種基因微鏈載體及其構建方法和應用。
背景技術：
：目前，基因治療的難點是載體的轉染、表達效率低和存在安全隱患，安全有效的基因治療載體是現今基因治療研究領域的重點。基因治療載體的安全性問題使得開發出安全可靠、轉染效率高的載體成為現今基因治療研究領域的重點。做為基因治療主要載體的病毒載體其局限性則是顯而易見因為病毒型載體利用其自身感染程序將外源目的基因導入宿主細胞，故為維持該感染過程則需要完整病毒的參與。這些病毒成分在宿主細胞內復制極易引發機體產生不同程度的免疫反應，而且存在插入突變等致瘤、致毒風險。非病毒載體在安全性方面可能優于病毒載體，雖然不會整合入宿主細胞染色體中，同時具有無傳染性、不限制載體容量、可大量制備等優點，但同樣能導致免疫反應，而且轉染效率不高。目前非病毒載體面臨兩大難題首先，非病毒型載體是通過內吞方式將目的基因導入細胞，進入胞質的內吞小泡很快被溶酶體融合并被其釋放的各種酶系所降解。由此產生的后果將是嚴重影響目的基因的表達及其在基因治療中的實際用價值。其次，源于非宿主載體的DNA表達產物特別是CpG序列的大量存在可能引發宿主免疫反應。美國StanfordUniversity的KayMA等開發出幾乎不含非宿主DNA成分的微環DNA質粒(MinicircleDNAvectors),但此種微環載體在轉染效率上尚顯不足。所以人工合成具有穩定性、安全性和靶向性的非病毒載體的研究曰益受到重視，比如構建新型微鏈載體，但如何有效地防止體內核酸外切酶的降解，增強微鏈載體在細胞內的穩定性、安全性是一個新的難題。同時，載體的分子量要求更小，以便有利于從胞漿中進入到細胞核內表達，有效地提高在體細胞內的轉染效率。MEKKl作為絲/蘇氨酸的蛋白激酶，位于信號傳導通路中的上游，將細胞外信號經級聯放大傳入細胞內。MEKKl介導的信號通過級聯放大直接作用于EB病毒自殺基因啟動子，誘導自殺基因的表達，使腫瘤細胞對抗癌藥物GCV敏感性增加數十倍。本申請人擬以其為耙點,通過導入具有活性的MEKK1基因激活EBV-TK基因表達調控系統，達到治療鼻咽癌等EB病毒相關腫瘤目的。
發明內容本發明的目的是針對現有技術的空白，提供一種基因微鏈載體，轉染效率高，能有效地防止體內核酸外切酶的降解，在細胞內的穩定性、安全性較高。本發明的另一個目的是提供所述的基因微鏈載體的構建方法，簡單易行，可靠性高。本發明還有一個目的是提供所述基因微鏈載體的應用，通過裝載EB病毒膜蛋白LMP1的啟動子使得MEKK1基因只在EB病毒感染的細胞中進行表達以制備選擇性殺傷鼻咽癌細胞的藥物。本發明的技術方案是提供一種基因微鏈載體，由線性DNA序列表達框和兩個對稱排列的Cap保護序列組成，所述Cap保護序列封閉線性DNA序列表達框兩端。所述Cap保護序列進行修飾以構建不同的保護結構。所述對Cap保護序列進行修飾是通過模擬真核生物細胞內tRNA相對穩定的c環結構，構建微鏈兩端穩定的Cap序列，分別在其兩端加上AseI、AflII酶切位點。所述線性DNA序列為EGFP基因序列。所述線性DNA序列為MEKK1基因序列。本發明提供了所述EGFP基因微鏈載體的構建方法，包括以下步驟(1)模擬體內tRNA穩定C環的帽狀Cap構建；(2)目的基因質粒的提取；(3)基因表達框的獲得；(4)目的基因表達框和Cap序列進行連接；(5)微鏈載體的擴增、純化和保存。提取pEGFP-N3質粒，37i:水浴條件下雙酶切pEGFP-N3質粒4h，采用1X的瓊脂糖凝膠膠回收1.6kb左右的片段；所述目的基因片段和兩端C即采用摩爾比1:10、16。C條件下進行連接，LigationHigh連接酶作用下連接3060min或T4連接酶作用下過夜連接1216h。本發明提供了所述MEKK1基因微鏈載體的構建方法，包括以下步驟(1)B95-8培養和細胞收集，EBV的提取及EBV基因組DNA的提取，EBV膜蛋白LMP1啟動子的獲得；(2)pCMV-MEKK1質粒的大量提取及MEKK1基因的獲得；(3)Xhol酶切消化LMPlPromoter及MEKKl基因并對其進行連接；(4)PCR擴增連接產物并利用Asel、AfIII對連接產物進行消化；(5)LMPlpromoter—MEKK1微鏈載體的構建和量化擴增；(6)將LMPlpromoter-MEKKl目的條帶連上T載體并進行量化擴增；(7)構建pEGFP—MEKKl質粒并進行量化擴增；(8)將等量的pCMV-MEKKl質粒、MEK1Q-T質粒、MEKKl微鏈載體轉染進入B95-8細胞；(9)Western-blotting檢測pCMV-MEKKl質粒、MEKK1-T質粒、MEKKl微鏈載體在B95-8細胞內MEKKl下游產物TK的表達。本發明提供了所述MEKKl基因微鏈載體的應用，其特征在于通過裝載EB病毒膜蛋白LMPl的啟動子使得MEKKl基因只在EB病毒感染的細胞中進行表達以制備選擇性殺傷鼻咽癌細胞的藥物。本發明的有益效果是(1)構建了一種新型微鏈載體，在目的基因的線性表達框兩端加上Cap保護序列，該Cap序列模擬真核細胞中tRNA中較穩定的c環設計，封閉線性DNA兩端的線性缺口，可有效地防止體內核酸外切酶的降解，增強微鏈載體在細胞內的穩定性；微鏈載體的線性核酸結構中含有可置換目的基因表達框，使之具有加載外源基因通用性良好、置換方便等優點。因此，此類微鏈載體有望成為一種基因治療的通用型載體。(2)本發明的微鏈載體分子量僅為一般質粒載體的1/3甚至更小，更加有利于從胞漿中進入到細胞核內表達，可有效地提高在體細胞內的轉染效率；較少含有非宿主性基因成分，不僅易于通過胞膜的核酸通道進入細胞，而且可游離于宿主染色體之外穩定自主表達，因而具有較高的生物安全性和較低的免疫原性。(3)本發明微鏈載體僅含很少量的外源序列，基本不含有被認為是引發基因治療免疫毒性反應主要原因的CpG序列，而且由于微鏈載體的獲得可通過PCR擴增，排除了質粒載體在擴增和提取過程當中攝入細菌內毒素的問題，能夠有效地增強其作為基因治療載體的安全性。(4)微鏈載體是一種全新的基因治療載體，為基因治療的載體開發提供了一條新的思路和方向，對其保護Cap的修飾，還可能使得其具有靶向特異性，選擇性殺傷病變細胞而不損傷癌細胞，具有現有基因治療載體難以達到的優越性，較好地滿足基因治療載體所需要的安全性和轉染效率，開發和生產成本相對較低，能大規模適應于研究和生產及臨床應用，具有很好的應用前景。尤其是針對鼻咽癌等EB病毒相關腫瘤都存在EB病毒感染及其生物學特征，本課題提出以解除EB病毒自殺基因沉默為耙標的治療策略。將MEKK1插入微鏈載體的目的基因表達框中，在EB病毒特異性LMP1啟動子的調控下，MEKK1可通過信號級聯放大解除EB病毒自殺基因的沉默狀態，驅動自殺基因表達并放大其拷貝數量，解決EB病毒自殺基因拷貝數不高導致的治療效果不佳的問題。同時，通過EB病毒特異性啟動子的調控達到僅對EB病毒感染陽性腫瘤細胞產生選擇性的殺傷效應，而不對正常體細胞產生影響，具有其它治療方式所難以達到的特異性和安全性。圖1pEGFP-N3質粒圖譜圖2EGFP基因瓊脂糖電泳檢測圖圖3微鏈載體示意圖圖4微鏈載體的擴增產物電泳檢測圖圖53.5%DNA-PAGE膠區分微鏈載體和GFP表達框圖6等摩爾的微鏈載體與pEGFP-N3同時轉染進入293細胞48h后10X10鏡頭下熒光顯微鏡檢測結果圖7等質量的微鏈載體和pEGFP-N3質粒轉染進入293細胞48h后10X5鏡頭下熒光顯微鏡檢測結果圖8等質量的微鏈載體和pEGFP-N3質粒轉染進入3T3細胞中48h后10X10鏡頭下熒光顯微鏡檢測結果圖9等質量的微鏈載體和pEGFP-N3質粒轉染進入CNE2細胞48h后10X10鏡頭下熒光顯微鏡檢測結果圖10等質量的微鏈載體和pEGFP-N3質粒轉染進入B95-8細胞48h后10X10鏡頭下熒光顯微鏡檢測結果圖11等質量的微鏈載體與pEGFP-N3質粒轉染的293細胞進行流式細胞儀觀察結果圖12等質量的微鏈載體與pEGFP-N3質粒轉染的3T3細胞進行流式細胞儀觀察結果圖13等質量的微鏈載體與pEGFP-N3質粒轉染的CNE2細胞進行流式細胞儀觀察結果圖14微鏈載體在不同細胞株中表達持續時間的觀察圖15微鏈載體與pEGFP-N3質粒對細胞增值的影響圖16EBV的提取檢測及LMP1promoter的PCR擴增電泳檢測圖圖17PCR量化擴增LMP1promoter瓊脂糖膠凝體電泳法檢測圖圖18HindIII單酶切和HindIII、Xhol雙酶切pCMV-MEKK1質粒電泳檢測提取結果圖圖19PCR擴增MEKK1電泳檢測圖圖20擴增后得到MEKK1和LMP1promoter基因表達框消化后連接電泳檢測圖圖21擴增MEKKl微鏈載體圖和微鏈載體示意圖圖22MEKK1—T載體經過AflII單酶切和Asel、AflII雙酶切后檢測圖圖23pEGFP-MEKK1經過AflII單酶切和Asel、AflII雙酶切后檢測圖圖24Western-blotting檢測MEKK1下游產物TK的表達具體實施例方式下面結合附圖進一步詳細說明本發明。實施例1含GFP報告基因的微鏈載體的構建及轉染效率的測定一材料與方法(一)材料1主要材料pEGFP-N3質粒，大腸桿菌菌株DH5a，細胞株3T3、CNE2和B95-8由本實驗室保種，293細胞由中山大學人體解剖教研室鄒俊濤博士惠贈，C即序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。2、工具酶與主要試劑限制性內切酶AseI、AflII購自晶美公司，核酸外切酶ExoIII、T4連接酶購自TaKaRa公司；Ligationhigh連接酶購自日本TOYOBOBO公司，瓊脂糖粉來自ShanghaiYitoEnterpriseCompany;小牛血清購自北京鼎國生物技術有限公司；細胞轉染試劑購自銳博生物科技有限公司；其余試劑為國產分析純以上。3分子量標準和試劑盒核酸分子量標準(lkbladdermarker,DL2000laddermarker)購自Takara公司；質粒提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，PCR清潔試劑盒購自Omega公司。4主要儀器熒光顯微鏡Olypums公司；流式細胞儀中山大學附屬第一醫院檢驗科6樓流式細胞室；核酸電泳儀北京市六一儀器廠的DYY-2C型和DYY-2C型電泳儀；紫外分光光度儀Beckmancoulter的DU530;PCR儀GeneAmpPCRSystem9700禾口Bio—Rad;純水系統MilliporeAFS-25EDI;;旋渦混合器江蘇海門市麒麟醫用儀器廠；離心機雄發公司的TGL-16Centrifuge,Beckmancoulter的A貓tiJ-E禾口印pendorf的centrifuge5417R;電子天平賽多利斯公司的BT224S;pH計賽多利斯公司的PB-10;超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份公司的JY88-II;水浴鍋上海森信實驗儀器公司的DK-8D型電熱恒溫水槽(二)主要溶液的配制1、LB(Uiria-Bertani)培養基每升培養基中加入胰蛋白胨(trypton)10g;酵母提取物(yeastextract)5g;NaCl10g;用三蒸水定容至1L，高壓滅菌后使用。2、Tris-乙酸(TAE)工作液(1X)Tris-乙酸40mM;EDTAImM;儲存液(50X)Tris-堿242g;冰乙酸57.1mL;EDTA(0.5M，pH8.0)100mL用三蒸水定容至1L。3、Tris-硼酸(TBE)工作液(lX)Tris-硼酸40mM;EDTAlmM;儲存液(5X)Tris-堿54g;硼酸27.5g;EDTA(O.5MPH8.0)20ml;用三蒸水定容至1L。4、PBS工作液(IX)NaC1137mM;KC12.7mM;Na2HP048.ImM;KH2P041.5mM;儲存液(10X);NaC140g;KC1lg;Na2HP047.2g;KH2P041.2g;用三蒸水定容至1L。5、飽和硫酸銨溶液室溫下稱取100g的水，加入76.7g的硫酸銨固體。6RPMI1640培養基取培養基粉末，加入2.38gHEPES和2gNaHC03，用超純水溶解定容至1L，加入7ul-巰基乙醇，4"C靜置約4h，用0.22um孔徑的濾膜過濾，置37X:，5%C02細胞培養箱48h檢菌07DMEM培養基取培養基粉末，加入2.38gHEPES和2gNaHC03，用超純水溶解定容至1L，加入7ul-巰基乙醇，4。C靜置約4h，用0.22um孔徑的濾膜過濾，置37。C，5%C02細胞培養箱48h檢菌。83.5%DNA-PAGE膠30%丙烯酰胺1.17ml;10XTBElml;10y。APS(過硫酸胺)450ul;TEMED10ul;加三蒸水至10ml。9堿裂解液I(制備質粒)葡萄糖50mM;Tris-C1(PH8.0)25mM;EDTA(PH8.0)lOraM;溶液I可一次配置100ml，15psi壓力下滅菌20min后，保存在4。C。10堿裂解液II(制備質粒)NaOHO.2M;SDS(m/v)1%，溶液II現配現用，在室溫條件下使用。11堿裂解液III乙酸鉀(5M)60ml;冰乙酸11.5ml;水加至100m，保存于4。C，用時至于冰浴。(三)實驗方法1微鏈載體C即序列的構建模擬真核生物細胞內tRNA相對穩定的c環結構，構建微鏈兩端穩定的Cap序列，分別在其兩端加上Asel、AflII酶切位點，其序列結構見表l:表1Cap的核苷酸序列及其保護結構形狀<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2pEGFP-N3質粒的提取制備感受態細胞，取lulpEGFP-N3質粒轉入100ulDH5a感受態，涂布于含Kan的固體LB培養板，待37。C，5%C02培養箱中過夜培養后，挑取單克隆菌于5mlLB培養液，加入kan至濃度為lOOug/ml后200rpm搖至OD值約為0.6后，轉入500ml含kan的LB中，200rpm搖12—16h，用《分子克隆》p32-36上的方法大提質粒，并對質粒進行純化和電泳檢測，電泳條帶位于4.7kb左右，用紫外分光光度儀檢測質粒提取量。3EGFP基因表達框的獲得利用Asel，AflII在buffer0緩沖液中雙酶切pEGFP-N3質粒，酶切條件為37t:水浴下4h，在1%的瓊脂糖凝膠電泳中加入lkb的DNAladdermarker,膠回收1.6kb左右的片段，即為含啟動子、EGFP基因、polyA尾的目的基因表達框。4微鏈載體的構建加入EGFP表達框及10倍摩爾量的兩端Cap保護序列，在LigationHigh連接酶的作用下，16。C30min反應，或T4連接酶16。C作用下過夜連接12-16h，連接酶將在酶切位點處對目的基因表達框和Cap序列進行連接。5微鏈載體的檢測與量化擴增利用3.5X聚丙烯酰胺(PAGE)膠經溴化乙啶(EB)染色后紫外燈下可觀測到連接上的微鏈載體和未連接上的單獨基因片段的差別約在50bp左右，設計引物通過PCR反應可量化擴增微鏈載體。弓l物序列為5，ACMGTTCAGCGTGTCCG3，6293、3T3、CNE2、B95-8細胞的培養293、3T3、CNE2細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，B95-8細胞在含10。％小牛血清的1640培養基中生長至培養瓶底面積80%左右時，用PBS進行清洗兩次，0.25%胰酶進行消化，加入適量培養基終止消化，1000rpm，5min離心收集細胞，用適量培養基進行重懸后分至3-4瓶內進行繼續培養，每隔1-2天進行換液一次。7pEGFP-N3與微鏈載體轉染進入293、3T3、CNE2、B95-8細胞在轉染前24h，將90mm培養皿中細胞傳代為4皿35mm小培養皿，待培養皿中細胞數量增值至5X105個時，分別將等摩爾量與等質量的pEGFP-N3質粒和微鏈載體用脂質體轉染試劑按試劑說明書轉染進入293、3T3、CNE2、B95-8細胞，同時設置空白對照組，每隔24小時進行換液培養。8GFP表達的熒光顯微鏡觀察轉染48h后，利用熒光顯微鏡初步觀察GFP的表達情況，選擇相同視野下的細胞進行比較。此后每隔24h觀察，記錄表達變化情況和持續表達表達時間。9GFP表達的的流式細胞儀觀察待皿內細胞數量為5-10乂105個左右時，將細胞用0.25%胰酶消化后，用lmlPBS重懸，流式細胞儀觀察GFP的表達情況。10轉染后細胞對細胞毒性作用觀察和對細胞增值的影響分別取等質量的pEGFP-N3質粒與微鏈載體轉染293細胞，在35iran培養皿用無血清DMEM培養基中培養，設空白對照，48h后用細胞計數法統計皿內細胞數量，記錄細胞死亡情況。二結果與討論(一)實驗結果1Cap序列的篩選及構建在目的基因表達框兩端加Cap保護序列封閉DNA外端缺口，可有效防止真核細胞內的核酸外切酶將線性表達框進行非特異性的降解，阻斷核酸外切酶的作用，使目的基因順利進入核內表達。我們模擬真核細胞內tRNA的穩定c環結構，使得保護Cap具有良好的抗外切酶作用。C即的核苷酸序列見表l，首尾兩端Cap分別具有AseI，AflII酶切位點.2pEGFP-N3質粒的提取及EGFP基因的獲得用《分子克隆》的p32-36上的方法大提質粒，純化后經紫外分光光度計檢測得到pEGFP-N3質粒約2mg，質粒圖譜如圖1。pEGFP-N3質粒經AseI，AflII雙酶切后得到的含pCMV-EGFP-polyA的基因表達框片段，長度大約在1.63kb，凝膠回收可得到該片段，如圖2所示。3微鏈載體的構建T4DNA連接酶在16X:水浴12-16h過夜連接后將Cap序列同目的基因表達框進行連接，連接之后利用核苷酸外切酶ExoIII對有線性缺口的DNA片段具有外且活性的特點將未連接產物在37r條件下作用2h，使得未連接產物在Exom的作用下降解為單個核苷酸，用PCR產物清潔試劑盒對ExoIII外切的體系進行純化，得到微鏈載體的純化物。構建好的微鏈載體示意圖如圖3。4微鏈載體的PCR擴增設計PCR引物5，ACAAGTTCAGCGTGTCCG3'，加入適量的ExTaq聚合酶，dNTP及反應緩沖液，50ul體系IO管進行PCR擴增，得到微鏈載體的擴增產物，PCR產物電泳檢測如圖4，其中1為EGFP，2為PCR擴增的微鏈載體。利用3.5%PAGE膠進行電泳檢測，檢測結果如圖5，1為微鏈載體，2為EGFP基因表達框，PCRClean回收微鏈載體。5pEGFP-N3質粒與微鏈載體轉染進入293細胞，48h后熒光顯微鏡檢測結果(1)將等摩爾的微鏈載體與pEGFP-N3質粒同時轉染進入細胞，其表達的GFP在熒光的激發能顯出綠色熒光，根據熒光的表達情況可以初步推測其轉染效率。48h后10X10鏡頭下表達效率見圖6，其中左圖為pEGFP-N3質粒，中間圖片為微鏈載體，右圖為空白對照。(2)將等質量的微鏈載體和pEGFP-N3質粒轉染進入293細胞中，48h后10X5鏡頭下觀察其轉染表達效率見圖7，其中左圖為pEGFP-N3質粒，中間圖片為微鏈載體，右圖為空白對照。我們可以得到結論等質量的微鏈載體轉染表達效率比pEGFP-N3質粒高，因為微鏈載體微鏈載體分子量僅為一般質粒載體的1/3甚至更小，更加有利于從胞槳中進入到細胞核內表達，可有效地提高在體細胞內的轉染效率。6pEGFP-N3質粒與微鏈載體轉染進入3T3細胞，48h后熒光顯微鏡檢測結果將等質量的微鏈載體和pEGFP-N3質粒轉染進入293細胞中，48h后10X10鏡頭下觀察其轉染表達效率見圖8，其中左圖為pEGFP-N3質粒，中間圖片為微鏈載體，右圖為空白對照。7pEGFP-N3質粒與微鏈載體轉染進入CNE2細胞，48h后熒光顯微鏡檢測結果將等質量的微鏈載體和pEGFP-N3質粒轉染進入CNE2細胞中，48h后10X5鏡頭下觀察其轉染表達效率見圖9，其中左圖為pEGFP-N3質粒，中間圖片為微鏈載體，右圖為空白對照。8pEGFP-N3質粒與微鏈載體轉染進入B95-8細胞，48h后熒光顯微鏡檢測結果將等質量的微鏈載體和pEGFP-N3質粒轉染進入B95-8細胞中，48h后10X10鏡頭下觀察其轉染表達效率見圖10，其中左圖為pEGFP-N3質粒，中間圖片為微鏈載體，右圖為空白對照。9流式細胞儀測定GFP基因經兩種載體轉染后在293、3T3、CNE2細胞中的表達效率(1)為能更準確地測定其轉染表達效率，我們對等質量的微鏈載體與pEGFP-N3質粒轉染的293細胞進行流式細胞儀觀察，檢測GFP表達細胞數占總細胞的百分數，得到其轉染效率。每批次細胞依次經過24h、48h、72h進行觀察，取三個批次細胞在相同時刻轉染百分率的平均數對時間作圖，見圖11，每一組緊靠的兩柱形中左邊柱形為pEGFP-N3，右邊柱形為微鏈載體。每批次細胞數據見表2。表2:pEGFP-N3與微鏈載體對293細胞的轉染率(%)pEGFP-N3微鏈載體<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由圖11我們可以得到在293細胞內，轉染后相同時間微鏈載體比pEGFP-N3質粒表達GFP的效率高。(2)我們在3T3、CNE2細胞中進行了同樣的實驗，得到了較類似的實驗結果。轉染后細胞的分別經過24h，48h，72h后檢測，其轉染效率相對時間作圖分別得圖12和圖13，圖12中每一組緊靠的兩柱形中右邊柱形為pEGFP-N3，左邊柱形為微鏈載體。圖13中每一組緊靠的兩柱形中左邊柱形為pEGFP-N3，右邊柱形為微鏈載體。實驗結果顯示在3T3、CNE2細胞內，微鏈載體表達GFP的效率與pEGFP-N3質粒基本持平，表達效率有一定的優勢但是并不非常明顯。不同細胞株GFP表達效率相差較大。10微鏈載體在293，3T3，CNE2，B95-8細胞株中表達持續時間的觀察為觀察微鏈載體在不同細胞株內表達GFP的持續時間，并和pEGFP-N3質粒進行對照，轉染后每隔24小時進行熒光顯微鏡觀察GFP的表達，記錄熒光完全猝滅的時間。結果如圖14，其中每一組緊靠的兩拄形中左邊柱形為pEGFP-N3，右邊柱形為微鏈載體；第一組在293細胞株中表達，第二組在3T3細胞株中表達，第三組在CNE2細胞株中表達，第四組在B95-8細胞株中表達。從圖上我們可以看出在不同的細胞株內，GFP表達的持續時間相差較大。總體來說，GFP在由微鏈載體轉染進入細胞后GFP的表達持續時間基本與質粒轉染后相同，顯示了微鏈載體在裝載基因轉染后在不同細胞株內均能穩定持續表達。11微鏈載體和pEGFP-N3質粒轉染后對細胞的毒性實驗用細胞計數法檢測微鏈載體和pEGFP-N3質粒轉染進入293細胞后的毒性損傷作用。設置微鏈載體、pEGFP-N3質粒、空脂質體轉染三組。轉染后換用無血清培養基抑制細胞增值，35mm培養皿內每皿接種1乂105個細胞，48h后細胞計數觀察其細胞死亡百分數，取三批細胞的平均數作圖15，其中1為pEGFP-N3;2為微鏈載體；3為6.5%cationiclipids。圖15結果發現雖然效果不是很明顯，但仍可以發現微鏈載體對細胞的損傷稍比pEGFP-N3質粒稍小。用細胞計數的方法觀察pEGFP-N3質粒與微鏈載體對細胞的增值無明顯影響。實驗結果初步說明了微鏈載體的轉染效率相對于原pEGFP-N3質粒有所提高。這種提高可以用微鏈載體有利于基因進入到細胞核進行解釋。核被膜被認為是非病毒類載體進入到細胞核最主要的屏障，能較大地影響非病毒類載體地轉染和表達效率。DNA進入到細胞核與載體大小有關，載體分子量越大，能進入到細胞核內的機會就越少。由于微鏈載體分子量只是普通質粒載體的1/3甚至更少，而且其呈線狀結構，更加有利于進入到細胞核內表達。因此能有效提高轉染效率。微鏈載體另外一個較為顯著的優點在于它只含有很少量的未甲基化的CpG序列，除去了普通質粒載體的大量的無治療作用基因中包含的CpG序列。CpG序列被認為是導致免疫反應的重要原因。研究顯示，患有纖維囊泡癥的患者被導入陽離子脂質體和pDNA后將導致發熱、肌肉疼痛、肺功能下降和精神緊張的概率遠大于僅被導入陽離子脂質體的患者。克隆僅含原質粒約一半CpG序列的質粒載體能有效減少炎癥發生概率，但由于其費用較高，臨床應用價值較低。而微鏈載體所含有的CpG序列非常少，可減少免疫反應發生的概率，因而具有較大的臨床意義。通過對Cap序列的修飾，可以使得其具有靶向效應，從而進一步提高其作為基因治療載體的應用價值。選用腫瘤細胞特異性標志高親和多肽序列作為Cap保護序列的骨架，能使該微鏈載體具有較高的穩定性和高特異靶向性。本實驗初步證實了微鏈載體做為基因治療載體有比傳統質粒更高的表達效率。其較小的分子量和線性結構使該載體易于通過細胞膜系統中的核酸通道進入細胞，而不必采用內吞方式，提高了轉染效率。其較少含有非宿主性基因成分，并可游離于宿主染色體之外穩定自主表達。因而又具有較高的生物安全性和較低的免疫原性。微鏈載體具有傳統載體所難以達到的安全性，同時又能使轉染效率有一定的提高，并且有望開發出具有靶向特異性的載體。隨著技術的成熟和研究的深入，其有可能成為基因治療的一種通用載體，促進基因治療的發展。實施例2MEKK1基因微鏈載體的構建及表達檢測一材料與方法(一)材料1主要材料pCMV-MEKK1質粒、B:95-8細胞由本實驗室保種，pMD18-TVector購自TaKaRa公司，預染蛋白標準蛋白購自基因公司，來自紐英倫生物技術有限公司(newEnglandbiolabs);—抗鼻咽癌患者血清由中山大學附屬腫瘤醫院檢驗科劉萬里老師惠贈；二抗購自博士德生物有限公司，一抗兔抗P-actin購自北京博奧森生物技術有限公司；二抗為羊抗兔-HRP，購自博士德生物有限公司；PMSF，牛血清白蛋白組分五(BSA)購自北京鼎國生物技術有限公司；蛋白定量試劑為Bio-Rad公司的Bio-RadProteinAssay試齊[J盒；RPMI1640、DMEM培養基粉末購自Gibco公司；P-巰基乙醇購自Sigma公司；新生牛血清(NPS)購自PPA公司；其余試劑為國產分析純。2分子量標準lkbmarker,DL2000marker,200bpDNAladdermarker均購自TaKaRa公司3實驗所用到的酶ExTap酶、T4DNA連接酶購自TakaRa公司，Xhol、Asel、AflII購自Fermentas公司，PCRMasterMix購自TianGen,4所用試劑盒膠回收試劑盒購自BioFlux公司，質粒提取試劑盒、PCRClean試劑盒購自Omega公司5主要儀器純水系統Millipore的AFS-25EDI;電子天平賽多利斯公司的BT224S;離心t幾Eppendorf的centrifuge5417R;pH計賽多利斯公司的PB-10;超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份公司的JY88-II;蛋白電泳儀Bio-Rad的PowerPacbasic;分光光度儀Beckmancoulter的DU530。(二)主要溶液的配置1、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)Tris-HCl(lM，pH6.8)2.5ml;|3-巰基乙醇1.0ml;SDS0.6g;甘油2ml;溴酚藍10mg，用三蒸水定容至10ml。(2X)Tris-HCl(lM，pH6.8)2ml;P-巰基乙醇2.0ml;SDS(10%)8ml;甘油5ml;溴酚藍(1%)3ml。2、電泳緩沖液(runningbuffer)(Tris-甘氨酸)工作液(1X)Tris—base25mM;甘氨酸(glycine)250mM;SDS0.1%;儲存液(10X);Tris-base30.3g;甘氨酸(glycine)144.4g;SDS10g;用三蒸水定容至1L。3、電轉緩沖液(transferbuffer):工作液(IX)Tris-base25mM;甘氨酸(glycine)250mM;甲醇20%儲存液(10X)Tris-base30.3g;甘氨酸(glycine)144.4g;用三蒸水定容至1L，甲醇臨用時加入。4、TBS-T工作液(1X)Tris-base2.42g;NaC18g;Tween-200.1%儲存液(10X)Tris-base24.2g;NaCl80g;用鹽酸調PH至7.6，用三蒸水定容至1L，Tween-20臨用時加。5、StrippingbufferTris-HC1(IM，pH6.8)31.2ml;SDSlOg;!3-巰基乙醇3.497ml;用三蒸水定容至500ml，P-巰基乙醇臨用時加。6、考馬斯亮藍染色液考馬斯亮藍R-2500.1%;甲醇(或乙醇)40%;冰醋酸10%7、三去污裂解液Tris-CI(pH二8.0)50mM;NaC1150mM;NaN30,02%;SDS0.1%;NP-401%;脫氧膽酸鈉0.5%;EDTAlmM。8TBE5XTris-base54g;硼酸27.5g;0.5MEDTA(PH8.0)20ml;加水至1L。8STETris-CIlOmM;NaCl0.1M;EDTAlmM，高壓蒸汽滅菌15min，貯存于4"C。(三)實驗方法1B95-8的培養和細胞收集取保存在液氮罐的B95-8—管，在37"C水浴中融化后離心使細胞沉淀，用適量1640培養基重懸，至于90mm培養皿中培養，每隔24一48h換液一次，待細胞長至80%左右時傳代。收集傳代時的細胞上清，至于一8CTC保存。收集10皿約200ml的細胞懸液。2EBV的提取及EBV基因組DNA的提取在37。C水浴條件下解凍收集的細胞懸液，4°C，4000rpm離心30min，轉移上清至另外的離心管，4°C，41，000rpm離心30min，取沉淀用適量的TE重懸過夜，加入蛋白酶K至50ug/ul，保持EDTA濃度至20mM，加入10XSDS至終濃度為0.5%，將混合物在56。C條件下溫育lh，然后冷卻至室溫，加入等體積的飽和酚，充分混合后10000g，2min將兩相分開，吸取水相至另一離心管，加入等體積氯仿抽提，標準乙醇沉淀法純化DNA，最大轉速2min后棄去上清，揮干乙醇后加入50ul無菌水溶解，得到EBV基因組DNA。可用檢測引物通過PCR方法檢測EBV是否提取獲得。3EBV膜蛋白LMP1啟動子的獲得Pril序列為5，GACAT/TAATCTCAGGGCAGTGTGTCAG3，包括Asel酶切位點AT/TMT;Pri2序列為5，CCGC/TCGAGTTGTGCAGATTACACTGC3，(包括Xhol酶切位點C/TCGAG。加入ExTap酶在適當濃度dNTP條件下擴增得到LMP1promoter的長度為361bp。4pCMV-MEKKl質粒的大量提取及MEKK1基因的獲得取lulpCMV-MEKK1轉接進入100ulDH5a感受態，冰上靜置30min后42。C熱休克90s后在冰上放置1-2min，加入900ulLB培養基后37°C，100rpm溫和振蕩lh，4000rpm5min離心后收集菌，取100ul上清重懸菌液后涂布于Amp板上，12—16h過夜后挑取單克隆于5mlLB培養基，300rpm振搖過夜后轉接入200mlLB培養基中，振蕩2—3h后轉接入1000mlLB培養基中，振搖2—3h。用《分子克隆》p32-36上的方法提取純化質粒，并對質粒進行純化和電泳檢測，HindIII單酶切檢測質粒的提取，電泳條帶位于5.0kb左右，用紫外分光光度儀檢測質粒提取量。設計引物Pril:(包括XhoI酶切位點C/TCGAG)序列為5，CCGC/TCGAGCCACCATGGCGATGTCAGCGTCTC3，引物Pri2:(包括AflII酶切位點CT/TMG)5'CAGCT/TMGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGC3'，擴增MEKK1基因，大小為1197bp。PCR體系為Pri10.5ul;Pri20.5ul;dNTP4ul;ExTapbuffer5ul;ExTaq0.5ul;模板2ul;水加至50ul。分10管擴增MEKK1目的基因，經過電泳鑒定擴增得到MEKK1后用PCRClean試劑盒進行回收，紫外分光光度計檢測得到的MEKK1基因的濃度。5Xhol酶切消化LMP1Promoter及MEKK1基因并對其進行連接LMP1promoter和MEKKlXhoI單酶切消化體系DNA5ug;Buffer2ul;Xhollul，水加至20ul。37。C酶切過夜后PCRClean回收試劑盒進行回收，得到經過Xhol酶切后的LMPlpromoter及MEKK1目的基因。利用T4連接酶對經過XhoI消化后的LMPlpromoter及MEKK1目的基因進行連接，摩爾比控制在1:1，T4連接酶在16°C10ul體系下對LMPlpromoter及MEKKi目的基因進行連接，之后取lul連接體系進行電泳鑒定，電泳鑒定連上之后對連接體系進行PCRClean純化。得到連接上的LMPlpromoter一MEKK1產物。6PCR擴增連接產物并利用Asel、AflII對連接產物進行消化由于連接難度較高且T4連接酶的連接效率較低，故對連接產物進行PCR擴增以得到足夠量的連接產物。前端引物為LMPlpromoterpril，后端引物為MEKKIPriII，擴增體系為前端引物0.3ul;后端引物O.3ul;dNTP4ul;buffer5ul;ExTaq酶O.5ul;模板lul，水加至50ul。PCR擴增的條件為解鏈條件94。C30s，退火條件54。C30s，延伸條件72'C90s，35個循環。總共10管進行擴增。經過電泳檢測后得到連接產物，PCRClean回收連接產物，利用紫外分光光度計測定連接產物濃度。Asel、AflII對連接產物進行雙酶切過夜，反應體系為連接產物10ug;Asel、AflII各2ul;BufferO2ul，加水至20ul。雙酶切消化過夜后進行PCRClean回收，得到經過雙酶切消化后兩端有AseIAflII酶切位點的LMPlpromoter—MEKK1連接片段。7LMP1promoter—MEKKl微鏈載體的構建和量化擴增利用平末端連接條件將兩端設計好的Cap，Cap與表達框的摩爾比為10:1，T4連接酶在16'C條件下連接過夜。連接后利用連接體系作為模板，設計引物量化擴增含MEKK1基因的微鏈載體Pril序列為5，GAGTAAATACGGAGCTTTCAAGGAG3，Prill序列為5，CTCCTTGAAAGCTCCGTATTTACTC3，，擴增后產物經過電泳檢測得到目的片段大小的條帶，膠回收目的條帶，并檢測擴增得到的微鏈載體的濃度，于一2(TC條件下進行保存。PCR擴增的條件為解鏈條件94。C30s，退火條件54°C30s，延伸條件72°C90s。膠回收具體步驟可見Omega膠回收試劑盒說明書。8將LMPlpromoter-MEKKl目的條帶連上T載體并進行量化擴增具體操作步驟為(D在微量離心管中加入pMD18-TVectorlul，InsertDNA0.6pmo1，ddH20至5ul;(2)加入等量的SolutionI，16。C連接30min(3)全量(10ul)加入至100ulDH5a感受態菌液中，冰上放置30min;(4)42。C熱休克60s，再在冰上放置lmin.'(5)加入890ulLB培養基，37。C振蕩培養60min(6)在含有X-Gal，IPTG，Amp的LB瓊脂糖平板上培養，形成單菌落。計數白、藍菌落；(7)挑取白色菌落在5ml含Amp的LB培養基中進行振蕩培養過夜(8)將菌液按1:200轉接入1000mlLB培養基中進行大規模培養(9)用《分子克隆》p32-36上的方法大量提取質粒，并對質粒進行純化和電泳檢測，AflII單酶切檢測質粒的提取，電泳條帶位于4.3kb左右，用紫外分光光度儀檢測質粒提取量。9構建pEGFP—MEKKl質粒并進行量化擴增(1)取lOugpEGFP-N3質粒，用AseI、AflII雙酶切過夜，將用檢測顯示酶切后條帶位于3.0kb，1.7kb處，膠回收3.0kb處片段，電泳檢測并測定其濃度(2)將經過Asel、AflII雙酶切消化后的LMPlpromoter-MEKK1表達框按摩爾比5:1的比例與pEGFP-N3質粒雙酶切后膠回收3.Okb處片段用T4DNA連接酶進行10ul體系過夜連接12—16h(3)全量(lOul)加入至100ulDH5a感受態菌液中，冰上放置30min;(4)42。C熱休克60s，再在冰上放置lmin(5)加入890ulLB培養基，37。C振蕩培養60min(6)在含有Amp的LB瓊脂糖平板上培養，形成單菌落。(7)挑取單克隆在5ml含Amp的LB培養基中進行振蕩培養過夜(8)將菌液按1:200轉接入1000mlLB培養基中進行大規模培養(9)用《分子克隆》p32-36上的方法大量提取質粒，并對質粒進行純化和電泳檢測，AflII單酶切檢測質粒的提取，電泳條帶位于4.5kb左右，用紫外分光光度儀檢測質粒提取量。10將等量的pCMV-MEKK1質粒、MEKK1-T質粒、MEKK1微鏈載體轉染進入B95-8細胞將2ugpCMV-MEKKl質粒、MEKK1-T質粒、MEKK1微鏈載體用銳博公司的脂質體轉染試劑按照轉染試劑說明書轉染進入B95-8細胞，并設置空白對照。轉染步驟為(1)將轉染質粒用無血清無抗生素的1640培養基稀釋至lOOnl;(2)將4ul脂質體轉染試劑用無血清無抗生素的1640培養基稀釋至100lll;(3)將(2)中的試劑滴入(1)中，蝸旋振蕩15s后靜置30min;(4)將(3)中試劑滴入換過新鮮培養基的B95-8細胞中，培養36h。11Western-blotting檢測pCMV-MEKKl質粒、MEKK1-T質粒、MEKK1微鏈載體在B95-8細胞內MEKK1下游產物TK的表達(1)B95-8細胞內總蛋白的收集將35mm培養皿貼壁超過90%以上，狀態良好的細胞置于冰上，棄去細胞培養基，用冰預冷的PBS洗兩次，將殘留的PBS盡量吸干，再加入30-40uL三去污細胞裂解液(含lmMPMSF)，冰上放置30min，用細胞刮將細胞刮下，收集到1.5mlEP管中，4°C最高轉速離心25min，收集上清，存放于_30°C。(2)蛋白定量將濃度為10mg/ml的BSA儲存液用PBS稀釋成0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml，1.Omg/ml的濃度，加入蛋白定量試劑，在595nm處測定吸收值，做標準曲線。取樣品l-2ul，加入蛋白定量試劑，在595nm處測定吸收值，由分光光度儀自動讀出濃度。(3)蛋白電泳加入5Xloadingbuffer后在100°C水浴中煮5-10min,將細胞上清以每孔10—20ug蛋白上樣量，電壓80—100V進行10%SDS-PAGE電泳。(4)轉膜電泳完畢后將SDS-PAGE膠條帶區切割后用電轉緩沖液進行漂洗10min,將PVDF膜甲醇浸泡2min后在電轉緩沖液中漂洗10min，保持90V電壓將蛋白轉到PVDF膜上，時間約90min。(5)封閉電轉后的PVDF膜用封閉液(5。/。脫脂奶粉的TBS-T)于室溫封閉2h。(6)—抗孵育將封閉后PVDF膜用PBST洗滌3次，每次10min后，將TK抗體以l:2000比例與封閉液混合，加入膜，4°C搖床振蕩孵育過夜。(7)二抗孵育PBS-T洗10minX3次后，二抗以1:5000比例加入，室溫搖床振蕩1小時。(8)曝光PBS-T洗三次后，加入約100ul發光液將PVDF膜用X光片曝光。(9)Strip用PBST洗掉PVDF膜上的發光液后，加入strippingbuffer,50°C加熱45min,期間可以每隔10min輕輕搖動。(10)封閉棄去strippingbuffer,用PBS-T每次lOmin洗三次去掉殘余的strippingbuffer后，用封閉液(5%脫脂奶粉的TBS-T)于室溫封閉2h。(11)一抗孵育-actin抗體以l:2000比例與封閉液混合，加入膜，4°C孵育過夜。(12)二抗孵育PBS-T洗三次后，二抗(羊抗兔-HRP)以l:5000比例加入，室溫搖床振蕩1小吋。(13)曝光PBS-T洗三次后，加入發光液用X光片曝光。二結果與討論(一)實驗結果1EBV的提取與LMPlpromoter的PCR擴增培養足夠量的B95-8細胞后提取其中的EB病毒，利用檢測引物檢測EBV的提取。檢測結果見圖16、圖17，圖16中，1為LMP1promoter,2為EBV。顯示條帶出現在預測位置，顯示EBV基因組的提取獲得。收集10管50ul體系擴增的Promoter,PCRClean后紫外分光光度計檢測顯示得到LMP1promoter0.145ug/ul200ul。2pCMV-MEKKl質粒的大量提取及MEKKl基因的獲得按《分子克隆》p32-36上的方法提取純化質粒，得到pCMV—MEKKl質粒1.925ug/ul，1500ul總共約3000ug，質粒用Hindlll單酶切和HindIII、Xhol雙酶切后電泳檢測圖見圖18，1、2為HindlII單酶切，3為Hindl11、Xhol雙酶切。PCR可以量化擴增MEKKl目的基因片段，擴增出來的MEKKl基因片段兩端含有Xhol和AfIII酶切位點，PCR擴增MEKKl電泳檢測圖見圖19，得到MEKKl目的基因片段O.18ug/ul250ul，45ug.3Xhol消化MEKKl基因片段和LMP1promoter并對其進行連接利用Xhol對MEKK1基因片段和LMP1promoter進行消化，對消化體系用PCRClean試劑盒清潔后對其用T4連接酶過夜連接，連接體系瓊脂糖膠回收后得到的純化物為模板分別加LMP1promoer的PriI和MEKK1的prill進行PCR擴增，擴增后得到MEKK1基因表達框3.3ug/ull00ul，約300ug。消化后連接電泳檢測見圖20，其中1為LMP1promoter2為MEKKl。4Asel、AflII雙酶切MEKKl基因表達框后與Cap進行連接構建微鏈載體用AseI、AflII對MEKKl基因表達框進行雙酶切過夜，對酶切體系純化后及按Cap與表達框10:1的摩爾比數在16。C用T4連接酶連接過夜。將連接體系直接作為模板用PCR的方法進行擴增，PCR產物經過膠回收后即為MEKKl微鏈載體，圖21為50ul體系擴增MEKKl微鏈載體圖(下圖)和微鏈載體示意圖(上圖)，膠回收得到MEKKl微鏈載體O.12ul/ull約12ug。5MEKKl—T載體的構建由于MEKKl與LMP1promoter連接產物經過ExTap酶進行PCR擴增后會在擴增的兩端加上堿基A，所以可以直接用于T載體構建。構建好的T載體含有LMP1promoter和MEKKl基因表達框，轉入1L含Amp的培養基中大量提取得到1.0ug/ull500ul，約1500ug質粒，質粒經過Aflll單酶切和Asel、Aflll雙酶切后鑒定正常，構建好的MEKKl-T載體大小為4279bp。檢測結果見圖22，其中1為Asel、Af111雙酶切；2為Asel單酶切；3為AflII單酶切。6pEGFP-MEKKl質粒的構建及提取鑒定由于T載體上存在多個Asel的酶切位點，不利于LMP1promoter—MEKKl表達框的酶切分離，所以重新構建到pEGFP-N3質粒上。利用Asel、AflII雙酶切pEGFP—N3質粒，切下pCMV-EGFP基因片段，回收3kb左右片段，將用Asel、Aflll消化的LMP1promoter—MEKKl表達框與其進行連接，連接產物轉感受態挑取單克隆后在5ml含卡那霉素的LB培養基中培養過夜后，轉入1L含Kan的培養基中大量提取得到0.8ug/ull200ul，約lOOOug質粒，質粒經過Aflll單酶切和AseI、Aflll雙酶切后鑒定正常，酶切后電泳如圖23,質粒大小約為4.6kb，其中1為Asel單酶切；2為AflII單酶切；3、4為Asel、Aflll雙酶切。7轉染pCMV-MEKKl質粒、MEKKl-T質粒、MEKKl微鏈載體進入B95-8細胞及蛋白的提取將35腿皿內的細胞長至5X105個左右時，將2ugpCMV-MEKKl質粒、MEKK1-T質粒、MEKK1微鏈載體用4ul陽離子脂質體轉染進入換過新鮮培養基的細胞中，同時以4ul脂質體轉染進入細胞作為空白對照。37°C，5XC02細胞培養箱中培養36h。將細胞用PBS洗兩遍后至于冰上，加上200ul三去污細胞裂解液，提取細胞內的蛋白。紫外分光光度計測得蛋白濃度分別為<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>8Western-blotting檢測pCMV-MEKKl質粒、MEKK1-T質粒、MEKK1微鏈載體在B95-8細胞內MEKK1下游產物TK的表達。加入10ug的蛋白量后在IO(TC水浴中煮8min后上樣SDS-PAGE電泳，轉膜后孵--抗二抗，X光片曝光后如圖24，其中l為空白對照;2為MEKK1微鏈載體；3為MEKK1-T質粒；4為pCMV-MEKKl質粒。Westernblotting檢測結果顯示在B95-8細胞中，空白對照組表達的TK條帶較弱，MEKK1微鏈載體能夠穩定表達MEKK1基因，從而通過信號級聯反應激活TK的表達，表達效率與普通質粒(pCMV-MEKK1質粒、MEKK1-T載體質粒)基本相近，證實了其MEKK1微鏈載體作為一種抗EBV病毒相關腫瘤的基因治療載體的具有一定的實際意義。(二)實驗結論用于基因治療的通用型微鏈載體，該載體由目的基因表達框的線性核酸結構和兩個對稱排列的Cap保護序列組成。我們將MEKK1插入該微鏈載體的目的基因表達框中，并置于EB病毒特異性啟動子LMP1promoter的調控下。MEKK1可通過信號級聯放大解除EB病毒自殺基因的沉默狀態，驅動自殺基因表達并放大其拷貝數量，在后者的表達產物胸苷激酶與藥物GCV的協同作用下，對EB病毒感染陽性腫瘤細胞產生特異性性殺傷效應，具有特異性，能起到增強安全性的作用。本論文的第一部分已經證實了微鏈載體作為一種通用的基因治療載體具有較高的轉染表達效率，因此MEKK1微鏈載體能較好地進入到B95-8細胞中進行表達。Westernblotting的檢測結果顯示正常條件下B95-8細胞內的TK表達量較低，當MEKK1基因轉染進入細胞后，能通過信號級聯反應激活癌細胞內EB病毒的TK基因來殺傷腫瘤細胞，在載體的轉染效率上，微鏈載體基本上能與質粒載體具有相同的轉染效率。實驗結果初步達到了預期的目的，能較好地說明微鏈載體作為一種通用的基因治療載體在EBV相關腫瘤屮具有較好臨床應用意義，同吋本實驗開發的特異性在EBV感染腫瘤細胞中表達的MEKK1微鏈載體對正常細胞理論不具備殺傷作用，能選擇性地殺傷EBV相關腫瘤細胞，起到目前其它方法所不能具備的較好的安全性。由于MEKK1微鏈載體具有目前臨床治療EBV相關腫瘤手段中所不具備的安全性和特異性，因此其有可能發展為EBV相關腫瘤基因治療的臨床方法。權利要求1、一種基因微鏈載體，其特征在于所述載體由線性DNA序列表達框和兩個對稱排列的Cap保護序列組成，所述Cap保護序列封閉線性DNA序列表達框兩端。2、根據權利要求1所述的基因微鏈載體，其特征在于對Cap保護序列進行修飾以構建不同的保護結構。3、根據權利要求2所述的基因微鏈載體，其特征在于所述對Cap保護序列進行修飾是通過模擬真核生物細胞內tRNA相對穩定的c環結構，構建微鏈兩端穩定的Cap序列，分別在其兩端加上Asel、AfIII酶切位點。4、根據權利要求1所述的基因微鏈載體，其特征在于所述線性DNA序列為EGFP基因序列。5、根據權利要求1所述的基因微鏈載體，其特征在于所述線性DNA序列為MEKK1基因序列。6、一種權利要求1或4所述基因微鏈載體的構建方法，其特征在于包括以下步驟(1)模擬體內tRNA穩定C環的帽狀Cap構建；(2)目的基因質粒的提取；(3)基因表達框的獲得；(4)目的基因表達框和Cap序列進行連接；(5)微鏈載體的擴增、純化和保存。7、根據權利要求6所述基因微鏈載體的構建方法，其特征在于提取pEGFP-N3質粒，37℃水浴條件下雙酶切pEGFP-N3質粒4h，采用1%的瓊脂糖凝膠膠回收1.6kb左右的片段；所述目的基因片段和兩端Cap采用摩爾比l:10、16℃條件下進行連接，LigationHigh連接酶作用下連接3060min或T4連接酶作用下過夜連1216h。8、一種權利要求1或5所述基因微鏈載體的構建方法，其特征在于包括以下步驟(1)B95-8培養和細胞收集，EBV的提取及EBV基因組DNA的提取，EBV膜蛋白LMP1啟動子的獲得；(2)pCMV-MEKKl質粒的火量提取及MEKK1基因的獲得；(3)Xhol酶切消化LMP1Promoter及MEKK1基因并對其進行連接；(4)PCR擴增連接產物并利用Asel、AflII對連接產物進行消化；(5)LMP1promoter—MEKKl微鏈載體的構建和量化擴增；(6)將LMP1promoter-MEKKl目的條帶連上T載體并進行量化擴增；(7)構建pEGFP-MEKK1質粒并進行量化擴增;(8)將等量的pCMV-MEKKl質粒、MEKK1-T質粒、MEKKl微鏈載體轉染進入B95-8細胞；(9)Western-blotting檢測pCMV-MEKKl質粒、MEKKl-T質粒、MEKKl微鏈載體在B95-8細胞內MEKKl下游產物TK的表達。9、一種權利要求5所述基因微鏈載體的應用，其特征在于通過裝載EB病毒膜蛋白LMPl的啟動子使得MEKKl基因只在EB病毒感染的細胞中進行表達以制備選擇性殺傷鼻咽癌細胞的藥物。全文摘要本發明公開了一種基因微鏈載體，由線性DNA序列表達框和兩個對稱排列的Cap保護序列組成，Cap保護序列封閉線性DNA序列表達框兩端，對Cap保護序列進行修飾以構建不同的保護結構，在此基礎上，構建了在EB病毒相關腫瘤中特異表達的MEKK1微鏈載體。本發明同時公開了所述基因微鏈載體的構建方法。微鏈載體的線性核酸結構中含有可置換目的基因表達框，使之具有加載外源基因通用性良好、置換方便等優點，此類微鏈載體有望成為一種基因治療的通用型載體，為基因治療的載體開發提供了一條新的思路和方向。文檔編號C12N15/63GK101173294SQ20071003082公開日2008年5月7日申請日期2007年10月12日優先權日2007年10月12日發明者何玉文,軍杜,王紅勝申請人:中山大學