專(zhuān)利名稱(chēng)：亞細(xì)胞器靶向殼寡糖－脂肪酸嫁接物及制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬化合物的合成方法，涉及殼寡糖-脂肪酸嫁接物的制備，以及多疏水性?xún)?nèi)核殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)的制備和該嫁接物膠團(tuán)作為納米級(jí)膠團(tuán)微粒載體在生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，聚合物膠團(tuán)在藥物制劑學(xué)、生物醫(yī)學(xué)及高分子領(lǐng)域已經(jīng)引起了人們廣泛的重視。聚合物膠團(tuán)是由兩親性的嵌段或接枝共聚物在水性介質(zhì)中自聚形成，具有核-殼結(jié)構(gòu)。其疏水性鏈段構(gòu)成膠團(tuán)的內(nèi)核，親水性鏈段形成膠團(tuán)的外殼。疏水核可為難溶性藥物提供儲(chǔ)庫(kù)的作用；親水性外膜保持膠團(tuán)在水性環(huán)境中的穩(wěn)定性，并可進(jìn)行理化性質(zhì)修飾以達(dá)到特定的目的，如膠團(tuán)的主動(dòng)靶向等。
聚合物膠團(tuán)作為一種藥物傳輸系統(tǒng)，有許多優(yōu)勢(shì)通過(guò)調(diào)整材料的溶解性、pH值、Zeta電位等可以控制藥物在生物體內(nèi)的釋放；由于膠團(tuán)粒徑很小，故可穿過(guò)血腦屏障，也可促進(jìn)腸胃黏膜等的良好吸收，到達(dá)大尺寸粒子無(wú)法通過(guò)的部位，達(dá)到被動(dòng)靶向的目的；聚合物膠團(tuán)骨架對(duì)藥物的保護(hù)和屏蔽作用，可在一定程度上避免藥物的分解，保持藥物的穩(wěn)定性，降低藥物的毒性；與脂質(zhì)體相比，聚合物膠團(tuán)的載藥量較高；聚合物材料的多樣性，使得以聚合物為載體的藥物制劑亦多樣化，能滿(mǎn)足各種使用需求。
聚合物膠團(tuán)主要用作難溶性藥物，特別是抗腫瘤藥物的載體。由于聚合物膠團(tuán)的粒徑一般小于100nm，可通過(guò)“增強(qiáng)的透過(guò)及滯留效應(yīng)”(enhancedpermeability and retention effect)聚集于腫瘤部位。
殼聚糖是一類(lèi)由氨基葡萄糖組成的陽(yáng)離子聚合物，具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性。殼聚糖被廣泛應(yīng)用于藥物輔料、止血材料、組織工程支架等。雖然以殼聚糖為基本材料所制備的微粒、納米粒、以及一些疏水改性殼聚糖的聚合物膠團(tuán)，已廣泛應(yīng)用于藥物載體材料的研究，但由于載體表面殼聚糖本身的親水性結(jié)構(gòu)，所以現(xiàn)有以殼聚糖為基本組成的載體難以被細(xì)胞所攝取，從而最終影響藥物的靶向治療效果。同時(shí)，由于殼聚糖的高分子量，高粘性以及在生理pH條件下不溶等缺點(diǎn)，增加了殼聚糖微粒和納米粒的制備難度，以及限制了疏水改性殼聚糖膠團(tuán)的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的，是提供殼寡糖-脂肪酸嫁接物，其具有代表性的結(jié)構(gòu)通式為 其中R為烷基鏈，其碳鏈數(shù)目為12～22；n，x，y為聚合度；殼寡糖的分子量為1～100kDa，脫乙酰度為70-100％；殼寡糖鏈上的部分自由氨基被烷基取代，氨基取代度為1～90％。
本發(fā)明的第二個(gè)目的，是提供殼寡糖-脂肪酸嫁接物的合成方法，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)(1)低分子量殼聚糖(殼寡糖)的制備取市售殼聚糖(70～100％脫乙酰度)，在55℃和pH5.0條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶，降解殼聚糖。以粘度法控制殼聚糖的降解程度。所得殼聚糖的降解液，經(jīng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，按照使用要求，分別從分子量3kDa、10kDa、30kDa，50kDa的超濾膜中，選擇合適的超濾膜超濾分級(jí)，超濾液冷凍干燥，得脫乙酰度為70-100％、不同分子量的低分子量殼聚糖(優(yōu)選殼寡糖分子量為1～100kDa)。以凝膠滲透色譜法測(cè)定殼寡糖的分子量。
(2)殼寡糖-脂肪酸嫁接物制備本發(fā)明以碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為耦合劑，通過(guò)殼寡糖上的氨基和脂肪酸的羧基之間的化學(xué)反應(yīng)，制備殼寡糖-脂肪酸嫁接物。具體合成方法為取0.001M殼寡糖水溶液100ml，加入N-羥基琥珀酰亞胺(殼寡糖與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1∶10～1∶1000)溶解后，在室溫和磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)；另秤取一定量的脂肪酸(殼寡糖與脂肪酸的摩爾比為1∶2～1∶200)，在40℃的條件下溶于20ml的無(wú)水乙醇后，加入一定量的碳二亞胺(脂肪酸與碳二亞胺的摩爾比為1∶5)，在50℃磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)。在上述兩反應(yīng)液(殼寡糖與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)液與脂肪酸與碳二亞胺的反應(yīng)液)各反應(yīng)1小時(shí)后，將上述兩反應(yīng)液混合，繼續(xù)在室溫、磁力攪拌的條件下反應(yīng)48小時(shí)。終反應(yīng)液經(jīng)透析后，冷凍干燥，干燥產(chǎn)物經(jīng)40℃的無(wú)水乙醇洗滌后，得到殼寡糖-脂肪酸嫁接物。脂肪酸選自癸酸、豆蔻酸、軟脂酸、油酸、硬脂酸、山崳酸等中任一種。
本發(fā)明所制備得到的殼寡糖-脂肪酸嫁接物，具有在水性介質(zhì)中通過(guò)自聚集形成膠團(tuán)的特性，1mg/ml的殼寡糖-脂肪酸嫁接物水溶液，可形成粒徑為5～1000nm、zeta電位為5～80mV的膠團(tuán)。殼寡糖-脂肪酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度位于0.01～0.1mg/ml之間，明顯低于一般表面活性劑的臨界膠團(tuán)濃度。當(dāng)膠團(tuán)遇到體液被稀釋時(shí)，可以繼續(xù)保持膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)，表明殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)適宜作為藥物的載體使用。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供殼寡糖-脂肪酸嫁接物在制備具有快速細(xì)胞攝取和亞細(xì)胞器靶向的殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供殼寡糖-脂肪酸嫁接物在制備具有細(xì)胞漿滯留和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)功能藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)，具有多個(gè)疏水核的特殊空間結(jié)構(gòu)，能被細(xì)胞快速攝取。根據(jù)殼寡糖-脂肪酸嫁接物的組成和疏水核數(shù)目的不同，可分別體現(xiàn)出細(xì)胞漿滯留和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。
本發(fā)明的有益之處是本發(fā)明在前期的研究工作基礎(chǔ)上，利用殼聚糖的降解產(chǎn)物、低分子量殼聚糖(殼寡糖)，進(jìn)行烷基化修飾，通過(guò)對(duì)烷基化修飾殼寡糖(殼寡糖-脂肪酸嫁接物)合成方法的改進(jìn)，合成了一類(lèi)具有特殊結(jié)構(gòu)的殼寡糖-脂肪酸嫁接物。由提供的殼寡糖-脂肪酸嫁接物所形成的嫁接物膠團(tuán)，為一種具有優(yōu)良亞細(xì)胞器靶向的微粒載體，可應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域與制藥領(lǐng)域。利用這種載體，可應(yīng)用于載體本身在細(xì)胞內(nèi)各個(gè)細(xì)胞器的靶向分布研究；探索大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的途徑和機(jī)制；為開(kāi)拓亞細(xì)胞器靶向藥物治療，提供理論與技術(shù)基礎(chǔ)。


圖110.2％氨基取代度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，與A549細(xì)胞共孵育2小時(shí)后的熒光顯微鏡照片。
圖248.6％氨基取代度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，與A549細(xì)胞共孵育2小時(shí)后的熒光顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)例一1、低分子量殼聚糖(殼寡糖)制備取市售分子量為550kDa的殼聚糖(70％脫乙酰度)，在55℃和pH5.0條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶，降解殼聚糖。以粘度法控制殼聚糖的降解程度。所得殼聚糖的降解液，經(jīng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，使用分子量為10kDa和30kDa的超濾膜進(jìn)行超濾分級(jí)。取分子量介于10kDa和30kDa的超濾液冷凍干燥，得脫乙酰度為70％、分子量22.4 kDa的殼寡糖。
2、殼寡糖-脂肪酸嫁接物制備及理化性質(zhì)測(cè)定取上述0.0001mol殼寡糖，溶于100ml蒸餾水中，制備殼寡糖的水溶液，加入0.01mol N-羥基琥珀酰亞胺溶解后，在室溫和磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)；另分別稱(chēng)取0.002mol的脂肪酸(癸酸、硬脂酸和山崳酸)，在40℃的條件下，溶于20ml的無(wú)水乙醇，加入0.01mol的碳二亞胺，在50℃磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)。在上述兩反應(yīng)液各反應(yīng)1小時(shí)后，分別將殼寡糖的反應(yīng)液與脂肪酸的反應(yīng)液混合，繼續(xù)在室溫、磁力攪拌的條件下反應(yīng)48小時(shí)。終反應(yīng)液經(jīng)透析后，冷凍干燥，干燥產(chǎn)物經(jīng)40℃的無(wú)水乙醇洗滌后，分別得到殼寡糖-癸酸嫁接物、殼寡糖-硬脂酸嫁接物和殼寡糖-山崳酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法，測(cè)定所得殼寡糖-脂肪酸嫁接物的氨基取代度。取不同量的殼寡糖(0.5～9mg)，精密稱(chēng)定，分別溶于2ml的蒸餾水中，加入4％(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-脂肪酸嫁接物4mg溶于2ml蒸餾水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-脂肪酸嫁接物的氨基取代度。
采用芘熒光法測(cè)定，殼寡糖-脂肪酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度。取殼寡糖-脂肪酸嫁接物10mg，精密稱(chēng)定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。將1mg/ml的殼寡糖-脂肪酸嫁接物溶液稀釋成不同濃度的殼寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分別加入定量的芘(芘的終濃度為7×10-7mol/L)，水浴超聲(400w，30min)。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠團(tuán)濃度。
采用熒光萃滅法，測(cè)定殼寡糖-脂肪酸嫁接物的疏水核數(shù)目。以氯化十六烷基呲啶(1-Dodecylpyridinium chloride，DPC)為芘的熒光萃滅劑，在包封芘的殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)溶液中，加入定量的DPC溶液，熒光分光光度法測(cè)定DPC加入前后的熒光強(qiáng)度，以熒光萃滅動(dòng)力學(xué)方程(式(1))，計(jì)算疏水核區(qū)所需疏水性材料(脂肪酸)的濃度ln(I0/I)＝[Q]/[M](1)I0和I分別為熒光萃滅劑加入前后的熒光發(fā)射強(qiáng)度；[Q]為熒光萃滅劑的濃度；[M]為形成單個(gè)疏水核區(qū)所需脂肪酸的濃度。
單個(gè)殼寡糖-硬脂酸嫁接物分子的疏水核區(qū)數(shù)量n照下式計(jì)算n＝[脂肪酸]/[M](2)另取殼寡糖-脂肪酸嫁接物10mg，精密稱(chēng)定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制備1mg/ml的殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)溶液。Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑及Zeta電位。
經(jīng)測(cè)定，殼寡糖-癸酸嫁接物、殼寡糖-硬脂酸嫁接物和殼寡糖-山崳酸嫁接物的理化性質(zhì)見(jiàn)表1。
表1殼寡糖-癸酸嫁接物、殼寡糖-硬脂酸嫁接物和殼寡糖-山崳酸嫁接物的理化性質(zhì)

實(shí)例二1、低分子量殼聚糖(殼寡糖)制備取市售分子量為450kDa的殼聚糖(90％脫乙酰度)，在55℃和pH5.0條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶，降解殼聚糖。以粘度法控制殼聚糖的降解程度。所得殼聚糖的降解液，經(jīng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，使用分子量為3kDa、10kDa、30kDa，50kDa的超濾膜進(jìn)行超濾分級(jí)。分級(jí)后的超濾液冷凍干燥，得脫乙酰度為90％、分子量分別為1.0kDa，22.2 kDa，33.4kDa，54.6kda和101.2kDa的殼寡糖。
2、殼寡糖-硬脂酸嫁接物制備及理化性質(zhì)測(cè)定分別取上述0.0001mol殼寡糖溶于100ml蒸餾水中，制備殼寡糖水溶液，加入0.01mol N-羥基琥珀酰亞胺溶解后，在室溫和磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)；另秤取0.002mol的硬脂酸，在40℃的條件下溶于20ml的無(wú)水乙醇后，加入0.01mol的碳二亞胺，在50℃磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)。在上述兩反應(yīng)液各反應(yīng)1小時(shí)后，分別將殼寡糖的反應(yīng)液與脂肪酸的反應(yīng)液混合，繼續(xù)在室溫、磁力攪拌的條件下反應(yīng)48小時(shí)。終反應(yīng)液經(jīng)透析后，冷凍干燥，干燥產(chǎn)物經(jīng)40℃的無(wú)水乙醇洗滌后，分別得到不同分子量殼寡糖的殼寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法，測(cè)定所得殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量的殼寡糖(0.5～9mg)，精密稱(chēng)定，分別溶于2ml的蒸餾水中，加入4％(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2ml蒸餾水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。
采用芘熒光法，測(cè)定殼寡糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度。取殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱(chēng)定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。將1mg/ml的殼寡糖-硬脂酸嫁接物溶液，稀釋成不同濃度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物溶液各10mL，分別加入定量的芘(芘的終濃度為7×10-7mol/L)，水浴超聲(400w，30min)。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠團(tuán)濃度。
采用熒光萃滅法，測(cè)定殼寡糖-硬脂酸嫁接物的疏水核數(shù)目。以氯化十六烷基呲啶(1-Dodecylpyridinium chloride，DPC)為芘的熒光萃滅劑，在包封芘的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液中，加入定量的DPC溶液，熒光分光光度法測(cè)定DPC加入前后的熒光強(qiáng)度，運(yùn)用熒光萃滅動(dòng)力學(xué)方程(式(1))，計(jì)算疏水核區(qū)所需疏水性材料(硬脂酸)的濃度。單個(gè)殼寡糖-硬脂酸嫁接物分子的疏水核區(qū)數(shù)量n照(2)式計(jì)算。
另取殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱(chēng)定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制備1mg/ml的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液。Zetasizer 3000HS分析儀，分別測(cè)定殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑及Zeta電位。
經(jīng)測(cè)定，不同殼寡糖分子量的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性質(zhì)見(jiàn)表2。
表2不同殼寡糖分子量的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性質(zhì)


實(shí)例三1、低分子量殼聚糖(殼寡糖)制備取市售分子量為750kDa的殼聚糖(100％脫乙酰度)，在55℃和pH5.0條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶，降解殼聚糖。以粘度法控制殼聚糖的降解程度。所得殼聚糖的降解液，經(jīng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，使用分子量為10kDa和30kDa的超濾膜進(jìn)行超濾分級(jí)。分級(jí)后的超濾液冷凍干燥，得脫乙酰度為100％、分子量為25.8kDa的殼寡糖。
2、殼寡糖-硬脂酸嫁接物制備及理化性質(zhì)測(cè)定取上述0.0001mol殼寡糖，溶于100ml蒸餾水中，制備殼寡糖的水溶液，加入0.01mol N-羥基琥珀酰亞胺，溶解后，在室溫和磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)；另稱(chēng)取0.002mol的硬脂酸，在40℃的條件下溶于20ml的無(wú)水乙醇后，加入0.01mol的碳二亞胺，在50℃磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)。在上述兩反應(yīng)液各反應(yīng)1小時(shí)后，分別將殼寡糖的反應(yīng)液與脂肪酸的反應(yīng)液混合，繼續(xù)在室溫、磁力攪拌的條件下反應(yīng)48小時(shí)。終反應(yīng)液經(jīng)透析后，冷凍干燥，干燥產(chǎn)物經(jīng)40℃的無(wú)水乙醇洗滌后，得到脫乙酰度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法，測(cè)定所得殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量殼寡糖(0.5～9mg)，精密稱(chēng)定，分別溶于2ml的蒸餾水中，加入4％(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。
采用芘熒光法，測(cè)定殼寡糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度。取殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱(chēng)定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。將1mg/ml的殼寡糖-硬脂酸嫁接物溶液，稀釋成不同濃度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物溶液各10mL，分別加入定量的芘(芘的終濃度為7×10-7mol/L)，水浴超聲(400w，30min)。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠團(tuán)濃度。
采用熒光萃滅法，測(cè)定殼寡糖-硬脂酸嫁接物的疏水核數(shù)目。以氯化十六烷基呲啶(1-Dodecylpyridinium chloride，DPC)為芘的熒光萃滅劑，在負(fù)載芘的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液中，加入定量的DPC溶液，熒光分光光度法測(cè)定DPC加入前后的熒光強(qiáng)度，運(yùn)用熒光萃滅動(dòng)力學(xué)方程(式(1))，計(jì)算疏水核區(qū)所需疏水性材料(硬脂酸)的濃度。單個(gè)殼寡糖-硬脂酸嫁接物分子的疏水核區(qū)數(shù)量n照(2)式計(jì)算。
另取殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱(chēng)定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制備1mg/ml的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液。Zetasizer 3000HS分析儀，分別測(cè)定殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑及Zeta電位。
經(jīng)測(cè)定，脫乙酰度為100％的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性質(zhì)見(jiàn)表3。
表3脫乙酰度為100％的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性質(zhì)

實(shí)例四1、低分子量殼聚糖(殼寡糖)制備取市售分子量為450kDa的殼聚糖(90％脫乙酰度)，在55℃和pH5.0條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶，降解殼聚糖。以粘度法控制殼聚糖的降解程度。所得殼聚糖的降解液，經(jīng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，使用分子量為10kDa和30kDa的超濾膜進(jìn)行超濾分級(jí)。取分子量介于10kDa和30kDa的超濾液冷凍干燥，得脫乙酰度為90％、分子量19.2kDa的殼寡糖。
2、殼寡糖-硬脂酸嫁接物制備及理化性質(zhì)測(cè)定殼寡糖-硬脂酸嫁接物制備投料比見(jiàn)表4。
表4殼寡糖-硬脂酸嫁接物制備投料比

取上述定量殼寡糖，溶于100ml蒸餾水中，制備殼寡糖的水溶液，加入定量的N-羥基琥珀酰亞胺，溶解后，在室溫和磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)；另稱(chēng)取定量的硬脂酸，在40℃的條件下分別溶于20ml的無(wú)水乙醇后，分別加入定量的碳二亞胺，在50℃磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)。在上述兩反應(yīng)液各反應(yīng)1小時(shí)后，分別將殼寡糖的反應(yīng)液與脂肪酸的反應(yīng)液混合，繼續(xù)在室溫、磁力攪拌的條件下反應(yīng)48小時(shí)。終反應(yīng)液經(jīng)透析后，冷凍干燥，干燥產(chǎn)物經(jīng)40℃的無(wú)水乙醇洗滌后，分別得到不同氨基取代度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法，測(cè)定所得殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量殼寡糖(0.5～9mg)，精密稱(chēng)定，分別溶于2ml的蒸餾水中，加入4％(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。
采用芘熒光法，測(cè)定殼寡糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度。取殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱(chēng)定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。將1mg/ml的殼寡糖-硬脂酸嫁接物溶液，稀釋成不同濃度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物溶液各10mL，分別加入定量的芘(芘的終濃度為7×10-7mol/L)，水浴超聲(400w，30min)。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠團(tuán)濃度。
采用熒光萃滅法，測(cè)定殼寡糖-硬脂酸嫁接物的疏水核數(shù)目。以氯化十六烷基呲啶(1-Dodecylpyridinium chloride，DPC)為芘的熒光萃滅劑，在包封芘的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液中，加入定量的DPC溶液，熒光分光光度法測(cè)定DPC加入前后的熒光強(qiáng)度，運(yùn)用熒光萃滅動(dòng)力學(xué)方程(式(1))，計(jì)算疏水核區(qū)所需疏水性材料(硬脂酸)的濃度。單個(gè)殼寡糖-硬脂酸嫁接物分子的疏水核區(qū)數(shù)量n照(2)式計(jì)算。
另取殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱(chēng)定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制備1mg/ml的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液。Zetasizer 3000HS分析儀，分別測(cè)定殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑及Zeta電位。
經(jīng)測(cè)定，不同硬脂酸投料比的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性質(zhì)見(jiàn)表5。
表5不同硬脂酸投料比的殼寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性質(zhì)

3、殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)細(xì)胞攝取取0.1g異硫氰基熒光素和0.5g殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱(chēng)定后分別溶解于60％乙醇溶液中。在冰浴、避光與磁力攪拌(400rpm)條件下，將殼寡糖-硬脂酸嫁接物乙醇溶液，滴加到異硫氰基熒光素溶液中，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)10h。終反應(yīng)液置透析袋，重蒸水透析24h，除去未反應(yīng)異硫氰基熒光素。透析液冷凍干燥，得異硫氰基熒光素標(biāo)記殼寡糖-硬脂酸嫁接物。
取異硫氰基熒光素標(biāo)記殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密稱(chēng)定。加適量重蒸水，水浴超聲10min分散，定容至1000ml，得異硫氰基熒光素標(biāo)記殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液。
以人II型肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞為模型細(xì)胞，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞至呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，離心收集，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種24孔培養(yǎng)板，孵箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)液中加入異硫氰基熒光素標(biāo)記殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液孵育。膠團(tuán)濃度控制為100μg/ml。培養(yǎng)一定時(shí)間后，用熒光倒置顯微鏡觀察。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)能快速被細(xì)胞所攝取，并根據(jù)嫁接物的氨基取代度的不同，分別體現(xiàn)出細(xì)胞漿滯留和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。圖1和圖2分別為氨基取代度為10.2％和48.6％的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，與A549細(xì)胞共孵育2小時(shí)后的熒光顯微鏡照片。參見(jiàn)圖1和圖2，氨基取代度分別為10.2％和48.6％的殼寡糖-硬脂酸嫁接物與A549細(xì)胞共孵育2小時(shí)后，分別體現(xiàn)出細(xì)胞漿滯留和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。圖1為10.2％氨基取代度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，與A549細(xì)胞共孵育2小時(shí)后的熒光顯微鏡照片，其中A圖為異硫氰基熒光素標(biāo)記聚合物膠團(tuán)熒光照片，B圖為核染對(duì)照照片。圖2為48.6％氨基取代度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，與A549細(xì)胞共孵育2小時(shí)后的熒光顯微鏡照片，其中A圖為異硫氰基熒光素標(biāo)記聚合物膠團(tuán)熒光照片，B圖為核染對(duì)照照片。
權(quán)利要求
1.一種殼寡糖-脂肪酸嫁接物，其具有代表性的結(jié)構(gòu)通式為 其中R為烷基鏈，其碳鏈數(shù)目為12～22，n，x，y為聚合度，殼寡糖的分子量為1～100kDa，脫乙酰度為70-100％，殼寡糖鏈上的部分自由氨基被烷基取代，氨基取代度為1～90％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖-脂肪酸嫁接物的合成方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)低分子量殼寡糖的制備取市售高分子量的殼聚糖，70～100％脫乙酰度，在55℃和pH5.0條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，纖維素酶與殼聚糖比例按重量百分比0.5∶100加入纖維素酶，降解殼聚糖，以粘度法控制殼聚糖的降解程度，所得殼聚糖的降解液，經(jīng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，按照使用要求，分別從分子量3kDa、10kDa、30kDa，50kDa的超濾膜中，選擇合適的超濾膜超濾分級(jí)，超濾液冷凍干燥，選用殼寡糖分子量為1～100kDa、脫乙酰度為70-100％的低分子量殼聚糖，以凝膠滲透色譜法測(cè)定殼寡糖的分子量；(2)殼寡糖-脂肪酸嫁接物的制備取上述0.001 M殼寡糖水溶液100ml，加入N-羥基琥珀酰亞胺，殼寡糖與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1∶10～1∶1000，溶解后，在室溫和磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)；另稱(chēng)取脂肪酸，殼寡糖與脂肪酸的摩爾比為1∶2～1∶200，在40℃的條件下溶于20ml的無(wú)水乙醇后，加入碳二亞胺，脂肪酸與碳二亞胺的摩爾比為1∶5，在50℃磁力攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)；在上述兩反應(yīng)液各反應(yīng)1小時(shí)后，將上述兩反應(yīng)液混合，繼續(xù)在室溫、磁力攪拌的條件下反應(yīng)48小時(shí)，經(jīng)透析后，冷凍干燥，干燥產(chǎn)物經(jīng)40℃的無(wú)水乙醇洗滌后，得到殼寡糖-脂肪酸嫁接物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼寡糖-脂肪酸嫁接物的合成方法，其特征是1mg/ml的殼寡糖-脂肪酸嫁接物水溶液形成粒徑為5～1000nm、zeta電位為5～80mV的膠團(tuán)，殼寡糖-脂肪酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度位于0.01～0.1mg/ml之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼寡糖-脂肪酸嫁接物的合成方法，其特征是所形成的殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)具有多個(gè)疏水核的特殊空間結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖-脂肪酸嫁接物在制備具有快速細(xì)胞攝取和亞細(xì)胞器靶向的殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖-脂肪酸嫁接物在制備具有細(xì)胞漿滯留和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)功能藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供殼寡糖－脂肪酸嫁接物，其具有代表性的結(jié)構(gòu)通式為右式，其中R為烷基鏈，碳鏈數(shù)為12～22；n，x，y為聚合度；殼寡糖的分子量為1～100kDa，脫乙酰度為70－100％；殼寡糖鏈上的部分自由氨基被烷基取代，取代度為1～90％。通過(guò)利用殼聚糖的降解產(chǎn)物、低分子量殼聚糖(殼寡糖)，進(jìn)行烷基化修飾，通過(guò)對(duì)烷基化修飾殼寡糖合成方法的改進(jìn)，合成了具有特殊結(jié)構(gòu)的殼寡糖－脂肪酸嫁接物。該嫁接物所形成的嫁接物膠團(tuán)，是一種具有優(yōu)良亞細(xì)胞器靶向的微粒載體，可應(yīng)用于載體本身在細(xì)胞內(nèi)各個(gè)細(xì)胞器的靶向分布研究；探索大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的途徑和機(jī)制；為開(kāi)拓亞細(xì)胞器靶向藥物的制備，提供理論與技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101081876SQ20071006911
公開(kāi)日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2007年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日
發(fā)明者胡富強(qiáng), 杜永忠, 袁弘, 游劍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)