專利名稱：一種香菇7402菌種aflp快速檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物技術檢測方法領域，具體涉及一種香菇7402菌種AFLP快速檢測方法。
背景技術：
我國香菇產量已從1983年的1.95萬噸迅速發展到2005年的242萬噸，占全球香菇總產量的70％以上，改寫了世界食用菌產量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產量差距，有專家預測，由于中國香菇產業的迅猛發展，在近10年內其將成為世界產量最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發展速度，優質的品質及低廉的成本為世界菇業人士矚目，中國香菇已風靡世界。
優質菌種在香菇單產和質量中的貢獻率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產業中的重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種知識產權，同時也要加強保護我們國家自己的品種知識產權，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護我國的品種產權，必須首先建立成熟的品種鑒定技術，為新品種登記奠定基礎。尤其日本2004年4月1日開始實行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是香菇的出口構成了極大的威脅。就國內而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現象，不僅給菇農帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香菇的快速發展；而且，隨著大規模的工廠化栽培方式的出現，對香菇栽培菌株質量的要求越來越高，需要發展更為簡便、快速、準確的菌株鑒定技術，以保證每批次的用種都準確無誤。
近年來，DNA指紋技術的迅速發展為在DNA分子水平上鑒定香菇菌種提供了嶄新的手段。其中AFLP(Amplified FragmentLength Polymorphism)技術為新發展起來的被認為是最有效的分子標記方法。AFLP分析的基本原理是選擇性擴增基因組DNA酶切片段。由于不同基因組DNA的酶切位點存在差異，因而產生了擴增片段長度的多態性。用AFLP方法得到的指紋圖譜具有穩定可靠且多態性豐富等優點，非常適合于菌種鑒定等方面的應用。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種能簡便、快速、準確地對香菇7402菌種進行鑒定的AFLP快速檢測方法。
一種香菇7402菌種AFLP快速檢測方法，包括下列步驟(1)菌絲培養和基因組DNA的提取采用PDY液體培養基(馬鈴薯20％，葡萄糖2％，酵母提取物0.1％)，150rpm，25℃15天搖瓶培養菌絲。濾膜過濾收集菌絲，并用無菌水沖洗兩次，濾紙吸干后貼上標簽放入-20℃冰箱保存備用。
DNA提取采用CTAB法，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，用紫外分光光度儀BECKMAN DU 640測量DNA的濃度和相對純度，并調整所有樣品DNA濃度到100ng/ul。
(2)DNA雙酶切對樣品DNA進行MseI和EcoRI的雙酶切。DNA樣品酶切體系包括(總體積20μl)ddH2O 14.8μl10×Buffer2.0μl10U/μl MseI 0.25μl10U/μl EcoRI 0.25μl100×BSA 0.2μl100ng/μl模板DNA 2.5μl37℃酶切3小時，65℃處理10min。
(3)DNA片段接頭的連接酶切完成的每個DNA樣品，加入5μL如下的反應液，16℃連接過夜。
ddH2O 0.85μlBuffer2.5μl25uM MseI adapter 1.0μl5uM EcoRI adapter 0.5μl3U/μl T4-DNA連接酶 0.15μl(4)DNA酶切產物的預擴增PCR擴增體系(總體積20μl)ddH，O14μl10×PCR Buffer 2.0μl25mmol/L MgCl2 1.2μl10mmol/L dNTP 0.4μl50ng/L M000.6μl50ng/μL E00 0.6μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl
酶連產物 1μlM00和E00為專用引物，是根據Mse和EcoR I酶切位點而設計的，序列分別為E00GAC TGC GTA CCA ATT CM00GAT GAG TCC TGA GTA APCR反應條件72℃ 5min；94℃ 1min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，20cycles；72℃ 5min。PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統觀察并記錄結果。4℃保存備用。
(5)AFLP的選擇性擴增預擴增產物稀釋20倍，作為選擇性擴增的模板。PCR擴增體系(總體積10μl)ddH2O 4.7μl10×PCR Buffer 1.0μl25mmol/L MgCl2 0.8μl10mmol/L dNTP 0.2μl50ng/L Mse11引物 0.3μl50ng/L EcoRI 14引物0.3μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl預擴增產物稀釋液 2.5μlMse11和EcoRI 14引物是在引物M00和E00基礎上設計的，序列如下EcoRI 14GAC TGC GTA CCA ATT CATMse11GAT GAG TCC TGA GTA ACAPCR反應條件94℃ 2min，95℃ 20s，66℃ 30s(每個循環降低1℃)30s，72℃ 2min，10cycles，；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，25cycles；72℃ 10min。PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統觀察結果，用于毛細管電泳檢測。
(6)遺傳分析儀檢測選擇性擴增的AFLP產物在CEQTM 8000遺傳分析儀器進行毛細管電泳檢測，每個反應孔加入0.5μl擴增產物，30μl上樣緩沖液和0.3μl標準分子量，上機檢測。
對114(為生產用種)個收集自全國各地的香菇生產用菌種及少數野生種共164個菌株實驗，只有香菇7402菌株能擴增檢測出分子量為214bp的特殊DNA條帶(圖1)，樣品在不同時間和不同泳道檢測重復性在0.5bp(圖2)該檢測方法與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高的優點。該檢測所需時間只需要4-5天，而常規的拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要至少3個月的時間；該方法采用毛細管電泳技術進行擴增條帶的分離結合熒光信號檢測該方法與傳統檢測技術相比，具有準確性、重復性好的特點。


圖1AFLP檢測圖譜1箭頭標注的為214bp的特殊條帶。
圖2 AFLP檢測圖譜2箭頭標注的為214bp的特殊條帶，樣品在不同時間和不同泳道檢測重復性在0.5bp。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例1菌絲培養和基因組DNA的提取采用PDY液體培養基(馬鈴薯20％，葡萄糖2％，酵母提取物0.1％)，150rpm，25℃15天搖瓶培養香菇7402菌株菌絲。濾膜過濾收集菌絲，并用無菌水沖洗兩次，濾紙吸干后貼上標簽放入-20℃冰箱保存備用。
DNA提取采用CTAB法，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，用紫外分光光度儀BECKMAN DU 640測量DNA的濃度和相對純度，并調整所有樣品DNA濃度到100ng/ul。
DNA雙酶切對樣品DNA進行MseI和EcoRI的雙酶切。DNA樣品酶切體系包括(總體積20μl)ddH2O 14.8μl10×Buffer2.0μl10U/μl MseI 0.25μl10U/μl EcoRI 0.25μl100×BSA 0.2μl100ng/μl模板DNA 2.5μl37℃酶切3小時，65℃處理10min。
DNA片段接頭的連接酶切完成的每個DNA樣品，加入5μL如下的反應液，16℃連接過夜。
ddH2O 0.85μlBuffer2.5μl25uM MseI adapter 1.0μl5uM EcoRI adapter 0.5μl3U/μl T4-DNA連接酶 0.15μlDNA酶切產物的預擴增PCR擴增體系(總體積20μl)ddH，O14μl10×PCR Buffer2.0μl25mmol/L MgCl21.2μl10mmol/L dNTP 0.4μl50ng/μL M00 0.6μl50ng/μL E00 0.6μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl酶連產物 1μlM00和E00為專用引物，是根據Mse和EcoRI酶切位點而設計的，序列分別為E00GAC TGC GTA CCA ATT CM00GAT GAG TCC TGA GTA APCR反應條件72℃ 5min；94℃ 1min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，20cycles；72℃ 5min。PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統觀察并記錄結果。4℃保存備用。
AFLP的選擇性擴增預擴增產物稀釋20倍，作為選擇性擴增的模板。PCR擴增體系(總體積10μl)ddH2O 4.7μl10×PCR Buffer 1.0μl25mmol/L MgCl2 0.8μl10mmol/L dNTP 0.2μl
50ng/μL Mse11引物 0.3μl50ng/μL EcoRI 14引物 0.3μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl預擴增產物稀釋液 2.5μlMse11和EcoRI 14引物是在引物M00和E00基礎上設計的，序列如下EcoRI 14GAC TGC GTA CCA ATT CATMse11GAT GAG TCC TGA GTA ACAPCR反應條件94℃ 2min，95℃ 20s，66℃ 30s(每個循環降低1℃)30s，72℃ 2min，10cycles，；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，25cycles；72℃ 10min。PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統觀察結果，用于毛細管電泳檢測。
遺傳分析儀檢測選擇性擴增的AFLP產物在CEQTM 8000遺傳分析儀器進行毛細管電泳檢測，每個反應孔加入0.5μl擴增產物，30μl上樣緩沖液和0.3μl標準分子量，上機檢測。可擴增檢測出分子量為214bp的特殊DNA條帶。
權利要求
1.一種香菇7402菌種AFLP快速檢測方法，包括如下步驟(1)菌絲培養和基因組DNA的提取(2)DNA雙酶切對樣品DNA進行MseI和EcoRI的雙酶切；(3)DNA片斷接頭的連接接頭使用MseI adapter與EcoRI adapter；(4)DNA酶切產物的預擴增預擴增的專用引物，是根據MseI和EcoRI酶切位點而設計的，序列分別為E00GAC TGC GTA CCA ATT CM00GAT GAG TCC TGA GTA A(5)AFLP的選擇性擴增預擴增產物稀釋20倍，作為選擇性擴增的模板。選擇性擴增的引物Mse1 11和EcoRI14是在引物M00和E00基礎上設計的序列如下EcoRI 14GAC TGC GTA CCA ATT CATMse1 11GAT GAG TCC TGA GTA ACA(6)遺傳分析儀檢測選擇性擴增的AFLP產物在遺傳分析儀器進行毛細管電泳檢測。
2.如權利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測方法，其特征在于步驟(1)所述的菌絲培養和基因組DNA的提取包括下列步驟采用PDY液體培養基(馬鈴薯20％，葡萄糖2％，酵母提取物0.1％)，150rpm，25℃15天搖瓶培養菌絲；濾膜過濾收集菌絲，并用無菌水沖洗兩次，濾紙吸干后貼上標簽放入-20℃冰箱保存備用，DNA提取采用CTAB法，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，用紫外分光光度儀BECKMAN DU 640測量DNA的濃度和相對純度，并調整所有樣品DNA濃度到100ng/ul。
3.如權利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測方法，其特征在于步驟(2)所述的DNA雙酶切條件為DNA樣品酶切體系包括(總體積20μl)ddH2O14.8μl10×Buffer 2.0μl10U/μl MseI 0.25μl10U/μl EcoRI0.25μl100×BSA 0.2μl100ng/μl模板DNA 2.5μl37℃酶切3小時，65℃處理10min。
4.如權利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測方法，其特征在于步驟(3)所述的DNA片斷接頭的連接為酶切完成的每個DNA樣品，加入5μL如下的反應液，16℃連接過夜ddH2O0.85μlBuffer2.5μl25uM MseI adapter 1.0μl5uM EcoRI adapter 0.5μl3U/μl T4-DNA連接酶 0.15μl。
5.如權利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測方法，其特征在于步驟(4)所述的DNA酶切產物的預擴增的擴增體系為(總體積20μl)ddH2O14μl10×PCR Buffer2.0μl25mmol/L MgCl21.2μl10mmol/L dNTP 0.4μl50ng/μL M000.6μl50ng/μL E000.6μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl酶連產物 1μlPCR反應條件72℃5min；94℃1min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，20cycles；72℃5min。PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統觀察并記錄結果。4℃保存備用。
6.如權利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測方法，其特征在于步驟(5)所述的AFLP的選擇性擴增PCR擴增體系(總體積10μl)ddH2O4.7μl10×PCR Buffer1.0μl25mmol/L MgCl20.8μl10mmol/L dNTP 0.2μl50ng/μL MseI 17引物 0.3μl50ng/μL EcoRI 11引物 0.3μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl預擴增產物稀釋液 2.5μlPCR反應條件94℃2min，95℃20s，66℃30s(每個循環降低1℃)30s，72℃2min，10cycles，；94℃30s，56℃30s，72℃2min，25cycles；72℃10min。PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統觀察結果，用于毛細管電泳檢測。
7.如權利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測方法，其特征在于步驟(6)所述的遺傳分析儀為CEQTM8000遺傳分析儀。
8.如權利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測方法，其特征在于香菇7402菌種能擴增檢測出分子量為214bp的特殊DNA條帶。
全文摘要
本發明公開一種能簡便、快速、準確地對香菇7402菌種進行鑒定的AFLP快速檢測方法。方法包括步驟菌絲培養和基因組DNA的提取；DNA的MseI和EcoRI雙酶切；DNA片斷使用MseI adapter與EcoRI adapter進行連接；DNA酶切產物的預擴增；AFLP的選擇性擴增；遺傳分析儀檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101042370SQ200710040320
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月29日 優先權日2007年4月29日
發明者陳明杰, 譚琦, 尚曉冬, 宋春艷, 卓英, 潘迎捷 申請人:上海市農業科學院食用菌研究所