一種快速靈敏的gⅱ型諾如病毒微陣列基因芯片檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及體外診斷試劑技術領域，具體涉及一種快速靈敏的GII型諾如病毒微 陣列基因芯片檢測方法。
【背景技術】
[0002] 諾如病毒感染性腹瀉是由諾如病毒屬病毒引起的腹瀉，具有發病急、傳播速度快、 涉及范圍廣等特點，是引起非細菌性腹瀉暴發的主要病因。美國每年有2 300萬例非細菌性 急性胃腸炎由諾如病毒引起，占各種腸道傳染病的60%，并常引起醫院感染暴發。Hamano等 報道日本Okay ama地區77 %急性暴發性非細菌性胃腸炎與諾如病毒有關。Wu等報道2004年 11月23日至2005年3月9日臺灣10個縣報告的12次暴發性胃腸炎疫情中諾如病毒都被檢出。 我國學者用RT-PCR和序列分析證明不同基因型杯狀病毒感染在我國嬰幼兒中普遍存在。 2006年，我國病毒性腹瀉監測網絡監測5歲以下嬰幼兒腹瀉患者糞便標本中杯狀病毒檢出 率為14.4%。國內血清流行病研究亦表明我國成人諾如病毒既往感染率高達90 %左右。目 前我國流行的人類諾如病毒主要以GII .4為主。
[0003] 目前檢測諾如病毒的方法有電鏡觀察、免疫學檢測和分子生物學檢測方法。電鏡 法因為諾如病毒缺乏典型的杯狀病毒特征，而且常因病毒量少而難以發現。且檢測結果受 操作者熟練程度的影響很大，加上檢測靈敏度相對較低，因此不適于臨床檢測和大規模流 行病學調查。免疫學方法是基于抗原和抗體之間的相互作用檢測各種物質（如藥物、激素、 蛋白質、細菌等）的分析方法。免疫學方法包括膠體金標記免疫層析法，酶聯免疫吸附分析 法，化學發光免疫分析，熒光免疫分析，免疫聚合酶鏈法等一系列分析方法。這些方法成本 較低，操作簡單，但是其靈敏度較低，容易造成漏檢的現象。
[0004] 進入本世紀后，隨著分子微生物生物學和分子化學的飛速發展，對病原微生物的 鑒定已不再局限于對它的外部形態結構及生理特性等一般檢驗上，而是從分子生物學水平 上研究生物大分子，特別是核酸結構及其組成部分。在此基礎上建立的眾多檢測技術中，核 酸探針(Nuclear acid probe)和聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction)以及新近發 展起來的基因芯片(DNA microarray)技術的建立與廣泛應用，為全面快速準確地分析鑒定 水體、空氣、土壤和食品等環境中的各種微生物提供了一種嶄新的技術工具和平臺。目前， 基因芯片已廣泛應用于包括環境微生物、微生物生態，人類、獸醫、食品和植物的診斷，以及 水質監控、工業微生物等等，而基因芯片應用于食源性致病微生物檢測的研究也不斷發展。
[0005] 基因芯片技術利用待檢測樣品的基因組序列設計針對各種微生物的特異探針，將 該探針(寡核苷酸)點樣于芯片表面，同時在探針兩側設計PCR引物，在引物合成過程中對其 5'端進行熒光標記或在PCR過程中加入熒光標記的dNTP，這樣利用PCR擴增的方法即可得到 標記有熒光染料的待檢測靶標，然后用含有待檢測樣品特異探針的微陣列芯片與標記的靶 標雜交，熒光標記的DNA分子與芯片上相匹配的DNA序列發生雜交反應，使得芯片上的點呈 現出熒光信號，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在GII型 諾如病毒。
[0006] 本發明整合了聚合酶鏈式反應(PCR)和微陣列這兩種強大的分子生物學技術，根 據GΠ . 4諾如病毒保守基因片段設計引物和探針，進行RT-PCR反映，把RT-PCR雜交的探針直 接固定在微陣列中的雜交艙中，與RT-PCR反應室在同一張芯片上。RT-PCR反應結束后可以 直接加入雜交液進行雜交，操作簡單，節省時間。本發明的檢測方法可運用于GII型諾如病 毒快速靈敏的檢測，作為免疫學方法及鏡檢法的可靠補充，提高檢測的準確性和時效性，可 大大地降低檢測的周期。

【發明內容】

[0007] 本發明所要解決的技術問題是提供一種快速靈敏的GII型諾如病毒微陣列基因芯 片檢測方法。通過本發明可大幅度提高進出口 口岸一線檢驗檢疫人員的檢測效率，既可減 少工作量、又可最大限度地解決傳統檢測方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地 防止諾如病毒引起的腹瀉傳染病的發生，同時也可應用于醫院諾如病毒感染的檢測。
[0008] 本發明所提供的快速靈敏的Gn型諾如病毒微陣列基因芯片檢測方法，包括如下 步驟：
[0009] (1)糞便樣本RNA液提取；
[0010] (2)RT-PCR 擴增：
[0011] a.RT-PCR反應體系包括:PCR反應緩沖液，特異性正、反向引物，PCR Grade H20， PCR質控品，逆轉錄/DNA聚合酶液，RNA提取液；
[0012] b.將RT-PCR反應液加入已固化特異性探針的芯片內，將芯片放入反應室內進行擴 增反應；
[0013] 所述的特異性引物根據RdRP基因片段、0RF1與0RF2交界處基因片段兩段保守基因 進行設計;所述的特異性探針是根據特異性引物擴增區內設計能夠區別其他物種，特異性 引物和探針為：
[0014] RdRP基因片段
[0015] GIIl-F:5'-GAGTATGGTCTCAAGCCAACCCGTCC-3' (SEQ ID NO 1)
[0016] GIIl-R:5'-ACGTGCTCAAGTCTGAGAACCTCATC-3' (SEQ ID NO 2)
[0017] Probel:5'-TACTTAGACAGATGTATTGGAC-3' (SEQ ID NO 3)
[0018] 和0RF1與0RF2交界處基因片段(4993-5336)
[0019] GΠ 2-F:5'-CGTGCCCAGCCAAGAGCGATGTTCAG-3' (SEQ ID NO 4)
[0020] GII2-R:5'-ATCAGGGCCCAAGGGCGCGCTCCA-3' (SEQ ID NO 5)
[0021] Probe2:5，-GCGATCGCAATCTGGCTCC-3' (SEQ ID NO 6)
[0022] 或根據RdRP基因片段、0RF1和0RF2交界處基因片段兩段保守基因之一設計的特異 性引物和探針：
[0023] RdRP基因片段
[0024] GIIl-F:5'-GAGTATGGTCTCAAGCCAACCCGTCC-3' (SEQ ID NO 1)
[0025] GIIl-R:5'-ACGTGCTCAAGTCTGAGAACCTCATC-3' (SEQ ID NO 2)
[0026] Probel:5'-TACTTAGACAGATGTATTGGAC-3' (SEQ ID NO 3)
[0027] 或0RF1與0RF2交界處基因片段(4993-5336)
[0028] GII2-F:5'-CGTGCCCAGCCAAGAGCGATGTTCAG-3' (SEQ ID NO 4)
[0029] GII2-R:5'-ATCAGGGCCCAAGGGCGCGCTCCA-3' (SEQ ID NO 5)
[0030] Probe2:5，-GCGATCGCAATCTGGCTCC-3' (SEQ ID NO 6)
[0031] (3)雜交:PCR擴增完后，將雜交反應液加入芯片，使雜交液和擴增液都進入到雜交 艙內雜交反應；
[0032] (4)清洗:雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測；
[0033] (5)結果判讀。
[0034] 步驟（1)中所述的RNA提取可使用RNA提取試劑盒提取諾如病毒RNA，取100ul液體 奠便樣本或者〇. lg的固體奠便溶于1ml生理鹽水，混勾后，5〇〇〇rpm離心，取上清液按照試劑 盒說明書中的提取步驟提取RNA。
[0035] 步驟（2)中所述的RT-PCR反應體系為：2X RT-PCR反應液12.5ul，引物混合液 2.5ul，14mM MgS04 2.5ul，PCR Grade H20 lul,逆轉錄酶/DNA聚合酶液lul，PCR質控2ul, 樣本5ul。
[0036] 步驟(2)所述的RT-PCR反應體系中逆轉錄酶/DNA聚合酶為Superscript III RT/ Platinum Taq Mix。
[0037] 步驟(2)所述的RT-PCR擴增的反應條件是:50°C逆轉錄20min，95°C預變性2min;95 °C 變性 15s，56°C 退火 40s，72°C 延伸 5〇8,40個循環，72°(3延伸111^11。
[0038] 步驟(2)所述的PCR擴增與步驟(3)所述的雜交在芯片儀上完成。
[0039]本發明針對GII型諾如病毒保守基因，設計引物，在引物擴增區內設計能夠區別其 他諾如病毒及親緣關系較近的物種的特異性探針，對兩段保守基因同時設計引物和探針可 提高GII型諾如病毒的特異性。通過探針特異性驗證、探針靈敏度實驗、方法特異性實驗等 證明該方法可以檢測GII型諾如病毒，與常規PCR方法比較，檢測靈敏度與熒光PCR擴增基本 近似，不僅可以滿足日常疫情安全檢測的要求，甚至可以滿足臨床樣品的檢測要求。本發明 與現有檢測方法相比，將RT-PCR的擴增過程和雜交檢測過程濃縮到一張芯片上檢測，大大 縮減了檢測的時間和復雜性，檢測設備簡單易于攜帶。檢測靈敏度與實時熒光方法基本一 致，大大提尚了當如的檢測能力。而從樣品米集到檢測總時間完全可以在3小時內完成，有 益于快速準確的檢測GII型諾如病毒。
【附圖說明】
[0040] 圖1實施例1靈敏性實驗中實時熒光PCR方法檢測結果。
[0041] 圖中檢測到的分別是提取液原液和ΠΓ1稀釋液。
[0042] 圖2實施例1中芯片法檢測到的GII型諾如病毒核酸ΠΓ1稀釋液。
[0043] 圖3實施例1中芯片檢測法的特異性結果。
【具體實施方式】
[0044] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0045] 實施例1 GII型諾如病毒芯片檢測特異性與靈敏性
[0046] 一、實驗步驟
[0047] 1.糞便樣本的采集
[0048