專利名稱：動物源性產品中冠狀病毒檢測基因芯片的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及動物源性產品疫病檢測技術，具體涉及8種冠狀病毒包括牛冠狀病毒(BCV)、犬冠狀病毒(CCV)、貓冠狀病毒(FCVO、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)、火雞冠狀病毒(TCV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和人呼吸道冠狀病毒(HCV)在動物源性產品內的快速檢測。
背景技術：
冠狀病毒又名日冕病毒，目前所知，冠狀病毒科病毒可感染人和多種脊椎動物，與人和多種動物的疾病有關，具有胃腸道、呼吸道和神經系統嗜性，感染后分別引起相應的癥候群，主要引起人和動物呼吸道、消化道、肝臟和神經系統的疾病。特別是2003年世界一些國家相繼爆發了人嚴重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，造成五百多人死亡，帶來巨大的生命和經濟損失，造成嚴重的社會動蕩，其病原已被確定為一種新型的冠狀病毒，從而冠狀病毒更加被人們所重視。
同一群的不同冠狀病毒間核苷酸和氨基酸序列間均具有較高的同源性，而不屬于同一群的不同冠狀病毒間核苷酸和氨基酸序列間的同源性則較低，并且不同冠狀病毒間的基因組有重組現象，因此僅靠對一個冠狀病毒的單個基因的診斷，很難準確對該冠狀病毒感染進行診斷.需要克隆一個冠狀病毒的多個不同基因片斷，特別是分離和鑒定區分不同種屬冠狀病毒的基因片段克隆，再利用這些基因片段同時對該冠狀病毒進行診斷，才能更為準確診斷冠狀病毒感染。
基因芯片是90年代中期發展起來的一項尖端技術，將大量核酸片段(寡核苷酸/RNA、cDNA、基因組DNA)以預先設計的方式固定在玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體上組成密集分子排列，當熒光標記的靶分子與芯片上的探針分子結合后，通過激光共聚焦掃描或電荷偶聯攝影像機(CCD)對熒光信號的強度進行檢測，從而判斷樣品中靶分子的數量。基因芯片在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子識別探針。
2003年6月，科技部863計劃十五重大專項“功能基因組和生物芯片”正式立項，并啟動了由上海出入境檢驗檢疫局主持的“生物芯片在動物源性食品安全檢測中的應用”項目，開展了對動物源性產品中冠狀病毒基因芯片檢測技術的系統研究。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于檢測動物源性產品中冠狀病毒的基因芯片，固定在芯片上的核苷酸片斷為1～8種冠狀病毒相對應的特征性cDNA片段的固相載體和每種病毒特異的引物混合組。
上述8種冠狀病毒是牛冠狀病毒(BCV)、犬冠狀病毒(CCV)、貓冠狀病毒(FCVO)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)、火雞冠狀病毒(TCV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和人呼吸道冠狀病毒(HCV)。
其中采用的特征性片段來源于8種冠狀病毒包括BCV、CCV、FCV、FIPV、PRCV、TCV、TGEV和HCV的特異cDNA克隆。
本發明的目的是這樣實現的獨立研究構建了8種冠狀病毒103個特異克隆，經過雜交篩選后選擇無交叉的特異51個克隆，煮沸裂解法制備質粒DNA，PCR擴增產物抽干濃縮后溶于50％二甲基亞砜，終濃度為300ng/μl，點制冠狀病毒基因芯片。然后對待檢樣品應用3～5對特異的引物進行RT-PCR，擴增過程中單色熒光cy-3標記的dCTP隨機滲入進行標記，經42℃水浴3個小時進行冠狀病毒基因芯片的雜交，通過激光共聚焦掃描。具體如下本發明的檢測動物源性產品中冠狀病毒的基因芯片包括固定與8種冠狀病毒相對應的特征性cDNA片段的固相載體、每種病毒特異的引物混合組。
固相載體為回收特異的PCR探針片段，抽干后每個片段加入50％二甲基亞砜15μl，使各個終濃度達到300ng/μl。按照冠狀病毒基因芯片點陣的矩陣排布圖的順序，轉移入384孔板中進行點樣。固定2小時，避光保存備用。
每種病毒特異的引物混合物為根據冠狀病毒基因芯片的點陣排布圖，確定每個點陣所對應的基因克隆和相應的引物，每一種病毒的3~5對引物分為一組。具體引物組為BCV(BCV6、BCV3、BCV8、BCV9、BCV10和BCV2、BCV7、BCV12、BCV13BCV14)、CCV(CCV1、CCV2、CCV5、CCV7)、FCV(FCV6、FCV7、FCV8、FCV9)、FIPV(FIPV2、FIPV7、FIPV8、FIPV9)、PRCV(PRCV1、PRCV2、PRCV3)、TCV(TCV1、TVC2、TCV3、TCV5和TCV6、TCV7、CV9)、HCV(HCV3、HCV4、HCV5、HCV12和HCV6、HCV8、HCV13、HCV15)、TGEV(TGEV3、TGEV4、TGEV5、TGEV6)和通用引物。
其檢測程序為(1)芯片變性水煮沸無氣泡后，放入芯片，變性90秒，取出，放入-20℃預冷的無水乙醇中驟冷2min，放入離心機1000轉/分鐘，離心3分鐘甩干，備用；(2)應用商品化的不同試劑盒提取樣品中不同冠狀病毒RNA并反轉錄，應用每種病毒特異的引物混合組和通用引物PCR擴增，同時加入Cy3-dCTP。反應體系cDNA模板3μL、蒸餾水15.7μL、10倍Taq酶緩沖液(Mg2+free)2.5μL、MgCl21.5μL、dNTP(10∶1)0.5μL、引物(上下游混合引物)1μL、Taq酶0.3μL、Cy3-dCTP0.5μL。利用合成的通用引物，cDNA混合模板進行PCR擴增，PCR循環條件為94℃變性5min；94℃、45sec，40℃、45sec，72℃、60sec，5個循環；94℃、45sec，50℃、60sec，72℃、60sec，30個循環，72℃延伸10min。；(3)cy-3標記病毒PCR擴增產物芯片雜交液的配制將多重PCR對病毒cDNA的擴增標記產物放入Eppendorf Concentrator中。56℃，30~90分鐘抽干，加入5.5μL滅菌去離子水溶解，加入芯片雜交液，配制雜交反應體系，其組成如下(按雜交模板的不同采用不同濃度的甲酰胺)PCR產物濃縮液5.5μL、20×SSC2.25μL、50×Denhardt’s1.5μL、甲酰胺(25％終濃度)3.75μL、50mM1270.5μL、2％SDS1.5μL。對混合好的PCR產物雜交體系，96℃變性5-10分鐘，然后立即放置冰上。
(4)基因芯片的雜交將變性好的芯片放入雜交盒中，雜交盒中預先加入200μL蒸餾水，將雜交反應液加到芯片上，蓋好蓋，置42℃水浴鍋中雜交2-3h。
(5)基因芯片的洗滌雜交結束后，取出芯片，放入洗液I中，在42℃恒溫搖床中100轉/分鐘，洗滌4-5分鐘，然后取出基因芯片，放入洗液II中，在42℃恒溫搖床中100轉/分鐘，洗滌4分鐘，放入離心機1000轉/分鐘，離心3分鐘甩干，備用。
(6)芯片掃描，數據分析。
本發明判定標準為陽性參照點、雜交質量控制點顯示很強的熒光信號，陰性對照點和空白對照點不顯示信號。樣品多重PCR對應的各點顯示很強的熒光信號為陽性結果。
本發明有益的積極效果是操作簡單、快速、高通量，為食品安全檢測提供了新的技術平臺，能較好滿足目前對冠狀病毒檢測的迫切需要，用于進出口檢疫、食品衛生部門檢測等，易于大范圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
本發明具有下列優點(1)高通量、快速、準確。應用基因芯片可達到一次試驗同時檢測多種疾病或分析多種生物樣品的目的，可以有效診斷冠狀病毒感染，對預防、控制和消滅冠狀病毒感染有著廣闊的前景。通過PCR擴增可以增加cy-3標記的待檢樣品的數量，進一步提高冠狀病毒基因芯片的檢測信號，且一次可以檢測一種冠狀病毒的多個基因片段，更利于準確地診斷和鑒定冠狀病毒的感染。
(2)操作簡便快速，批量檢測。可以同時對大量樣品是否攜帶8種冠狀病毒進行檢測，在5-6小時內即可準確判定檢測結果。
(3)結果判定形象、準確、可靠。以激光掃描、熒光信號的有無顯示檢測結果，判定形象。采用激光掃描儀器，準確可靠。
(4)靈敏度高冠狀病毒基因芯片與多重PCR結合比傳統的多重PCR對冠狀病毒cDNA的檢測，敏感性至少高出1000倍。


圖1為本發明的一個較佳實施例8種冠狀病毒基因芯片點陣的矩陣排布。圖中QC質量控制對照，10μM HEX(擬南芥某基因序列)，BC空白對照，50％的二甲基亞砜，NC陰性對照，127(SARS)，ECHLA的PCR產物。
具體實施例方式
根據本發明的技術方案，較佳實施例的具體制備如下1、固定與8種冠狀病毒相對應的特征性cDNA片段的固相載體回收特異的PCR探針片段，抽干后每個片段加入50％二甲基亞砜15μl，使各個終濃度達到300ng/μl。按照冠狀病毒基因芯片點陣的矩陣排布圖的順序，轉移入384孔板中進行點樣。固定2小時，避光保存備用。
2、每種病毒特異的引物混合物根據冠狀病毒基因芯片的點陣排布圖，確定每個點陣所對應的基因克隆和相應的引物，每一種病毒的3~5對引物分為一組。具體引物組為BCV(BCV6、BCV3、BCV8、BCV9、BCV10和BCV2、BCV7、BCV12、BCV13BCV14)、CCV(CCV1、CCV2、CCV5、CCV7)、FCV(FCV6、FCV7、FCV8、FCV9)、FIPV(FIPV2、FIPV7、FIPV8、FIPV9)、PRCV(PRCV1、PRCV2、PRCV3)、TCV(TCV1、TVC2、TCV3、TCV5和TCV6、TCV7、CV9)、HCV(HCV3、HCV4、HCV5、HCV12和HCV6、HCV8、HCV13、HCV15)、TGEV(TGEV3、TGEV4、TGEV5、TGEV6)和通用引物。冠狀病毒RNA聚合酶基因的通用PCR引物上5’-actca(a/g)(a/t)t(a/g)aat(t/c)tnaaata(t/c)gc-3’，下5’-tcaca(c/t)tt(a/t)ggata(g/a)tccca-3。
3、樣品病毒核酸的提取與標記應用商品化的不同試劑盒提取樣品中不同冠狀病毒RNA，采用Takara公司的AMV逆轉錄酶反應體系制備cDNA，其反應體系如下RNA溶液41μL、逆轉錄酶5倍濃縮緩沖液13μL、dNTP2.0μL、引物OligodT(100pmol/L)1.5μL、RNA酶抑制劑1.5μL、逆轉錄酶6μL。上述反應體系室溫放置10min后，置PCR儀上42℃反應1h，冰水中冷卻2分鐘，得cDNA模板。根據冠狀病毒基因芯片的點陣排布圖，確定每個點陣所對應的基因克隆和相應的引物，每個病毒的3~5對引物分為一組，再進行PCR擴增，每組多重PCR的分組情況、所用引物和循環條件如表1所示，PCR反應體系如下cDNA模板3μL、蒸餾水15.7μL、10倍Taq酶緩沖液(Mg2+free)2.5μL、MgCl21.5μL、dNTP(10∶1)0.5μL、引物(上下游混合引物)1μL、Taq酶0.3μL、Cy3-dCTP0.5μL。利用合成的通用引物，cDNA混合模板進行PCR擴增，PCR循環條件為94℃變性5min；94℃、45sec，40℃、45sec，72℃、60sec，5個循環；94℃、45sec，50℃、60sec，72℃、60sec，30個循環，72℃延伸10min。
4、試劑盒檢測操作程序(1)芯片變性水煮沸無氣泡后，放入芯片，變性90秒，取出，放入-20℃預冷的無水乙醇中驟冷2min，放入離心機1000轉/分鐘，離心3分鐘甩干，備用。
(2)應用商品化的不同試劑盒提取樣品中不同冠狀病毒RNA并反轉錄，應用每種病毒特異的引物混合組和通用引物進行PCR擴增，同時加入Cy3-dCTP。反應體系如下所示。cDNA模板3μL、蒸餾水15.7μL、10倍Taq酶緩沖液(Mg2+free)2.5μL、MgCl21.5μL、dNTP(10∶1)0.5μL、引物(上下游混合引物)1μL、Taq酶0.3μL、Cy3-dCTP0.5μL。利用合成的通用引物，對BCV、CCV、FCV、FIPV、PRCV、HCV、TCV和TGEV的cDNA混合模板進行PCR擴增，PCR循環條件為94℃變性5min；94℃、45sec，40℃、45sec，72℃、60sec，5個循環；94℃、45sec，50℃、60sec，72℃、60sec，30個循環，72℃延伸10min。
(3)cy-3標記病毒PCR擴增產物芯片雜交液的配制將多重PCR對病毒cDNA的擴增標記產物放入Eppendorf Concentrator中。56℃，30~90分鐘抽干，加入5.5μL滅菌去離子水溶解，加入芯片雜交液，配制雜交反應體系，其組成如下(按雜交模板的不同采用不同濃度的甲酰胺)PCR產物濃縮液5.5μL、20×SSC2.25μL、50×Denhardt’s1.5μL、甲酰胺(25％終濃度)3.75μL、50mM1270.5μL、2％SDS1.5μL。對混合好的PCR產物雜交體系，96℃變性5-10分鐘，然后立即放置冰上。
(4)基因芯片的雜交將變性好的芯片放入雜交盒中，雜交盒中預先加入200μL蒸餾水，將雜交反應液加到芯片上，蓋好蓋，置42℃水浴鍋中雜交2-3h。
(5)基因芯片的洗滌雜交結束后，取出芯片，放入洗液I中，在42℃恒溫搖床中100轉/分鐘，洗滌4-5分鐘，然后取出基因芯片，放入洗液II中，在42℃恒溫搖床中100轉/分鐘，洗滌4分鐘，放入離心機1000轉/分鐘，離心3分鐘甩干，備用。
(6)芯片掃描，數據分析。
5、結果判定標準陽性參照點、雜交質量控制點顯示很強的熒光信號，陰性對照點和空白對照點不顯示信號。
樣品多重PCR對應的各點顯示很強的熒光信號為陽性結果。
為驗證本發明效果的可靠性，進行以下鑒定1、不同冠狀病毒不同基因片段多重PCR的擴增根據冠狀病毒基因芯片的點陣排布圖，確定每個點陣所對應的基因克隆和相應的引物，每一種病毒的3~5對引物分為一組，再進行PCR擴增。利用多重PCR引物對病毒cDNA進行擴增，同時加入Cy3-dCTP隨機滲入標記多重PCR產物，并與冠狀病毒基因芯片雜交，洗滌后用基因芯片掃描儀掃描，并用相關的軟件進行分析，陽性參照點、雜交質量控制點和多重PCR對應的各點均顯示很強的陽性結果，而陰性對照點和空白對照點不顯示信號。
2、對病毒cDNA檢測的敏感性測定100倍稀釋的病毒cDNA多重PCR可以擴增出相應的條帶，但1000倍稀釋的cDNA多重PCR未能擴增出相應的條帶。冠狀病毒基因芯片可檢測到105倍稀釋的病毒cDNA多重PCR擴增標記的產物，而對106倍稀釋的cDNA多重PCR擴增標記的產物的檢測，幾乎觀察不到信號。
權利要求
1.動物源性產品中冠狀病毒檢測基因芯片，包括芯片以及固定在芯片上的核苷酸片斷，其特征在于固定在芯片上的核苷酸片斷為1～8種冠狀病毒相對應的特征性cDNA片段的固相載體和每種病毒特異的引物混合組。
2.按權利要求1所述動物源性產品中冠狀病毒檢測基因芯片，其特征在于8種冠狀病毒是牛冠狀病毒(BCV)、犬冠狀病毒(CCV)、貓冠狀病毒(FCVO)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)、火雞冠狀病毒(TCV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和人呼吸道冠狀病毒(HCV)。
全文摘要
本發明公開了一種檢測動物源性產品中冠狀病毒的基因芯片，芯片固定了與8種冠狀病毒相對應的特征性cDNA片段的固相載體、每種病毒特異的引物混合組。每種病毒特異的引物混合物為根據冠狀病毒基因芯片的點陣排布圖，確定每個點陣所對應的基因克隆和相應的引物，每一種病毒的3～5對引物分為一組。本發明陽性參照點、雜交質量控制點顯示很強的熒光信號，陰性對照點和空白對照點不顯示信號。樣品多重PCR對應的各點顯示很強的熒光信號為陽性結果。該方法檢測的靈敏度比PCR敏感1000倍，本發明操作簡單、快速、高通量，能較好滿足目前對冠狀病毒檢測的需要，適用于進出口檢疫、食品衛生部門檢測等，易于大范圍推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK101037712SQ200710067268
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月14日 優先權日2007年2月14日
發明者胡永強, 陳沁 , 李健, 熊煒, 王權, 張建武 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局, 上海大學, 中國農業科學院上海獸醫研究所