專利名稱：武夷菌素高產菌株f64及發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物新菌株，具體地說是一種不吸水鏈霉菌武夷變種的高產菌株(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)F64，本發明還涉及利用該菌株發酵生產生物農藥-武夷菌素的方法。
背景技術：
生物農藥是21世紀農藥產業發展的新方向，其中抗生素類殺菌劑是生物農藥產業化發展最快的產品之一。武夷菌素是中國農業科學院研制的具有防病增產效果的生物農藥產品，其來源于不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)產生的一種抗生素(微生物學報，24401-402，1984)，主要用于防治農作物真菌病害，具有高效、廣譜、低毒、環境安全的特點，因此，在生態農業和綠色食品生產中具有廣闊的應用前景。武夷菌素的生產是利用培養武夷菌素產生菌，通過生物深層發酵產生的微生物的次生代謝產物。工廠化發酵生產過程中所使用產生菌產素能力的高低以及培養基配方的優劣是決定抗生素生產成本、防效的關鍵因素。因此，通過遺傳育種技術選育高產生產菌株、優化發酵培養基的營養成分以及營養成分的配比，對于降低武夷菌素的生產成本、能耗，提高防治農作物病害的效果，加快我國自主研發的農用抗生素產業化發展具有重要意義。
目前，武夷菌素產品的生產方法為二級生物發酵，生產上使用的產生菌生物效價約為2500-3000ug/ml，發酵培養時間為120小時。近幾年，隨著生產菌株傳代增加，菌株退化嚴重，目前效價只有1800-2000ug/ml，培養時間也明顯增加，同時，由于用原來的培養基配方生產武夷菌素發酵液中含糖過多，后處理的成本增加。耗能、費時。過高生產成本的嚴重影響武夷菌素的產業化生產。
研究武夷菌素殺菌劑的高產、高效的生產方法，對于提高我國的農用抗生素自行開發、創制的能力和水平，提高具有自主知識產權的新微生物農藥產業化程度，不僅直接為農業生產提供新生物農藥品種，而且為開發微生物農藥產品提供基礎。

發明內容
本發明的第一個目的是提供一種生產生物農藥-武夷菌素的高產菌株(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)F64。該菌株已于2007年3月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1967。
本發明的另一個目的在于提供利用該菌株生產武夷菌素的發酵培養發法。
本發明以不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)BO-10(韋日清等，微生物學報24401-402，1984)為出發菌株，通過物理、化學和高能離子注入的誘變技術改進武夷菌素生產菌株，通過室內生物測定的方法篩選該菌種的高產突變菌株并確定菌株產素的穩定性，得到不吸水鏈霉菌武夷變種的高產菌株F64(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis F64)(保藏號為CGMCC1967)。該菌株在合成培養基上孢子絲呈十分緊密的長螺旋形，一般為5-12圈，孢子為橢圓或卵圓形，大小均勻，表面帶細刺。在深層發酵條件下，菌絲生長呈網狀；在高氏合成一號瓊脂、察氏瓊脂等培養基上培養，氣生菌絲由灰白變為象灰、褐色；基內菌絲體為淡黃、麥秸黃或淺黃，并由淡黃、微黃色的可溶性色素產生。生理特性水解淀粉，液化明膠塊，纖維素上不生長，不產生硫化氫；利用D-木糖、D-葡萄糖、鼠李糖、棉子糖、甘露糖等，不利用L-阿拉伯糖。功能特性對革蘭氏陽性、陰性細菌，酵母菌及真菌有抑制作用，如枯草桿菌(Escherichia coli)，稻瘟病菌(Piricularia oryzae)，棉花枯萎病菌(Verticillium dahliae)等病原真菌。
本發明以F64為發酵生產菌株，以利用部分因子設計法(FractionalFactorial Design，FFD)對武夷菌素發酵生產培養基配方中營養因子包括淀粉、葡萄糖、玉米粉、豆餅粉、氯化鈣、氯化銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈉共10種營養成分的主效應進行考察，篩選影響武夷菌素效價的關鍵因子；根據JMP軟件中的響應面設計模塊程序，采用2因素5水平(共13組實驗)的中心組合設計法(CentralComposite Design，CCD)對關鍵因子進行優化。根據實驗所得數據進行二次多項式的回歸擬和，預測武夷菌素產量的最大值及其所對應的關鍵因子的濃度。以多元二次方程所預測的最佳培養基為發酵培養基并進行多組發酵實驗，確定優化的武夷菌素培養基配方。
通過上述方法獲得的優化培養配方為玉米粉15-25mg/ml，黃豆餅粉20-35mg/ml，葡萄糖20-35mg/ml，氯化銨1-5mg/ml，碳酸鈣1-5mg/ml，硫酸鎂0.1-0.5mg/ml，硫酸亞鐵0.1-0.5mg/ml，氯化鈉0.1-0.5mg/ml，磷酸氫二鉀0.1-0.5mg/ml。更優選為玉米粉20mg/ml，黃豆餅粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化銨3mg/ml，碳酸鈣3mg/ml，硫酸鎂0.2mg/ml，硫酸亞鐵0.2mg/ml，氯化鈉0.2mg/ml，磷酸氫二鉀0.2mg/ml。與傳統的發酵培養基配方相比，主要營養成份減少，增加了微量元素成份，總的成本降低。
發酵條件為轉速150～200rpm，溫度25～35℃，罐壓0.01～0.15MPa，通氣量1∶0.5～1，發酵時間50～100小時，發酵50～108小時。優選為轉速180rpm，溫度28℃，罐壓0.10MPa，通氣量1∶0.9，發酵時間78小時。
武夷菌素生物檢測方法以深紅酵母AS2.282(Rhodotorula rubra)為檢測菌，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基20％土豆汁，2％葡萄糖，0.8％瓊脂)為檢測培養基(中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)編菌種目錄，第三版，中國農業科技出版社，1997年)，采用管碟法檢測武夷菌素的生物活性。
本發明中的所述的通氣量是指每分鐘通過單位體積發酵液的氣體的量，即每分鐘本發明提供的武夷菌素高產菌株F64，采用常規培養基和培養條件下，效價可達5000u/ml；通過優選的發酵方法，其效價可達6500u/ml。本發明的武夷菌素發酵生產技術，可以用于生物農藥武夷菌素的工廠化生產，采用該方法生產武夷菌素殺菌劑發酵液濃縮倍數2-3倍，可達效價10000-11000u/mL。在相同發酵罐和發酵條件下，比原有方法產品產量提高40-50％，節約成本20-30％，防病效果提高15-20％。綜上所述，本發明提供了一種高產、節本、增效的武夷菌素殺菌劑發酵生產技術，對于實現我國自主創新生物農藥產業化發展，擴大使用范圍，促進農業可持續發展有著主要意義。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1 培養基配方配方1玉米粉20mg/ml，黃豆餅粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化銨3mg/ml，碳酸鈣3mg/ml，硫酸鎂0.2mg/ml，硫酸亞鐵0.2mg/ml，氯化鈉0.2mg/ml，磷酸氫二鉀0.2mg/ml；配方2玉米粉15mg/ml，黃豆餅粉35mg/ml，葡萄糖35mg/ml，氯化銨1mg/ml，碳酸鈣1mg/ml，硫酸鎂0.5mg/ml，硫酸亞鐵0.5mg/ml，氯化鈉0.1mg/ml，磷酸氫二鉀0.5mg/ml；配方3玉米粉25mg/ml，黃豆餅粉20mg/ml，葡萄糖20mg/ml，氯化銨5mg/ml，碳酸鈣5mg/ml，硫酸鎂0.1mg/ml，硫酸亞鐵0.1mg/ml，氯化鈉0.5mg/ml，磷酸氫二鉀0.1mg/ml。
實施例2 搖床發酵生產方法在含有玉米粉20mg/ml，黃豆餅粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化銨3mg/ml，碳酸鈣3mg/ml，硫酸鎂0.2mg/ml，硫酸亞鐵0.2mg/ml，氯化鈉0.2mg/ml，磷酸氫二鉀0.2mg/ml的培養基中接種F64，28℃搖床震蕩培養，轉速為180rpm/分鐘，時間為72小時。發酵液過濾后去除菌絲體，采用生物效價檢測法測定效價達到6500u/ml。濃縮2倍效價可達或超過有效成份為1％的武夷菌素產品質量標準(10000u/ml)，該濃縮液可直接作為殺菌機使用。
實施例3 發酵罐發酵生產方法取F64菌株活化后，經一級種子培養32小時，按照10％(v/v)的接種量轉接到發酵培養基，在發酵罐中擴大培養40-50小時。
發酵培養基為玉米粉20mg/ml，黃豆餅粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化銨3mg/ml，碳酸鈣3mg/ml，硫酸鎂0.2mg/ml，硫酸亞鐵0.2mg/ml，氯化鈉0.2mg/ml，磷酸氫二鉀0.2mg/ml。
發酵條件為溫度30℃，轉速200rpm，通氣量1∶0.9，罐壓0.10MPa。發酵78小時。發酵液過濾后去除菌絲體，采用管碟法測定效價。
結果效價達到6500u/ml，濃縮2倍效價可達10000u/ml的濃縮液即可作為殺菌機使用。
實施例4 武夷菌素有效成分的分離純化及理化性質收集發酵培養物，用0.5～1％草酸酸化到pH2.5，攪拌后靜置過夜，過濾；濾液經顆粒活性炭柱脫色，活性碳流出液用732#陽離子樹脂柱(河北新河新光化工有限公司)吸附，先用水洗脫，再用0.5mol/L氨水洗脫，當流出液pH大于7.0后開始接收，濃縮接收液至小體積(30～50ml)；再過中性氧化鋁柱脫色，先用水洗脫，再用3％氨水洗脫，收集活性高的流出液濃縮至干；干粉用少量水溶解，上LH-20凝膠柱(北京慧德易科技有限公司)，用蒸餾水洗脫，收集活性高的流出液濃縮至干，即得武夷菌素粗品。武夷菌素粗品經Sephadex-G-25柱層析(上海君創生物科技有限公司)，水洗脫，經HPLC檢測后將主要成分含量在75％以上部分合并，冷凍干燥后再經HPLC半制備柱進行制備，制備后可得到只含武夷菌素A和武夷菌素B的精制品，其中主要成分武夷菌素A的含量可達到86％左右，武夷菌素B的含量為13％左右。采用多種方法分離，武夷菌素A和武夷菌素B的含量之比始終保持在7∶1。武夷菌素的理化性質武夷菌素精制品的冷干物為微黃色粉末，易吸潮，熔點239℃(碳化)，極易溶于水，微溶于甲醇，不溶于丙酮、氯仿、吡啶等有機溶劑。
實施例5 武夷菌素田間用藥的制備收集實施例2的發酵培養物，過濾，濾液經減壓濃縮2-3倍，濃縮溫度60℃，得到的武夷菌素含量為10000-12000u/ml濃縮液即可用于田間蔬菜、果樹和糧食作物真菌病害的防治。
實施例6 武夷菌素的田間應用武夷菌素防治蔬菜白粉病黃瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)是黃瓜主要病害之一，一般造成減產10～20％，嚴重的達50％以上。取實施例5的濃縮液稀釋200-400倍噴霧防治黃瓜白粉病，每畝噴200斤水，防治效果為91.46％，同時使用的化學農藥粉銹寧稀釋500倍，防治效果96.36％(黃仲生、楊玉茹，生物防治通報1(4)47，1985)。
武夷菌素防治番茄葉霉病番茄葉霉病(Cladosporium fulvum)是保護地番茄主要病害之一。取實施例5的武夷菌素濃縮液分別稀釋200倍、250倍、300倍防治番茄葉霉病，每畝噴200斤水，防治效果分別為86.93％、83.07％、54.21％，使用的對照農藥為75％代森錳鋅300倍稀釋液，防效效果64.41％。
武夷菌素防治茶樹病茶樹云紋葉枯病(Guignardia camelliae)和輪斑病(Pestalotia guepini)是茶樹上發生最普遍，危害最嚴重的病害之一，一般茶園茶樹發病率58.4％和15.5％。取實施例5的武夷菌素濃縮液分別稀釋600倍噴施兩次，間隔14天，對云紋葉枯病、輪斑病的防治效果分別為78.60％、84.00％。
武夷菌素防治棉花枯萎病棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f.vasinfectum)是棉花生產中最嚴重的病害，被稱為棉花的癌癥。在我國所有棉區均有發生，常常導致棉花絕產和絕收。取實施例5的武夷菌素濃縮液分別稀釋200倍浸種24小時，同時采用稀釋500倍液噴施兩次，間隔14天，對棉花枯萎病的防治效果為61.83-67.97％，以50％多菌靈膠懸劑進行相同處理為對照，防病效果為2.28％，幾乎無效。
權利要求
1.不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)F64 CGMCC No.1967。
2.權利要求1所述的菌株在制備生物農藥-武夷菌素中的應用。
3.一種用于培養權利要求1所述菌株的發酵培養基，其特征在于每100毫升培養基中含有玉米粉15～25mg，黃豆餅粉20～35mg，葡萄糖20～35mg，氯化銨1～5mg，碳酸鈣1～5mg，硫酸鎂0.1～0.5mg，硫酸亞鐵0.1～0.5mg，氯化鈉0.1～0.5mg，磷酸氫二鉀0.1～0.5mg。
4.如權利要求3所述的培養基，其特征在于每100毫升培養基中含有玉米粉20mg，黃豆餅粉32mg，葡萄糖27.2mg，氯化銨3mg，碳酸鈣3mg，硫酸鎂0.2mg，硫酸亞鐵0.2mg，氯化鈉0.2mg，磷酸氫二鉀0.2mg。
5.一種深層發酵法制備生物農藥-武夷菌素的方法，其特征在于，發酵條件為轉速150～200rpm，溫度25～35℃，罐壓0.01～0.15MPa，通氣量1∶0.5～1，發酵時間50～100小時，接種量為5-20％；發酵所用的培養基為權利要求3或4所述的培養基；發酵所用的菌株為權利要求1所述的菌株。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述發酵培養條件為轉速180rpm，溫度28℃，罐壓0.10MPa，通氣量1∶0.9，發酵72小時，接種量為10％。
7.根據權利要求5或6所述的方法得到的生物農藥武夷菌素發酵液和濃縮液。
8.權利要求7所述的發酵液和濃縮液在農作物真菌病害防治中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomycesanhygroscopicus var.wuyiensis)的誘變菌株F64 CGMCC No.1967。在常規培養條件下用本發明的菌株來制備一種新型生物農藥－武夷菌素，其發酵液效價可以達到5000u/ml以上。本發明還進一步優化了該菌株的發酵培養方法。利用優化的培養方法，特別是新的培養基配方發酵生產武夷菌素，其發酵液效價可以達到6000～6500u/ml，比利用現有的技術和出發菌種制備武夷菌素縮短發酵生產時間5～10小時，發酵液的效價提高150～200％，產量提高100％，節約成本20～30％，防病效果提高15～20％。
文檔編號C12P1/04GK101050441SQ20071006501
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月30日 優先權日2007年3月30日
發明者張克誠, 石義萍, 付月靈, 王立東, 阿拉坦夫, 王萬群, 展麗然 申請人:中國農業科學院植物保護研究所