間充質干細胞的成骨分化的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種使用細胞外小泡用于誘導和/或促進成骨分化的方法及其用途。
【專利說明】間充質干細胞的成骨分化

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種誘導或促進細胞分化的方法，用于在誘導或促進所述分化中使用的細胞外小泡，所述小泡的用途以及一種使用所述小泡的治療方法。

【背景技術】
[0002]在植入物表面處或在損傷部位處的早期骨形成的機制以及影響骨-植入物接觸、穩定性和功能的維持的因素未得到完全理解。炎性細胞和干細胞與祖細胞在植入物的表面上通訊的途徑的增加的知識對于理解應該如何優化下一代用于臨床使用的植入物而言是重要的。伴隨更多的知識，在將來，我們將有希望能夠生產用于改進的骨整合的新的且更好的植入物或用于骨愈合的更好的藥物。
[0003]單核細胞/巨噬細胞系統在宿主防御、傷口愈合以及生物材料表面處的免疫調控上發揮核心作用。單核細胞和間充質干細胞迅速迀移至植入的材料表面并且在細胞外基質沉積和骨形成之前被定位成彼此靠近。已經顯示，來自人類單核細胞，包含例如促炎細胞因子的條件培養基促進人類間充質干細胞(hMSC)的成骨分化。單核細胞如何與MSC通訊未被完全確定，盡管已經提議它們在不存在直接的細胞間接觸的情況下通訊。
[0004]細胞外小泡(EV)(包括外體)在細胞間通訊中發揮重要作用。細胞間通訊的一種提議的普遍機理涉及經由外體傳遞而遞送RNA，很可能發生在微環境中但是潛在地還可能發生在遠處。外體是內吞起源的小膜泡(40-100nm)，當多泡體與質膜融合時，其被釋放進細胞外環境中。外體提供了一種細胞之間的通訊方式，其中一個細胞可以釋放在微環境中或在一段距離上可以影響其他細胞的外體。外體釋放自許多細胞并且其功能取決于細胞起源以及給予外體其特征性組成的產生細胞的情況。例如，起源自暴露于氧化應激的細胞的外體顯示出賦予對抗受體細胞中的應激的保護性信息。
[0005]然而，對EV是否及如何影響受體細胞的分化所知甚少。


【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種用于誘導和/或促進細胞的成骨分化的方法，優選是間充質干細胞，更優選是人類間充質干細胞(hMSC)。本發明還涉及細胞外小泡用于增加骨再生及用于支持植入物的骨整合的用途。
[0007]在一個第一方面中，本發明涉及一種誘導和/或促進靶標干細胞的成骨分化的方法，該方法包括:
[0008]a.提供來自非靶標細胞的細胞培養物的條件培養基或分離自非靶標細胞的細胞外小泡；并且
[0009]b.將該培養基或這些細胞外小泡添加至這些靶標干細胞中。
[0010]在一個第二方面中，本發明涉及用于在靶標干細胞的成骨分化中使用的分離的細胞外小泡。
[0011]在一個第三方面中，本發明涉及一種培養基，該培養基包括由非靶標細胞獲得的用于在靶標干細胞的成骨分化中使用的細胞外小泡。
[0012]在一個第四方面中，本發明涉及一種植入物表面，該表面包括一種暴露于細胞外小泡的涂層。
[0013]在一個第五方面中，本發明涉及一種植入物表面，該表面包括一種固定的經刺激的單核細胞、巨噬細胞或間充質干細胞的涂層，這些細胞能夠產生外體。
[0014]在一個第六方面中，本發明涉及一種治療患者的方法，該方法包括從該患者收集血液或組織樣品，分離非靶標細胞，培養并刺激這些非靶標細胞，分離由這些非靶標細胞產生的外體并且將這些外體給予至該患者。
[0015]在一個第七方面中，本發明涉及分離的細胞外小泡用于治療骨損傷、骨質疏松、骨發生或在骨固定中的用途。
[0016]在一個第八方面中，本發明涉及一種組合物，該組合物包括用于治療骨損傷、骨空隙、骨質疏松或骨發生的分離的細胞外小泡。
[0017]在一個第九方面中，本發明涉及一種骨空隙填充物，該填充物包括分離的細胞外小泡。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1.從人類單核細胞細胞系HMC-1的條件培養基分離的并且經針對⑶63免疫金標記的外體的透射電鏡術圖片。
[0019]圖2.與抗-CD63乳膠珠粒軛合的從單核細胞衍生的外體的流式細胞術分析。將外體針對四次跨膜蛋白CD9、CD63和CD81 (右圖)以及同型匹配的對照(左圖)進行免疫染色。
[0020]圖3.從單核細胞外體及其供體細胞提取的蛋白質的蛋白質印跡分析。
[0021]圖4.對來自單核細胞的外體的和細胞的總RNA和小RNA進行檢測。電泳圖譜披露了(a)單核細胞外體和細胞(b)中的總RNA以及外體(c)和細胞⑷中的小RNA的核苷酸大小分布(nt)和熒光強度(FU)。
[0022]圖5.將流式細胞術分析(與用于單核細胞外體的類似)應用于從間充質干細胞中檢測外體。數據顯示間充質干細胞釋放對于⑶9、⑶63和⑶81呈陽性的外體。
[0023]圖6.MSC外體的納米顆粒跟蹤分析。
[0024]圖7.用針對⑶63的免疫金標記的MSC外體的透射電鏡術圖片(條20nm)。
[0025]圖8.電泳圖譜披露了 MSC和分離自MSC培養物的外體的總RNA的核苷酸大小分布(nt)和熒光強度(FU) ?
[0026]圖9.MSC外體向單核細胞的轉移
[0027]將MSC外體分離，用一種綠色熒光染料(PKH67，西格瑪(SIGMA))標記并且添加至培養物中的單核細胞里。24h后，通過(a)流式細胞儀和(b)熒光顯微鏡對標記的小泡的攝取進行分析。對照；PKH6染色的PBS。將DAPI用于細胞核染色。綠色細胞是對綠色外體呈陽性的單核細胞，顯示它們已經攝取外體或附接至其表面的外體。
[0028]圖10.MSC外體向MSC的轉移與圖9中的類似，將MSC外體分離，用一種綠色熒光染料(PKH67，西格瑪)標記并且添加至MSC培養物中。24h后，通過(a)流式細胞儀和(b)熒光顯微鏡對攝取進行分析。對照；PKH6染色的PBS。將DAPI用于細胞核染色。綠色細胞是對綠色外體呈陽性的MSC，顯示它們已經攝取外體或附接至其表面的外體。
[0029]圖11.將釋放自用LPS刺激的單核細胞/巨噬細胞的外體分離，用一種綠色熒光染料(PKH67，西格瑪)標記并且添加至培養中的MSC里。將MSC在綠色外體的存在下培養大約72h，然后通過流式細胞儀(a)在熒光顯微鏡(b)中對細胞進行分析。將DAPI用于細胞核染色。綠色細胞是對綠色外體呈陽性的MSC，顯示它們已經攝取外體或附接至其表面的外體。來自單核細胞/巨噬細胞的外體被攝取/附接至間充質干細胞。
[0030]圖12.在hMSC中培養72h的Runx2和BMP-2在非條件對照培養基(對照)、在單核細胞條件培養基(CM)或在補充有外體的培養基(外體)中的基因表達。

【具體實施方式】
[0031]在本發明中，術語“一個靶標干細胞”或“多個靶標干細胞”意指有待被條件培養基或來自非靶標細胞的額外的細胞小泡誘導成骨分化的一個細胞或多個細胞。
[0032]術語“條件培養基”意指在已經除去培養的細胞后用于細胞培養的培養基。
[0033]通常將至細胞的信號傳導認為是以可溶態呈現的和/或表面上的分子的作用，是與細胞的質膜或基質相關的。本發明涉及由細胞來源的，大約20-400nm或50_200nm，包含例如蛋白質、mRNA和微小RNA的細胞外小泡介導的細胞間通訊。這些小泡附接至、融合至靶標細胞或被靶標細胞內化并且在靶標細胞中發揮調控作用。這種通訊可以誘導和/或促進細胞(例如干細胞，尤其是人類間充質干細胞)的成骨分化。
[0034]諸位發明人已經開發了一種誘導和/或促進靶標細胞的成骨分化的方法。該方法包括提供來自非靶標細胞的細胞培養物的條件培養基或釋放自非靶標細胞的分離的細胞外小泡。在一個實施例中，這些細胞外小泡是外體。這些額外的細胞小泡是通過培養非靶標細胞，任選地在非靶標細胞的刺激以釋放所述小泡以及條件培養基或小泡的分離的過程中提供。可以將這些非靶標細胞培養不同時間，例如I小時或更久、或I天或更久、或2天或更久、或3天或更久。將該培養基或這些小泡添加至或接觸可以是干細胞的靶標細胞。然后，這些小泡被誘導和/或促進成骨分化的靶標細胞攝取或附接其上。
[0035]這些靶標細胞可以是任何適合的細胞類型或細胞系，但是也可以是祖細胞或干細胞。這些細胞可以例如是成骨細胞、破骨細胞、肥大細胞、肌細胞、脂肪細胞或間充質干細胞(MSC)(例如人類MSC)。
[0036]據諸位發明人所知，沒有描述經由細胞外體或具有類似特性的其他細胞外小泡的細胞之間的相互作用(cross-talk)的公開案，這些細胞是例如炎性細胞和靶標細胞(例如間充質干細胞)，該相互作用用于誘導和/或促進成骨分化。諸位發明人已經發現，細胞(如炎性細胞)向其他細胞(如間充質干細胞)發送信息，導致骨分化基因在受體細胞(例如干細胞)中的增加的表達。這些信息是外體和/或其他細胞外小泡。
[0037]根據本發明的靶標干細胞的成骨分化的誘導和/或促進可以通過刺激除靶標細胞以外的細胞(在此稱為非靶標細胞)而進行。這些刺激的非靶標細胞可以是任何適合的細胞并且可以例如是單核細胞、巨噬細胞、紅細胞、破骨細胞、肥大細胞、成肌細胞、角質形成細胞、脂肪細胞或任何其他炎性細胞或非炎性細胞以及干細胞(例如間充質干細胞)。優選地，這些非靶標細胞是單核細胞、巨噬細胞或干細胞，并且在一個優選實施例中，這些非靶標細胞是人類單核細胞、巨噬細胞或干細胞(例如hMSC)。該方法可以在體內和體外進行。
[0038]不被理論所束縛，這些靶標細胞或非靶標細胞的表型在誘導和/或促進成骨分化的成功中可以發揮一定作用。已知的是，來自具有不同表型的非靶標細胞的EV也具有不同表型和功能。此外，這些靶標細胞的表型可以影響EV是否可以結合至并且將其信息遞送至靶標細胞，并且進一步影響該靶標細胞是否可以被定向在一個特定方向上。在本發明的一個實施例中，這些非靶標細胞是自體的或非自體的。在另一個實施例中，這些靶標細胞是自體的或非自體的。使用自體的益處可以是有限的免疫應答，而來自健康個體或未罹患有待治療的疾病的個體的非自體細胞在其達到再生或愈合過程時可以是有益的。
[0039]能以多種方式刺激這些細胞，例如通過使用一種刺激劑，如脂多糖(LPS)、細胞因子、趨化因子或任何其他刺激物或其組合。刺激劑的量的范圍可以是I至100ng/ml，例如lng/ml或更多、或5ng/ml或更多、或10ng/ml或更多、或20ng/ml或更多、或100ng/ml或更少、或70ng/ml或更少、或50ng/ml或更少、或30ng/ml或更少。在一個實施例中，刺激劑的濃度范圍是I至20ng/ml，在另一個實施例中，該濃度是5至50ng/ml，并且在又另一個實施例中，該濃度是5至15ng/ml。
[0040]不被理論所束縛，認為非靶標細胞(尤其是刺激的非靶標細胞)產生額外的分化刺激細胞小泡(釋放自細胞的膜的小囊，例如外體)，當與靶標干細胞接觸或被其攝取時，這些小泡誘導成骨分化。這些小泡(誘導和/或促進成骨分化小泡)可以分離自來自非靶標細胞中的任一個的條件培養基，這些非靶標細胞是例如單核細胞、巨■細胞、紅細胞、破骨細胞、肥大細胞、脂肪細胞以及干細胞(例如間充質干細胞)。這些小泡可以與其他生物分子(例如生長因子)混合。這些細胞外小泡的大小的范圍可以是20至400nm，例如20nm或更大、或50nm或更大、或80nm或更大、或10nm或更大、或400nm或更小、或300nm或更小、或250nm或更小、或200nm或更小、或150nm或更小。圖1披露了分離自條件培養基的外體。
[0041]在一個實施例中，這些分離的EV是釋放自兩種或更多種不同細胞類型的EV的組合。在另一個實施例中，這些分離的EV是釋放自使用兩種或更多種不同類型的刺激劑刺激的細胞的EV的組合。在又另一個實施例中，這些分離的EV是釋放自兩種或更多種不同細胞類型的EV的組合，其中使用至少一種不同類型的刺激劑對每種細胞類型進行刺激。
[0042]負責分化的細胞因子、生長因子或其他信號物質或物質的組合仍未被完全確定。這些細胞因子、生長因子和其他信號物質也可以用來刺激這些非靶向細胞，以釋放例如具有一種特定表型和/或功能的細胞外小泡。其他信號物質可以例如是激素。潛在的細胞因子是 IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-13、IL-14、 IL-15、 IL-16、 IL-17、 IL-18、 11-19、 IL-20、 IL-21、 IL-22、 IL-23、 IL-24、 IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35 或 IFN-類型，或其組合。潛在的生長因子是BMP、TGF、VEGF、TNF或FGF或其組合。趨化因子的實例將是類型CC、CXC、CX3C 及 XC 中的任一種，例如 CCL 2、CCL 3、CCL 5、CCL 7、CCL 8, CCLlU CCL 13、CCL 17,CCL 22,CCL 24,CCL 26、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5 或其組合。其他信號物質可以例如是激素。
[0043]這些小泡可以進一步包括其他物質，例如其他蛋白質、生長因子(BMP、TGF、VEGF,TNF或FGF或其組合)、mRNA、miRNA或siRNA或其他調控小RNA。
[0044]在一個實施例中，使用脂多糖(LPS)、細胞因子、趨化因子、生長因子(BMP、TGF、VEGF.TNF或FGF或其組合)或任何其他刺激物或其組合刺激這些非靶向細胞，以釋放包含蛋白質、生長因子(BMP、TGF、VEGF, TNF或FGF或其組合)、mRNA, miRNA或siRNA或其他調控小RNA或其組合的額外的細胞小泡。
[0045]在又另一個實施例中，使用脂多糖(LPS)、細胞因子、趨化因子、生長因子(BMP、TGF、VEGF、TNF或FGF或其組合)或任何其他刺激物或其組合刺激這些非靶向細胞，以釋放包含蛋白質、生長因子(BMP、TGF、VEGF, TNF或FGF或其組合)、mRNA, miRNA或siRNA或其他調控小RNA或其組合的額外的細胞小泡。然后，將這些小泡添加至或接觸靶標細胞，這些靶標細胞與脂多糖(LPS)、細胞因子、趨化因子、生長因子或任何其他刺激物或其組合處于組合形式。
[0046]諸位發明人已經證明，MSC和單核細胞兩者都釋放包含RNA的細胞外小泡(圖1-8)，并且諸位發明人還已經證明，靶標MSC攝取釋放的細胞外小泡(圖9-10)。諸位發明人還已經證明，當根據本發明處理hMSC時，成骨分化被促進，如通過RUNX2和BMP-2的增加的基因表達所示例(圖12)。
[0047]可以將這些細胞外小泡與一種例如PBS緩沖液或任何其他鹽水緩沖液或任何其他培養基的細胞培養基(或條件培養基)混合。該培養基可以包含來自多于一種類型的非靶標細胞(例如兩種、三種或四種細胞類型)的小泡。例如，該培養基可以包含來自單核細胞和hMSC，或單核細胞、hMSC和巨噬細胞的小泡的混合物。這些細胞外小泡可以在體外和體內提供給革巴標細胞。
[0048]可以將來自非靶標細胞培養物的條件培養基或分離的細胞外小泡添加至需要骨再生的部位。該條件培養基或這些小泡也可以與靶標細胞一起被遞送。通過將該培養基或這些小泡遞送至靶標細胞定位的部位，成骨分化將得以誘導。可以通過注射或經由遞送運載體的植入進行遞送。與例如合成脂質體相比，細胞外小泡(例如外體)具有導致中度免疫應答或不導致免疫應答的益處。
[0049]將這些細胞外小泡以足夠誘導和/或促進成骨分化的量添加至或接觸靶標細胞。
[0050]此外，可以通過將這些小泡涂層或固定在表面上，例如在植入物的表面上，或作為藥物遞送系統的一部分來將這些小泡提供給干細胞。該植入物表面可以是一種金屬表面(例如鈦或氧化鈦)或一種陶瓷表面(例如磷酸鈣表面)。該藥物遞送系統可以例如是一種將緩慢釋放這些小泡的水凝膠或生物降解材料。該水凝膠可以例如是透明質酸或殼聚糖或聚乙烯醇或其組合。在另一個實施例中，利用用于體內釋放細胞外小泡的細胞涂覆或固定植入物表面。例如，可以用可釋放增加數目的外體的經刺激的單核細胞、巨噬細胞或間充質干細胞涂覆或固定表面，以在植入物部位處誘導和/或促進成骨分化。
[0051]根據本發明的方法還可以用于治療患者。該方法包括
[0052]-使用任何可得的適合技術從人(例如該患者本人)中收集血液或組織樣品；
[0053]-分離非靶標細胞并且培養這些細胞并且任選地刺激這些非靶標細胞，以產生誘導和/或促進細胞外小泡；
[0054]-分離由這些非靶標細胞產生的所述細胞外小泡；并且
[0055]-向該患者給予這些細胞外小泡。
[0056]可以通過任何適合的技術全身地或局部地進行給予，例如通過至需要或想要成骨分化的位置的注射器。
[0057]可以將本發明用作骨外科、植入物外科、骨愈合治療或骨或牙齒固定治療過程中的輔助治療。可以將這些分離的細胞外小泡固定在不同支架和植入物上，例如用于牙科應用(例如牙齒)、髖關節或膝蓋的植入物或任何其他骨植入物。還可以將這些小泡固定在骨固定植入物(例如螺釘或固定板)上。此外，本發明可以用于治療各種骨有關疾病和損傷，例如骨空隙填充材料、骨贅、顱縫早閉、骨關節炎，各種骨病、骨硬化、骨質疏松或骨發生。
[0058]實例
[0059]實例I
[0060]過程的一般描述
[0061]單核細胞的分離與培養:使用磁力分離從人類血液中分離單核細胞并且在不同生物材料上進行培養并且用或不用刺激(例如LPS)。間充質干細胞是通過梯度分離獲得自人類骨髓。72h后，收獲細胞并且從條件培養基中分離外體。
[0062]外體分離與檢測:將使用以下的方法分離外體，該方法是基于重復的離心與過濾步驟以除去細胞碎片、凋亡小體等，隨后超速離心以沉淀外體。還可以使用替代性分離方法。將使用包括電子顯微術以及使用流式細胞術和蛋白質印跡法檢測多種標記物的方法的組合來檢測外體，這些標記物是通常發現于外體上的標記物(例如⑶9、⑶63、⑶81、TsglOl)和應該不存在于外體中的標記物(鈣聯蛋白)。
[0063]外體的mRNA與微小RNA含量:將在來自暴露于不同刺激的單核細胞和MSC的外體上進行微陣列，以評估mRNA與微小RNA含量。
[0064]攝取實驗:將分離的外體用一種熒光染料標記，添加至培養中的MSC里并且在不同時間點后使用熒光顯微術和流式細胞術對攝取進行分析。
[0065]骨發生的評估:使用RT-PCR對組織學染色(馮.科薩法(von Kossa))和骨形成的標記物(骨鈣素，runx2, I型膠原)進行評估。
[0066]材料與方法
[0067]人類單核細胞是通過磁力分離獲得自血沉棕黃層(純度90% -95%，η = 4)。將這些單核細胞用LPS(10ng/ml)處理72h并且將條件培養基(CM)進行收集。對人類脂肪來源的間充質干細胞(MSC)進行培養并且將條件培養基進行收集。將外體通過重復的離心與過濾步驟從CM中分離并且使用流式細胞術進行檢測。對于流式細胞術分析，將外體與抗-⑶63乳膠珠粒進行軛合并且針對四次跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81進行免疫染色。還使用透射電鏡術和納米顆粒跟蹤分析將外體可視化。提取來自不同類型的小泡及其供體細胞的RNA并且使用一個生物分析儀分析大小分布圖案。將hMSC在補充有單核細胞外體的培養基、CM或對照培養基中培養72h。使用實時PCR分析評估成骨分化(Runx2，ΒΜΡ-2，η =4) ο通過dd-Ct方法計算靶標基因表達的相對定量。在單獨的實驗中，將人類單核細胞或hMSC在補充有PKH67染色的小泡的培養基中進行培養并且使用流式細胞術和顯微術對攝取進行檢查。
[0068]結果
[0069]流式細胞術分析揭示，LPS-刺激的單核細胞和MSC釋放對于四次跨膜蛋白CD9、⑶63和⑶81呈陽性的外體，這些四次跨膜蛋白是通常用于外體檢測的標記物，參見圖2和5。
[0070]圖11披露了來自單核細胞/巨噬細胞的外體被攝取/附接至間充質干細胞。與陰性對照相比，在綠色PKH67染色的外體的存在下培養的MSC在FL-1中是陽性的，表明這些外體附接至或與MSC融合或被MSC內化。此外，在補充有PKH67標記的綠色MSC外體的培養基中培養hMSC顯示MSC對該綠色染料呈陽性，說明MSC經由外體與其他MSC通訊，參見圖10。另外，用綠色MSC外體培養單核細胞也揭示，一部分單核細胞已經攝取或內化綠色外體，參見圖9。
[0071]與對照培養基相比，在單核細胞CM或在補充有分離自CM的純外體的培養基中培養hMSC持續72h，導致Runx2 (倍數變化，分別是1.7 ±0.3和1.4±0.2)和BMP-2 (倍數變化，分別是15.4±1.7和2.3±0.3)的顯著增加的表達水平，參見圖12。
[0072]這些結果證明，LPS-刺激的人類單核細胞釋放增強間充質干細胞的成骨分化的因子并且這種作用的至少一部分歸因于經由外體的通訊。
[0073]實例2
[0074]人類初級LPS刺激的單核細胞。培養3天后，分離外體并且提取RNA。對細胞的和外體的總RNA和小RNA進行生物分析器分析。電泳圖譜示出了(圖4) (a)外體和細胞(b)中的總RNA以及外體(c)和細胞⑷中的小RNA的核苷酸大小分布(nt)和熒光強度(FU)。
【權利要求】
1.一種誘導和/或促進靶標細胞的成骨分化的方法，該方法包括: a.提供釋放自非靶標細胞的誘導和/或促進成骨分化分離的細胞外小泡；并且 b.將這些細胞外小泡添加至這些靶標細胞中。
2.如權利要求1所述的方法，其中這些非靶標細胞是刺激的單核細胞、巨噬細胞或間充質干細胞或其他炎性或非炎性細胞。
3.如權利要求2所述的方法，其中用脂多糖、細胞因子、趨化因子或任何其他刺激物刺激這些非靶標細胞。
4.如權利要求2所述的方法，其中以任何其他方式刺激或修飾這些非靶標細胞，以釋放誘導和/或促進間充質干細胞的成骨分化的細胞外小泡。
5.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中這些細胞外小泡釋放自單核細胞。
6.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中提供的這些小泡是釋放自兩種或更多種不同類型的細胞的小泡的組合，或釋放自使用兩種或更多種不同類型的刺激劑刺激的細胞的小泡的組合，或釋放自兩種或更多種不同細胞類型的EV的組合，其中使用至少一種不同類型的刺激劑刺激每個細胞類型。
7.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中這些細胞外小泡是外體。
8.來自非靶標細胞的分離的誘導和/或促進成骨分化細胞外小泡用于靶標細胞的成骨分化的用途。
9.根據權利要求8所述的小泡，其中這些非靶標細胞是經刺激的單核細胞、巨噬細胞或間充質干細胞或其他炎性或非炎性細胞。
10.根據權利要求9所述的小泡，其中用脂多糖、細胞因子、趨化因子或任何其他刺激物刺激這些非靶標細胞。
11.根據權利要求8至10中任一項所述的小泡，其中這些小泡是外體。
12.根據權利要求8至11中任一項所述的小泡，其中這些小泡懸浮于一種培養基中。
13.—種植入物，該植入物包括一種暴露于誘導和/或促進成骨分化細胞外小泡的涂層O
14.一種植入物，該植入物包括一種固定的經刺激的單核細胞、巨噬細胞或間充質干細胞的涂層，這些細胞能夠產生誘導和/或促進成骨分化細胞外小泡。
15.根據權利要求13或14中任一項所述的植入物，其中該植入物是一種用于牙科應用、髖關節、膝蓋的植入物、螺釘或固定板。
16.根據權利要求8至12中任一項用于治療損傷、骨質疏松、骨發生或在骨固定中的用途。
17.—種組合物，該組合物包括分離的誘導和/或促進成骨分化細胞外小泡，這些細胞外小泡用于治療骨損傷、骨空隙填充材料、骨贅、顱縫早閉、骨關節炎、各種骨病、骨質疏松或骨發生。
18.—種骨空隙填充物，該骨空隙填充物包括分離的誘導和/或促進成骨分化細胞外小泡。
19.根據權利要求18所述的骨空隙填充物，進一步包括靶向干細胞。
20.一種治療患者的方法，該方法包括從該患者收集血液或組織樣品，分離非革E標細胞，培養并刺激這些非靶標細胞，分離由這些非靶標細胞產生的細胞外小泡并且將這些細 胞外小泡給予至該患者。
【文檔編號】A61K35/28GK104487569SQ201380028009
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年5月10日 優先權日:2012年5月10日
【發明者】卡琳·埃克斯特倫, 彼得·湯姆森, 尤卡·勞斯馬, 歐瑪·歐瑪, 王曉勤 申請人:生物材料細胞公司