專利名稱：人端粒酶基因轉導骨髓間充質干細胞的方法
技術領域：
本發明屬生物技術，涉及一種外源性表達人端粒酶的骨髓間充質干細胞構建和篩選的新技術。這種技術能使骨髓間充質干細胞高效表達外源人端粒酶，由此提高骨髓間充質干細胞的生命周期。
背景技術：
目前常用可用于延長細胞生命周期、使細胞永生化的技術大致可歸為四種Epstein-Barr病毒(EBV)感染技術，轉猴病毒40(SV40)大T抗原技術，轉16型人乳頭瘤病毒(HPV16)E6/E7技術，轉端粒酶基因技術。EB病毒與細胞共培養使細胞永生應用最多的是B淋巴細胞。EB病毒永生化B淋巴細胞的一個最顯著特點就是端粒酶活性提高，這是導致B淋巴細胞永生的主要原因。SV40是簡單的真核細胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，將其整合人靶細胞核內并表達，可導致細胞增殖活力的改變并表現出多種與腫瘤相關的轉化顯型。但是Shay等(1989)研究結果表明，在大多數情況下，SV40轉染細胞的永生化率非常低。乳頭瘤病毒E6、乙型肝炎病毒(HBV)可以使一些特殊細胞的增殖能力加強，但它們并不是使細胞永生的常用病毒。人乳頭瘤病毒E6蛋白通過對端粒酶催化亞基(hTERT)的轉錄調控而激活端粒酶；hTERT啟動子上游HBV增強子的整合可順式激活hTERT基因轉錄，這種順式激活作用是hTERT基因轉錄及端粒酶調節的原發機制。端粒酶是由RNA和蛋白質組成的復合體，為一種特殊的DNA聚合酶，合成DNA到染色體末端。端粒酶一旦被激活，將維持端粒縮短和延長的動態平衡，從而使細胞獲得無限增殖的能力，使之永生。病毒轉化的各種人永生化細胞試驗結果證明端粒酶活化可能是細胞永生化的共同步驟。延長細胞生命周期，使細胞永生化最常用的技術就是通過構建含端粒酶催化亞基(hTERT)的表達載體，通過各種方法來轉染細胞。

發明內容
本發明的目的是提供一種人端粒酶基因轉導骨髓間充質干細胞的方法，是通過轉基因技術，對人骨髓間充質干細胞轉導人端粒酶基因，提高人骨髓間充質干細胞中這種蛋白的表達水平，達到提高骨髓間充質干細胞的生命周期的目的。通過以下方案實現(1)構建pLXSN-hTERT表達載體，pGRN145質粒(Geron Corportion，Menlo Park，CA)采用Hpa I和Not I限制性內切酶(Takara)酶切，經瓊脂凝膠電泳分離提純得到hTERT cDNA片段，并與采用相同限制性內切酶酶切的pLXSN載體(Stratagene，La Jolla，CA)相連，構建成pLXSN-hTERT重組表達載體。
本發明對pGRN145質粒采用Hpa I和Not I限制性內切酶酶切，經瓊脂凝膠電泳分離提純得到hTERT cDNA片段，第一步行hTERT cDNA片段提純。
本發明對pLXSN載體(Stratagene，La Jolla，CA)采用Hpa I和Not I限制性內切酶酶切，經瓊脂凝膠電泳分離提純得到pLXSN載體片段，第二步行表達載體片段提純。
本發明所用的人反轉錄病毒載體是采用pLXSN載體，獲得高效表達hTERT的pLXSN-hTERT重組表達載體。
(2)構建高效表達外源hTERT基因的人骨髓間充質干細胞，依據LipofectAMINE脂質體轉導試劑盒(Life Technologies，Grand Island，NY)指導說明書，通過兼噬性包裝細胞系PA317(ATCC，Rockefeller，MA)制備pLXSN-hTERT重組表達載體懸浮液后，在1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(Polybrene，Sigma，St.Louis，MO)輔助下對人骨髓間充質干細胞(邱麗燕等，2004)進行8個小時的pLXSN-hTERT表達載體轉導。由此構建高效表達外源hTERT基因的人骨髓間充質干細胞。
(3)采用低濃度(20微克/毫升和50微克/毫升)潮霉素(Hygromycin)(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)進行雙重篩選轉導外源hTERT基因的人骨髓間充質干細胞的技術，提高轉導外源hTERT基因的骨髓間充質干細胞的存活能力。
本發明的有益效果是(1)本發明提供的技術中采用hTERT和pLXSN載體相接的高效表達hTERT的pLXSN-hTERT表達載體轉導，達到了構建高效表達hTERT外源性基因的人骨髓間充質干細胞的效果。
(2)本發明技術構建的外源性表達hTERT的人骨髓間充質干細胞在低溶度Hygromycin(Amresco，USA)雙重篩選培養體系中，除去了培養體系中未轉導hTERT的人骨髓間充質干細胞，提高了構建外源性表達hTERT的人骨髓間充質干細胞的成功率。


圖1高效表達hTERT的表達載體pLXSN-hTERT。
圖2用RT-PCR技術，Northern blotting技術檢測hTERT基因的表達和用Western blotting技術檢測hTERT蛋白的表達。
圖3用流式細胞儀分析第95代hTERT-hMSCs細胞的表面抗原圖4用流式細胞儀分析第275代hTERT-hMSCs細胞的表面抗原圖5用流式細胞儀分析正常第13代hMSCs細胞的表面抗原。
圖6用G-顯帶分析細胞的核型。
圖7骨髓間充質干細胞永生系的生命周期分析。
圖8骨髓間充質干細胞永生系向脂肪，軟骨，成骨細胞分化的潛能分析。
圖9軟瓊脂培養克隆形成試驗結果。
圖10免疫缺陷小鼠致瘤實驗結果。
具體實施例方式
本發明結合具體實施例作進一步說明。應理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。
實施例1本發明技術采用Hpa I和Not I限制性內切酶酶切pGRN145質粒，經瓊脂凝膠電泳分離提純得到hTERT cDNA片段，與采用相同限制性內切酶酶切的人反轉錄病毒載體pLXSN載體相連，構建成高效表達hTERT的pLXSN-hTERT重組表達載體，參見圖1。
具體步驟如下一，pGRN145質粒的大量制備(堿裂解法)1)將洗過的500毫升細菌(含pGRN145質粒)培養物沉淀重懸于18毫升溶液I(含50毫摩爾/升葡萄糖，25毫摩爾/升Tris.Cl(pH 8.0)，10毫摩爾/升EDTA(pH 8.0))中。
2)加2毫升新配制的溶菌酶溶液[10毫克/毫升，溶于10毫摩爾/升Tris·Cl(pH 8.0)](當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。)3)加40毫升新配制的溶液II
，蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心瓶數次，以充分混勻內容物。于室溫放置5-10分鐘。
4)加20毫升用冰預冷的溶液III(5摩爾/升乙酸鉀60毫升，冰乙酸11.5毫升，水28.5毫升)。封住瓶口，搖動離心瓶數次以混勻內容物，此時應不再出現分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應形成一白色絮狀沉淀。
5)于4℃以4000轉/分離心15分鐘，使轉頭自然停轉。(若細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉/分再度離心20分鐘，然后盡可能將上清全部轉到另一瓶中，棄去殘留在離心管內的粘稠液體。(未能形成致密沉淀的原因通常是由于溶液III與細菌裂解物混合不充分。)6)用4層干酪包布把上清過濾至一個250毫升離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，與室溫放置10分鐘。
7)于室溫以5000轉/分離心15分鐘，回收核酸(若4℃離心，鹽也會沉淀。)8)小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗沉淀和管壁。倒出乙醇，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發殆盡。
9)用3毫升TE(pH 8.0)溶解核酸沉淀。
10)用聚乙二醇純化質粒DNA.
二，hTERT cDNA片段的制備采用Hpa I，Not I酶切，反應體系如下pGRN 145質粒1微升Hpa I 0.5微升Not I 0.5微升10×Bufer 1微升乙酞化BSA 1微升去離子水6微升總體積10微升37℃溫育16小時，1％瓊脂糖電泳，長波紫外線下觀察，直到插入的目的帶和載體帶清楚的分離后，使用手術刀片切下回收電泳片段，采用凝膠回收試劑盒回收目的條帶。
三，pLXSN載體的制備pLXSN質粒大量制備的基本程序，除了使用的液體和固體LB培養基加入的篩選抗菌素為氨卞青霉素代替了氯霉素外，提取程序與pGRN145質粒的大量制備相同。采用Hpa I，Not I酶切，反應體系如下pLXSN質粒 1微升
Hpa I0.5微升Not I0.5微升10×Bufer1微升乙酞化BSA1微升去離子水 6微升總體積 10微升37℃溫育16小時，1％瓊脂糖電泳，長波紫外線下觀察，直到插入的目的帶和載體帶清楚的分離后，使用手術刀片切下回收電泳片段，采用凝膠回收試劑盒回收目的條帶。
四，hTERT cDNA片段同pLXSN載體的連接，形成hTERT-pLXSN質粒載體和目的片段(hTERT)連接反應體系pLXSN 1微升hTERT cDNA 1微升T4 ligase Bufer(10×) 1微升T4 ligase 0.5微升去離子水6.5微升總體積 10微升上述反應的加樣順序是，首先將載體和目的片段和去離子水加入到反應管中，65℃水浴5分鐘，立即冰浴使粘性末端暴露，然后加入T4連接酶和連接酶緩沖液。連接反應在16℃條件下進行，連接18小時。
五，制備感受態細菌以下實驗均在無菌條件下完成。(1)接種0.1毫升TOP10菌種到6毫升無抗菌素LB液體培養基中，以200r/min速度在37℃搖床振蕩培養，當液體的OD 600值達到0.4后將培養管置于冰水浴中。(2)在超凈工作臺內，無菌分裝菌液，每管1.5毫升，4℃ 4000rpm離心5分鐘，棄上清。(3)每管加入0.5毫1冰預冷的0.1摩爾/升CaCl2懸浮菌體。(4)4℃ 4000rpm離心5分鐘，棄上清后加入0.1毫升冰預冷的0.1摩爾/升CaCl2重懸菌體后，置4℃冰箱次日使用。
六，制備含青霉素的固體平板培養基(1)稱取胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl 10克，加蒸餾水1000毫升，使其充分溶解，加入5摩爾/升NaOH調PH至7.0。(2)取250毫升三角燒瓶10只，每只加入瓊脂1.5克后加入溶解后的液體LB培養基100毫升。1.034×105帕高壓滅菌20分鐘，常溫保存備用。(3)制備固體LB平板時，取出100毫升的無抗菌素固體LB，在微波爐內加熱使其融化后，置室溫等待其溫度降低到50-55℃時，加入氨芐青霉素(50毫克/毫升)0.3毫升，混均后倒入無菌的平皿中，常溫下等其凝固后置4℃。
七，轉化感受態細胞(1)取前一天制備的感受態細胞一支，加入第三步的連接質粒產物hTERT-pLXSN 5微升，混均后冰浴30分鐘。(2)42℃水浴90秒，熱休克后立即冰浴2分鐘。(3)加入無抗菌素的液體LB培養基400微升，37℃溫育1小時。(4)4000rpm離心10分鐘，棄上清400微升液體，取余下的100微升重懸轉化菌，全部鋪于含有抗菌素的LB固體平板上，37℃溫育16小時，可見轉化菌落生長。
八，轉化菌的小量培養、擴增和質粒提取采用v-gene公司的少量質粒抽提試劑盒。(1)取含有氨芐青霉素的LB固體平板上的單個轉化菌落，接種到6毫升含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，以200r/min速度在37℃搖床振蕩培養16小時后，取菌液1.5毫1置于離心管中，4000rpm離心5分鐘，棄上清。(2)加入250微升的溶液I，充分懸浮菌體。(3)加入250微升溶液II，注意混勻，此時液體變得澄清和粘稠，置室溫放置2分鐘。(4)加入400微升溶液III，置室溫放置2分鐘。(5)12000rpm離心10分鐘，回收上清。(6)將上清置于質粒回收柱中，5500rpm離心1分鐘。(7)棄廢液，加入500微升washing buffer，5500rpm離心1分鐘。(8)重復步驟7一次。(9)12000rpm離心1分鐘，加入60微升TE緩沖液置室溫2分鐘。12000rpm離心1分鐘，所得質粒溶液置于-20℃備用。
九，重組菌的篩選取固體平板上的單個轉化菌落，接種到0.1毫升含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，以200r/min速度在37℃搖床振蕩培養16小時后，用PCR方法篩選目的質粒。人端粒酶基因上游引物序列5’-CTC TCC CCC TTG AAC CTCCTC GTT C；下游引物序列5’-AGG ACA CCT GGC GGA AGG AG。
具體反應體系上游引物序列(10微摩爾/升) 1微升下游引物序列(10微摩爾/升) 1微升MgCl(25毫摩爾/升) 1.2微升菌液 0.5微升
dNTP(4毫摩爾/升) 1微升Taq DNA polymerase(10單位/微升)0.4微升Buffer(10×) 2微升去離子水 12.9微升總體積 20微升操作過程首先在無菌0.2毫升離心管中，依次加入除了Taq聚合酶之外的各種反應物質，置94℃水浴中預變性5分鐘，立即置入冰水浴中。加入Taq聚合酶后進PCR循環。條件如下94℃變性30秒；52℃退火30秒；72℃延伸80秒；周期25個循環。PCR周期結束后，置72℃延伸7分鐘。將PCR產物1％瓊脂糖凝膠電泳后，溴化乙錠染色，手提式紫外分析儀下觀察，獲得陽性克隆。用堿裂解法提取陽性克隆的質粒。
十，pLXSN-hTERT重組質粒鑒定采用酶切圖譜法，使用Hpa I；Not I作酶切。
pLXSN-hTERT的Hpa I ；Not I酶切體系pLXSN-hTERT1微升Hpa I 0.5微升Not I 0.5微升10×Bufer 1微升乙酞化BSA 1微升去離子水 6微升總體積 10微升以上反應體系的酶切反應在37℃溫育2小時，1％瓊脂糖凝膠電泳后，溴化乙錠染色，短波紫外分析儀下觀察和投射紫外分析儀下拍照。
實施例2本發明技術采用LipofectAMINE脂質體轉導試劑盒，按試劑盒使用方法進行重組表達載體懸浮液的制備和對人骨髓間充質干細胞的轉導。按照試劑盒說明書，采用兼噬性包裝細胞系PA317制備重組病毒載體懸浮液，并用200微克/毫升潮霉素進行篩選重組表達載體4天。在8微克/毫升的1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(Polybrene；Sigma，St.Louis，MO)輔助下，于10-cm的培養皿(Maxisorp，Nunc，Denmark)中對2.0×105個人骨髓間充質干細胞進行8個小時的重組表達載體轉導。然后用磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞，并用20微克/毫升潮霉素進行第一次篩選細胞7天。7天后以正常培養液洗滌細胞，并繼續用50微克/毫升潮霉素進行第二次篩選細胞7天。之后，用正常完全培養液進行傳代培養。
實施例3本發明技術采用RT-PCR技術和Northern blotting技術檢測轉導的人骨髓間充質干細胞中hTERT基因的表達水平。結果顯示轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞有效表達了hTERT基因，參見圖2A、2B，圖中顯示了(A)用RT-PCR檢測hTERT基因的表達，其中包括Marker(3kb)泳道，泳道1第95代hTERT-hMSCs細胞的hTERT基因和β-actin基因的表達，泳道2第275代hTERT-hMSCs細胞的hTERT基因和β-actin基因的表達，泳道3正常第13代hMSCs細胞的hTERT基因和β-actin基因的表達，泳道4用水做對照的RT-PCR。(B)用Northern blotting檢測hTERT基因的表達，其中包括泳道1第95代hTERT-hMSCs細胞的hTERT基因和β-actin基因的表達，泳道2第275代hTERT-hMSCs細胞的hTERT基因和β-actin基因的表達，泳道3正常第13代hMSCs細胞的hTERT基因和β-actin基因的表達。
1、RT-PCR技術檢測設計外源人端粒酶基因RT-PCR檢測的引物序列(上游5’-CTC TCCCCC TTG AAC CTC CTC GTT C；下游5’-AGG ACA CCT GGC GGA AGGAG)，產物片斷408bp。對照β-actin的引物序列(上游5’-CAT CTC TTG CTCGAA GTC CA-3’；下游5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A)，產物片斷318bp。進行RT-PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后觀察和檢測外源端粒酶基因mRNA的表達。
2、RNA提取步驟(采用Invitrogen公司的TRIZOL總RNA提取試劑盒，按使用說明書進行)(1)以10cm2的培養瓶底面積加入1毫升Trizol(Invitrogen，Beijing，China)的比例加入Trizol進行勻漿。
(2)4℃下12000g離心10分鐘，將上清轉移到一潔凈無RNA酶(RNase)的離心管中(RNA存在于上清中)。
(3)室溫放置5分鐘。每1毫升Trizol加入0.2毫升氯仿，蓋好試管，劇烈搖動15秒鐘，室溫溫浴3分鐘，4℃12000g離心15分鐘。離心后混合物分為三層，底部紅色的酚-氯仿層，中間相和無色的上層水相，RNA只存在于上層水相中。
(4)轉移水相至一潔凈的試管中，加0.5毫升異丙醇洗滌沉淀，4℃下12,000g離心5分鐘。
(5)稍微干燥RNA沉淀(空氣干燥5-10分鐘)，用適量的去離子水溶解RNA，電泳檢測RNA的質量(RNA不能徹底干燥，否則很難溶解)。
3、逆轉錄的步驟(按照逆轉錄酶試劑盒的說明書進行)1)cDNA的合成反應體系(1)在一個0.2毫升的離心管中混合引物，RNA和四種脫氧核糖核酸混合物(dNTP Mix)，用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水調整體積至11微升。
成分 數量50μM Oligo(dT)18引物 0.5微克總RNA 0.1-5微克去離子水(無核酸酶)至11微升(2)上述混合物于70℃溫浴5分鐘，然后立即置于冰上。
(3)使用前振蕩5×cDNA合成緩沖液5秒鐘。
(4)往上述離心管中加入以下成分成分 數量5×反應緩沖液 4微升10mM dNTP Mix 2微升核糖核酸酶抑制劑(Ribonuclease inhibitor) 20單位去離子水(無核酸酶)至19微升于37℃下溫浴5分鐘，添加200單位的逆轉錄酶。將上述混合物短暫離心混勻后，立即放于42℃反應60分鐘合成cDNA。
反應完成后，立即置于70℃10分鐘，滅活逆轉錄酶。
合成的cDNA第一鏈于-20℃保存備用。
2)外源端粒酶基因cDNA的PCR擴增PCR反應體系(總體積50微升)反應成分 一個反應10×PCR緩沖液 5微升2毫摩爾dNTP Mix5微升引物1(10微摩爾)1微升引物2(10微摩爾)1微升Taq DNA多聚酶 1微升(共5個單位)
模板DNA2微升25豪摩爾MgSO4 2微升去離子水 33微升終體積 50微升PCR擴增反應的條件預變性94℃、120秒鐘，然后94℃、30秒鐘，退火58℃、45秒鐘，延伸72℃、45秒鐘，共30個循環，取15微升PCR產物于2％瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增結果。
3)Northern-blotting技術檢測RNA電泳a.配制1％瓊脂糖甲醛變性膠稱取瓊脂糖3克，加入30毫升10×MOPS(3-[N-嗎啉]-丙磺酸)、255毫升0.1％DEPC-H2O加熱至瓊脂糖完全熔化后在室溫放置冷卻至60℃，加入16.2毫升37％甲醛溶液，混勻后制膠。
b.加樣及電泳取RNA樣品20微克，加20微升RNA上樣緩沖液，混勻后65℃水浴變性5分鐘，同時將膠放入裝有1×MOPS電泳緩沖液的電泳槽中，預電泳10分鐘，然后加樣，在100伏電壓下電泳至樣品跑出加樣孔后電壓調至60伏電泳至溴酚藍染料遷移至膠下游的3/4處，電泳結束后，用0.25微克/毫升溴乙錠EB染色，將膠移至紫外圖像分析儀上進行分析。
c.轉膜含甲醛的凝膠須用DEPC水淋洗數次，去除甲醛；切去凝膠上的左上角，作為標記。用紙巾毛細孔虹吸作用，將凝膠上RNA轉移到尼龍膜上。轉移時間16小時，然后將尼龍膜于80℃真空干燥2小時后，貯存于室溫。
d.標記探針取25納克探針，變性后用隨機引物標記試劑盒和[32P]dCTP進行標記，-20℃保存，用之前再次變性處理。
e.雜交和放射自顯影1)預雜交和雜交把膜放在含有6×檸檬酸緩沖液(SSC)，5×Denhardt緩沖液，0.5％十二烷基磺酸鈉(SDS)和100微克/毫升變性鮭魚精DNA的預雜交液中，58℃預雜交1小時。倒出預雜交液，換入含有6×SSC，0.5％SDS和100微克/毫升變性鮭魚精DNA的雜交液和50微升同位素標記的探針，于58℃雜交16小時。
2)洗膜、放射自顯影尼龍膜在1×SSC，0.1％SDS溶液中室溫洗膜20分鐘；用0.2×SSC，0.1％SDS于68℃洗膜3次，每次20分鐘。膜在室溫中自然干燥后，用保鮮膜包好，在暗室中用X光片進行放射自顯影，于-70`曝光7天后，常規顯影、定影。
實施例4本發明采用Western blotting技術檢測轉導的人骨髓間充質干細胞中hTERT蛋白的表達。結果顯示轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞有效表達了hTERT蛋白，參見圖2C，圖中(C)用Western blotting檢測hTERT蛋白的表達，其中包括泳道1第95代hTERT-hMSCs細胞的hTERT蛋白和β-actin蛋白的表達，泳道2第275代hTERT-hMSCs細胞的hTERT蛋白和β-actin蛋白的表達，泳道3正常第13代hMSCs細胞的hTERT蛋白和β-actin蛋白的表達。
a.蛋白質樣品準備移去單層貼壁生長至90％匯合的骨髓間充質干細胞和轉基因骨髓間充質干細胞中的培養液。加入4毫升4℃預冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次后，棄去PBS緩沖液并將培養瓶置于冰上；按1毫升細胞裂解液(Roche，NewJersey，USA)加10毫升苯甲基磺酰氟(PMSF)(100毫摩爾/升)，搖勻置于冰上。每瓶細胞加400毫升含PMSF的裂解液，于冰上裂解30分鐘后，將細胞碎片和裂解液移至1.5毫升離心管中；于4℃下12,000轉/每分鐘離心5分鐘。將離心后的上清分裝轉移到0.5毫升的離心管中放于-20℃保存備用。
b.蛋白質含量測定(見表1)制作標準曲線從-20℃取出1毫克/毫升BSA，室溫融化后，備用。取18個1.5毫升離心管，3個一組，分別標記為0毫克，2.5毫克，5.0毫克，10.0毫克，20.0毫克，40.0毫克。按下表在各管中加入各種試劑。混勻后，室溫放置2分鐘。在生物分光光度計上比色分析。
表1蛋白質含量的測定

檢測樣品蛋白含量取足量的1.5毫升離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍溶液1毫升。室溫放置30分鐘后用于測蛋白。取一管考馬斯亮藍加0.15摩爾/升NaCl溶液100毫升，混勻放置2分鐘做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下測空白樣品。棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次，再用無菌水洗1次。取一管考馬斯亮藍加95毫升0.15摩爾/升NaCl溶液和5毫升待測蛋白樣品，混勻后靜置2分鐘測樣品。
c.SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)安裝完凝膠裝置后以8％分離膠灌膠，加一層水，等待液封后的膠凝膠凝，倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干；灌制5％的濃縮膠，將梳子插入濃縮膠中，濃縮膠凝固后，拔出梳子；上樣前將樣品煮5分鐘使蛋白變性加入，5×SDS上樣緩沖液后，上樣50微克蛋白樣品；以60伏的電壓電泳3-4小時，觀察溴酚藍位置終止電泳，進行轉膜。
d.蛋白質的轉膜硝酸纖維素膜(Immobilon-NC膜，Millipore，USA)的處理甲醇中浸泡15秒鐘，然后滅菌水沖洗2分鐘，最后轉移到轉移緩沖液中平衡5分鐘；凝膠的處理用滅菌水沖洗膠，然后浸泡于轉移緩沖液中平衡15分鐘；轉膜組裝轉移裝置，冷卻條件下60伏電壓轉膜2小時；轉膜效果檢查轉膜后用1×麗春紅染液染色5分鐘，檢查膜上的蛋白。將膜晾干備用。
e.免疫反應將膜用Tris鹽緩沖液(TBS)從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，封閉1小時；將一抗用Tween-Tris鹽緩沖液(TBST)稀釋至適當濃度(以1∶20,000溶于TBST)，室溫下孵育3-4小時，或4℃下過夜；然后用TBST在室溫下脫色搖床上漂洗2次，每次10分鐘；再用TBS漂洗10分鐘；準備二抗稀釋液(以1∶5,000溶于TBST)并與膜接觸，室溫下孵育2小時后，然后用TBST在室溫下脫色搖床上漂洗2次，每次10分鐘；再用TBS漂洗1次，持續10分鐘，進行化學發光反應。
f.化學發光顯色反應抗體反應后的膜轉移到TSM溶液(0.1mol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mol/LNaCl，0.01mol/L MgCl2)，5分鐘×2；然后加入顯色底物5-溴-4-氯-3-吲跺磷酸/氮藍四唑(BCIP/NBT)，室溫暗處顯色；TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTAPH8.0)終止反應。
實施例5本發明采用流式細胞術方法檢測轉導的人骨髓間充質干細胞的表面標志。結果顯示轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞同正常人骨髓間充質干細胞的表面標志是一致的。第95代hTERT-hMSCs細胞的表面抗原參見圖3，第275代hTERT-hMSCs細胞的表面抗原參見圖4，正常第13代hMSCs細胞的表面抗原參見圖5。它們的細胞表面抗原都顯示CD29(圖D)、CD44(圖A)、CD105(圖B)和CD166(圖C)為陽性(+)，CD34(圖H)、CD45(圖G)、CD117(圖E)和HLA-DR(圖F)為陰性(-)。
檢測流程1、不同代次的hTERT-hMSCs生長到大約60-80％融合時，胰酶消化液(Trysin-EDTA消化液，吉諾，杭州，中國)消化細胞，用PBS緩沖液洗滌細胞3次；2、收集的細胞重懸于PBS緩沖液中，400目尼龍篩網過濾細胞團塊，收集分散良好的單細胞群；3、分別加入各種熒光素標記的單克隆抗體，混勻細胞懸液，于4℃下避光孵育30min；4、用乙二胺四乙酸-小牛血清白蛋白-磷酸緩沖液(EDTA-BSA-PBS，上海生工，上海，中國)洗滌細胞液2次，300×g離心細胞懸液5分鐘，洗去未結合的單抗。細胞重懸于EDTA-BSA-PBS緩沖液中；5、用EDTA-BSA-PBS緩沖液重懸細胞群，400目尼龍篩網過濾細胞，調節細胞密度為2×106細胞/毫升，總體積為1毫升，500微升用于流式分析，500微升備用；6、實驗設計如下未標記的細胞群(空白對照)，小鼠IgG(同型抗體)，各種細胞群單染色的待測樣品(實驗組)，FITC-單抗(熒光補償1)，PE-單抗(熒光補償2)；7、上樣空白對照和小鼠IgG同型抗體調節熒光檢測器(FL2)的電壓；8、用PE-單抗和FITC-單抗調節FL2的熒光補償；9、最后上樣單染色的各個細胞群，設門圈定細胞群分析流式細胞結果。
實施例6本發明采用Giemsa染色方法[2]分析轉導的人骨髓間充質干細胞的細胞核型。結果顯示轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞同正常人骨髓間充質干細胞的細胞核型是一致的，參見圖6，用G-顯帶分析細胞的核型(A)第95代hTERT-hMSCs細胞的細胞核型，(B)第275代hTERT-hMSCs細胞的細胞核型，(C)正常第13代hMSCs細胞的細胞核型。它們的細胞染色體長度、著絲粒位置、次縊痕、隨體的有無、臂比值、著絲粒指數以及相對長度表明hTERT-hMSCs細胞同正常hMSCs細胞的細胞核型是一致的，在轉染，傳代過程中沒有發生轉化以及其它污染。
檢測流程1.35mm培養皿常規培養48小時(指數生長期)，換新鮮培養液2毫升，加秋水仙素(配制工作液10微克/毫升)至終濃度0.2微克/毫升，輕輕混勻，常規培養4小時。
2.胰酶消化細胞，收集入離心管，生理鹽水沖洗培養皿數次，確認所有細胞均收集入管。
3.1000轉/每分鐘離心10分鐘。
4.棄上清液，加0.5毫升低滲液(0.4％氯化鉀0.4％檸檬酸鈉1∶1配制)滴入離心管，彈勻，再補足1毫升，混勻，37℃水浴低滲5分鐘。1000轉/每分鐘離心10分鐘，棄上清液。
5.加入固定液(甲醇∶冰醋酸3∶1)2毫升，1000轉/每分鐘離心3分鐘。
6.棄上清，加固定液4毫升，吹勻，加蓋室溫固定40分鐘。1000轉/每分鐘離心3分鐘。
7.棄上清，加固定液2毫升，吹勻，加蓋室溫固定20分鐘。1000轉/每分鐘離心3分鐘。
8.去上清，留混合液約0.3毫升，打勻，滴片，50-100厘米高度滴下。(玻片按實驗室玻璃物品常規沖洗，4℃冰箱水浴待用)9.將玻片放65℃烤箱過夜
10.烤箱中取出玻片，Giemsa染色10分鐘。
11.自來水沖洗，自然風干。
實施例7本發明采用細胞傳代的方法檢測轉導的人骨髓間充質干細胞的生命周期，結果顯示轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞在培養了290代之后仍然有旺盛的生命力。而原代hMSC只能傳代25代，參見圖7，傳導了hTERT的骨髓間充質干細胞的生命周期分析。hTERT-hMSCs培養了290代(矩形框表示)，原代hMSCs培養了25代(圓點表示)。
傳代流程1.原代培養的細胞或轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞鋪滿培養瓶90％底面積后，細胞進行傳代培養；2.吸出培養瓶內的培養液，PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，加入Trypsin-EDTA消化液2mL，輕輕前后搖動培養瓶，室溫下消化細胞3分鐘；3.倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，當細胞由梭形回縮時，加2mL MEM-α完全培養液(Gibco BRL，USA)終止消化反應；4.用吸管輕輕吹打粘貼在底面的細胞，直到所有細胞懸浮在培養液中；5.1,000rpm離心5min收集細胞，重懸于MEM-α完全培養液中；6.計數細胞總數，以1∶3的比例進行接種傳代培養，細胞記為P1代；7.細胞長滿90％匯合度時，繼續以1∶3的比例傳代培養，每3d更換等體積的新鮮MEM-α完全培養液，依次記為P2代、P3代、P4代、......。
實施例8本發明采用脂肪誘導液誘導的方法分析轉導的人骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化的潛能。結果顯示轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞在脂肪誘導液的誘導作用下能夠向脂肪細胞分化，參見圖8A、8B、8C，是骨髓間充質干細胞永生系向脂肪，軟骨，成骨細胞分化的潛能分析。骨髓間充質干細胞永生系第95代(A)和第275代(B)細胞經脂肪誘導液誘導14天后經油紅O染色在倒置相差顯微鏡下可見橙紅色脂滴沉著的細胞，對照組未誘導細胞只是細胞核由蘇木素染成藍色(C)。
誘導流程取第25代和第65代的hTERT-hMSCs細胞，消化后制成單細胞懸液，以2×104個/培養皿接種于直徑35毫米的培養皿，共計12個。待細胞達到80-90％融合后，其中實驗組6皿加入脂肪細胞誘導液(α-MEM培養液，10％胎牛血清，100單位/毫升青霉素，100克/毫升鏈霉素，10納克/毫升胰島素樣生長因子-I(IGF-I)，1微摩爾地塞米松，0.5毫摩爾1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤，100微摩爾吲哚美辛)，對照組6皿用常規培養液。每3-4天換液，3周后油紅O染色。
誘導細胞的油紅O染色于21天后取實驗組、對照組6皿進行油紅O染色。棄培養液后，培養皿用PBS清洗3次，室溫下10％甲醛固定10分鐘，飽和油紅O染液孵育2-3小時，60％異丙醇洗去多余染液，蒸餾水清洗2分鐘，Mayer氏蘇木素液染15-30分鐘，1％鹽酸(70％乙醇配制)分化2秒鐘，蒸餾水清洗幾分鐘，堿酒精藍化，中性樹膠封固，觀察。
實施例9本發明采用成軟骨誘導液誘導的方法分析轉導的人骨髓間充質干細胞向成軟骨細胞分化的潛能。結果顯示轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞在成軟骨誘導液的誘導作用下能夠向成軟骨細胞分化，參見圖8D、8E、8F、8G、8H、8I，骨髓間充質干細胞永生系經軟骨誘導液誘導28天，阿爾新藍染色見第95代(D)和第275代(E)細胞胞漿和胞外基質的藍色顆粒，而對照組未誘導細胞只是細胞核被染成紅色(F)。免疫組化法檢測II型膠原表達。可見第95代(G)和第275代(H)誘導組的胞漿和胞內基質被染成紅色，而對照組(I)只是細胞核被染成藍色。
誘導流程采用高密度滴狀培養法，將傳代的細胞懸液以2.5×106/0.5微升培養基的密度轉移到15毫升聚丙烯離心管，500轉/每分鐘離心5分鐘.使其聚集于錐形離心管的底部，形成‘小滴’狀而進行誘導，各實驗管加入成軟骨誘導培養液，隔日換液一次，每次換液總量的4/5。
成軟骨細胞的阿爾新藍染色終止誘導后，用PBS(pH 7.2)洗3次，每次1分鐘，4％多聚甲醛固定標本，蒸餾水沖洗，阿爾新藍8GX(Amresco USA)染色30分鐘，3％醋酸和蒸餾水沖洗。用核真紅液染核4分鐘。樹脂封片，鏡下觀察。
免疫組化法檢測II型膠原表達按照EnVision二步法[3]免疫組化操作步驟。一抗為鼠抗人II型膠原單克隆杭體，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗，3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)顯色，中性樹膠封片。
實施例10本發明采用成骨誘導液誘導的方法分析轉導的人骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的潛能。結果顯示轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞在成骨誘導液的誘導作用下能夠向成骨細胞分化，參見圖8J、8K、8L、8M、8N、8O，骨髓間充質干細胞永生系經成骨誘導液誘導28天，Von Kossa染色顯示磷酸鈣沉積。可見第95代(J)和第275代(K)誘導組的胞漿和胞內基質的磷酸鈣沉積部位被染成黑色。而對照組(L)沒有被染成黑色。NBT/BCIP法顯示堿性磷酸酶活性。可見第95代(M)和第275代(N)誘導組的胞漿和胞內基質被染成深藍色。而對照組(O)只是細胞核被染成淺藍色。標尺100微米。
誘導流程將第25代和第65代的hTERT-hMSCs，消化成單細胞懸液，以3×104個/毫升的密度接種于細胞瓶中，共計12瓶，待細胞達到80％-90％融合后，實驗組6瓶加入含有0.1微摩爾地塞米松，50微克/毫升抗壞血酸，10毫摩爾β-磷酸甘油培養液(10％FBS)進行誘導，對照組6瓶用常規培養液培養。每隔三天換液一次，倒置顯微鏡下觀察。
von kossa染色終止誘導后，用PBS(pH 7.2)洗3次，每次1分鐘，4％多聚甲醛固定標本，5％硫代硫酸鈉孵育30分鐘，蒸餾水沖洗，然后用1％硝酸銀溶液紫外線下染色30分鐘，蒸餾水沖洗掉浮于細胞表面的黑色物質，繼續用5％硫代硫酸鈉染色2分鐘，蒸餾水漂洗后觀察。
堿性磷酸酶染色終止誘導后，用PBS(pH 7.2)洗3次，每次1分鐘，在室溫下用含7.5％蔗糖的1％多聚甲醛固定10～20分鐘，然后用堿性磷酸酶試劑盒染色.根據廠家說明，先用底物緩沖液平衡，在新鮮配制的5-溴-4-氯-3-吲跺磷酸/氮藍四唑(BCIP/NBT)染色液中室溫避光的條件下染色30分鐘以上，水洗.在100倍倒置顯微鏡下觀察分化細胞。
實施例11本發明采用軟瓊脂克隆形成試驗的方法分析轉導的人骨髓間充質干細胞的致瘤性。結果顯示轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞沒有致瘤性，參見圖9，圖中A正常骨髓間充質干細胞第13代培養第1天，B正常骨髓間充質干細胞第13代培養第4天，C正常骨髓間充質干細胞第13代培養第10天，D骨髓間充質干細胞永生系第95代培養第1天，E骨髓間充質干細胞永生系第95代培養第4天，F骨髓間充質干細胞永生系第95代培養第10天，G骨髓間充質干細胞永生系第275代培養第1天，H骨髓間充質干細胞永生系第275代培養第4天，I骨髓間充質干細胞永生系第275代培養第10天，JNIH-3T3細胞培養第1天，KNIH-3T3細胞培養第4天，LNIH-3T3細胞培養第10天。標尺100微米。
軟瓊脂克隆形成試驗流程(1)取對數生長期細胞，用0.25％胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數，用含20％胎牛血清的細胞基本培養液調整細胞密度至1×106細胞/升。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2％和0.7％兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會凝固。
(3)按1∶1比例使1.2％的瓊脂糖和2×完全培養基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3毫升混合液注入直徑6厘米平皿中，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。
(4)按1∶1比例讓0.7％的瓊脂糖和2×完全培養基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2毫升的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2％瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％CO2溫箱中培養10～14天。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數。計算形成率。
實施例12本發明采用免疫缺陷小鼠的方法分析轉導的人骨髓間充質干細胞的致瘤性。結果顯示轉導了hTERT基因的骨髓間充質干細胞沒有致瘤性，參見圖10，圖中A側部皮下注射骨髓間充質干細胞永生系(六個月后照相)，B側部皮下注射陽性細胞人類子宮頸癌細胞系Hela細胞(六十天后照相)，經免疫缺陷小鼠側部皮下注射骨髓間充質干細胞永生系，陽性細胞人類子宮頸癌細胞系Hela細胞，在兩周后觀察腫瘤的形成情況。對照組陽性細胞成瘤率為15/15，而皮下注射骨髓間充質干細胞永生系的小鼠經六個月的觀察。沒有發現腫瘤的形成。
基本步驟(1)取對數生長期細胞，用0.25％胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，用含血清的培養基中和胰蛋白酶，用無血清培養基離心洗滌2次，將細胞懸浮于PBS中，作活細胞計數，調整細胞濃度均為1×107細胞/毫升，備用。非肥胖糖尿病/嚴重聯合免疫缺陷小鼠，體重20-22克，4-6周齡，用注射器抽取0.3毫升細胞懸液接種于小鼠側部，每種細胞各接種15只。觀察與測量接種細胞后，每周觀察腫瘤的出現情況，以及腫瘤體積的變化，照相。
實例總結(1)本表達載體構建技術有效地構建了能表達hTERT基因的反轉錄病毒載體pGRN145質粒經Hpa I和Not I限制性內切酶酶切，瓊脂凝膠電泳分離提純得到hTERT cDNA片段，與采用相同限制性內切酶酶切的人反轉錄病毒載體pLXSN載體相連，構建成高效表達hTERT的表達載體pLXSN-hTERT。
(2)pLXSN-hTERT轉導的人骨髓間充質干細胞具有高效表達hTERT的優勢經本轉導技術轉導的人骨髓間充質干細胞具有顯著的表達hTERT能力。轉導的人骨髓間充質干細胞中的hTERT基因表達為175±85納克/105個細胞/24小時。
(3)pLXSN-hTERT轉導的人骨髓間充質干細胞有效地提高了細胞的生命周期，在脂肪，軟骨，成骨細胞誘導液的作用下，轉導的人骨髓間充質干細胞能夠向脂肪，軟骨，成骨細胞方向分化。具有同正常人骨髓間充質干細胞的分化潛能。
本發明涉及的序列<110>浙江大學<120>人端粒酶基因轉導骨髓間充質干細胞的方法<160>8<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(25)<223>根據人端粒酶基因序列(GenBank，GI109633030)設計的上游引物序列<400>1ctctccccct tgaacctaat cgttc
<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(20)<223>根據人端粒酶基因序列(GenBank，GI109633030)設計的下游引物序列<400>2aggacacctg gcggaaggag<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(20)<223>根據人β-actin基因序列(GenBank，，GI5016088)設計的上游引物序列<400>3catctcttgc tcgaagtcca<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(25)<223>根據人β-actin基因序列(GenBank，GI5016088)設計的下游引物序列<400>4atcatgtttg agaccttcaa ca
權利要求
1.一種人端粒酶基因轉導骨髓間充質干細胞的方法，其特征是通過以下方案實現(1)構建pLXSN-hTERT重組表達載體，將pGRN145質粒用Hpa I和NotI限制性內切酶酶切，經瓊脂凝膠電泳分離提純得到hTERT cDNA片段，并與采用相同限制性內切酶酶切的pLXSN載體相連，構建成pLXSN-hTERT重組表達載體；(2)構建高效表達外源hTERT基因的人骨髓間充質干細胞，依據LipofectAMINE脂質體轉導試劑盒指導說明書，通過兼噬性包裝細胞系PA317制備pLXSN-hTERT重組表達載體懸浮液后，在1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物輔助下對人骨髓間充質干細胞進行8小時的pLXSN-hTERT表達載體轉導，構建高效表達外源hTERT基因的人骨髓間充質干細胞；(3)采用低濃度的潮霉素進行雙重篩選轉導外源hTERT基因的人骨髓間充質干細胞。
2.根據權利要求1所述的人端粒酶基因轉導骨髓間充質干細胞的方法，其特征是步驟(1)所述的pLXSN載體是采用Hpa I和Not I限制性內切酶酶切，經瓊脂凝膠電泳分離提純得到。
3.根據權利要求1所述的人端粒酶基因轉導骨髓間充質干細胞的方法，其特征是步驟(3)所述的潮霉素的濃度選用20微克/毫升和50微克/毫升。
全文摘要
本發明提供一種人端粒酶基因轉導骨髓間充質干細胞的方法將pGRN145質粒用Hpa I和Not I限制性內切酶酶切，得到hTERT cDNA片段，并與采用相同限制性內切酶酶切的pLXSN載體相連，構建pLXSN－hTERT重組表達載體；用LipofectAMINE脂質體轉導試劑盒通過兼噬性包裝細胞系PA317制備pLXSN－hTERT重組表達載體懸浮液后，對人骨髓間充質干細胞進行轉導，構建高效表達外源hTERT基因的人骨髓間充質干細胞；用低濃度的潮霉素進行雙重篩選人骨髓間充質干細胞。本發明對人骨髓間充質干細胞轉導人端粒酶基因，提高細胞中這種蛋白的表達水平，達到提高骨髓間充質干細胞的生命周期的目的。
文檔編號C12N15/52GK101063150SQ200710068218
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月24日 優先權日2007年4月24日
發明者王金福, 黃國平 申請人:浙江大學