專利名稱：：一種培育低咖啡因茶樹的方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，涉及一種轉基因培育低咖啡因茶樹的方法。
背景技術：
：茶葉具有良好的保健功能，其中主要功能成分是茶多酚(兒茶素類化合物)。但茶葉中同時含3-5%的咖啡因。咖啡因是一種嘌呤生物堿，化學名稱為1,3，7-三甲基黃嘌呤。盡管咖啡因對人體的長期影響尚不明確，但其短期副作用已越來越受到人們的重視，這些副作用包括引起心悸、胃腸失調、焦慮、震顫、.血壓升高和失眠等。通常一杯咖啡(150ml)含咖啡因50-70mg，一杯茶(150ml)含咖啡因40~80mg，而對咖啡因敏感的人攝取10mg就會引起不適癥狀。所以，低咖啡因的茶葉日益受到消費者的歡迎。利用工業方法生產低咖啡因茶，不僅成本過高，而且導致滋味和香氣的損失。因此，研究生物技術和育種途徑培育低咖啡因茶樹用于生產低咖啡因茶產品具有重要意義和商業前景。目前培育低咖啡因茶樹的方法，主要是從現有的茶樹品種資源中進行篩選，但由于現有茶樹資源有限以及已經發現的個別低咖啡因茶樹由于生長緩慢、產量低或感官品質沒有達到生產的要求。所以至今還沒有低咖啡因茶樹品種在生產上推廣應用。
發明內容針對現有技術中存在的不足之處，本發明的目的是利用現有的高產優質茶樹品種，通過轉基因手段，抑制與咖啡因生物合成相關的基因的表達，從而降低茶葉咖啡因的含量。本發明提供一種通過轉基因手段培育低咖啡因茶樹的方法。為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現的第一步茶樹甲基轉移酶(TCS)雙鏈干涉基因表達載體的構建；第二步TCS雙鏈干涉基因遺傳轉化；第三步轉化植株培養。茶樹體內咖啡因的生物合成途徑中最初嘌呤化合物是黃嘌呤核苷，從黃嘌呤核苷生物合成咖啡因的主要途徑是黃嘌呤核苷—7-甲基黃嘌呤核苷—7-甲基黃嘌呤—可可堿—咖啡因。其中第1，3和4步是甲基化反應。甲基化反應需要的甲基供體為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，催化甲基轉移的酶是TCS，即TCS將甲基由SAM轉移給黃嘌呤核苷的1、3、7相應位置上，最后形成咖啡因。TCS基因是控制TCS酶合成及其活力的關鍵因素，通過轉基因手段抑制TCS基因的表達將可以有效地降低TCS酶的活力，進而降低茶葉咖啡因生物合成及其含量。圖1為轉基因茶樹咖啡因含量與對照植株一福鼎大白茶比較圖。其中A、B、C、D為使用本發明方法的轉基因培育植株，FD為對照植株一福鼎大白茶。縱座標的咖啡因含量以每克鮮重(FW)中所含咖啡因量毫克表示。圖2為RT-PCR擴增出TCS基因片段電泳圖。圖中1:DNAmarker(GeneRuler50bpDNAladder,上海生工生物工程有限公司)；2:TCS02;3:TCS03。圖3為Ac/和Swa/雙酶切T-TCS02、T-TCS03(A)和pFGC5941(來自美國俄咳俄州立大學擬南芥生物資源中心)(B)電泳圖。A:泳道1:DNAmarker(GeneRuler50bpDNAladder);泳道2:爿"/和Swa/雙酶切T-TCS02;泳道3:Ac/和Sw"/雙酶切T-TCS02;B:泳道l:質粒pFGC5941;泳道2:Ac/和Swa/雙酶切pFGC5941;泳道3:DNAmarker。圖4為pFGC5941-TCS02(l)andpFGC5941-TCS03(l)的特異性引物PCR驗證電泳圖。泳道l:DNAmarker(GeneRulerDNAladderMix);泳道24:pFGC5941-TCS02(1)的陽性克隆；泳道59:pFGC5941-TCS03(1)的陽性克隆。圖5為pFGC5941-TCS02(1)andpFGC5941-TCS03(l)的通用引物PG02的PCR驗證電泳圖。泳道l:DNAmarker(GeneRulerDNAladderMix);泳道2:pFGC5941(對照質粒)；泳道35:pFGC5941-TCS02(l)的陽性克隆；泳道6~10:pFGC5941-TCS03(1)的陽性克隆。圖6為力a/禾BBaw///雙酶切T-TCS02禾flT-TCS03電泳圖。泳道1:DNAmarker(GeneRuler50bpDNAladder);泳道2:力a/和Saw///雙酶切T-TCS02;泳道3:J^a/和Saw///雙酶切T-TCS03。圖7為pFGC5941-TCS02(A)和pFGC5941-TCS03(B)的通用引物PG01的PCR驗證電泳圖。PG01泳道1:DNAmarker(GeneRulerDNAladderMix);A:泳道2,4,5,78:假陽性克隆；泳道3，6:pFGC5941-TCS02陽性克隆；B:泳道2~7，9:假陽性克隆；泳道8:pFGC5941-TCS03陽性克隆。圖8為pFGC5941-TCS02禾卩pFGC5941-TCS03導入發根農桿菌的PCR驗證電泳圖。泳道1:DNAmarker(GeneRuler50bpDNAladder);泳道2:pFGC5941導入Arfe-zogew^15834;泳道3~5:pFGC5941-TCS02導入AWz/zoge"^15834;泳道67:pFGC5941陽TCS03導入Artog面15834。具體實施例方式1.TCS基因片段克隆和RNAi干涉載體(PFGC5941-TCS*PCR-TG1)構建1)TCS基因片段克隆用TRIzo產試劑(InvitrogenLifeTechnologies)提取茶樹(福鼎大白茶)嫩芽總RNA和第一鏈cDNA合成試劑盒(BioBasicInc.)合成cDNA第一鏈。然后用兩對自行設計的特異性引物TCS02和TCS03(表1)擴增TCS獲得基因片段，上游引物5'端包含限制性內切酶Wal與Ad的酶切位點(TCTAGA和GGCGCGCC)和兩個保護堿基(AA)，下游引物5'端包含BawM與Svral的酶切位點(GGATCC禾aATTTAAAT)和兩個保護堿基(AA)。表1下劃線處為酶切位點。25piPCR反應體系為ddH2019.5pi,10xPCR反應緩沖液2.5nl,25mMMgCl21.5^1，10mMdNTPs0.5上下游引物各0.25pl，TaqDNA聚合酶(BioBasicInc.)0.4^(2個單位)，cDNA0.5|i。PCR反應的程序為94°C預變性5min,然后進入以下循環94。C變性50s，退火lmin，72'C延伸90s，35個循環結束后繼續72'C延伸10min。1%瓊脂糖電泳檢測(圖2)。表1TCS基因克隆的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2)茶樹TCS基因RNAi干涉載體的構建T-TCS02和T-TCS03經Ac/和Swa/f來自大連寶生生物工程有限公司)雙酶切獲得了TCS基因的目的條帶(圖3A泳道2和泳道3)。干涉載體質粒pFGC5941(圖3B泳道O經和^m/雙酶切，形成一條線性質粒DNA條帶(圖3B泳道2)。回收目的條帶和pFGC5941(來自美國俄咳俄州立大學擬南芥生物資源中心)的線性質粒DNA條帶(圖3B泳道2)、純化、連接和轉化，TCS基因的PCR片段插入到pFGC5941中，分別命名為pFGC5941-TCS02(1)禾口pFGC5941-TCS03(1)(其中"1"代表PCR片段第一次次插入pFGC5941中)，分別用特異性引物(圖4)和通用引物PG02(圖5)進行PCR鑒定。在圖5中可以看出對照質粒用通用引物PG02擴增的片段為大約280bp(圖5,泳道l),而陽性克隆由于插入了659bp(TCS02)和525bp(TCS03)的片段，所以擴增出約1000bp(圖5，泳道3~5)和900bp(圖5，泳道6~10)的條帶。T-TCS02和T-TCS03經Wa/和5am///(來自大連寶生生物工程有限公司)雙酶切獲得了TCS基因的目的條帶(圖6泳道2和泳道4)。回收目的條帶和pFGC5941TCS02(1)和pFGC5941-TCS03(l)的線性質粒DNA條帶、純化、連接和轉化，TCS基因的PCR片段反向插入到pFGC5941TCS02(1)和pFGC5941-TCS03(l)中，分別稱為pFGC5941-TCS02(圖7，A泳道3和泳道6)和pFGC5941-TCS03(圖7，B泳道7)。在圖7中可以看出假陽性克隆用通用引物PG01擴增的片段為大約280bp(圖7A，泳道2，4，5，7~8和B泳道2~6，9)，而陽性克隆由于插入了659bp(TCS02)和525bp(TCS03)的片段，所以擴增出約1000bp(圖7A，泳道3和6)和900bp(圖7A，泳道7)的條帶。3)干涉載體的測序驗證與導入發根農桿菌重組質粒和對照質粒pFGC5941用三親交配法和凍融交替法導入到發根農桿菌15834(來自上海中醫藥大學中醫研究所)中，分別用通用引物PGOl，PG02和ro/C基因引物鑒定證明轉化成功(圖8)。圖8中PG01禾卩PG02擴增15834-pFGC5941的產物長度約為280bp(PGOl和PG02泳道1)，而15834-pFGC5941-TCS02和15834-pFGC5941-PG03擴增長度約為1000bp(PGOl和PG02泳道3~5)禾B900bp(PGOl和PG02泳道6~7)，說明含有插入的目的序列。同時15834-pFGC5941、15834-pFGC5941陽TCS02禾卩15834-pFGC5941-TCS03都擴增出w/C基因的片段，說明這些質粒己經導入到發根農桿菌15834中。2發根農桿菌介導的轉基因和茶樹遺傳轉化1)轉化受體制備以MS培養基為基本培養基，并添加2.0mg/LBAP、0.5mg/LIBA和2mg/LGA3、30g/L蔗糖和6.8g/L瓊脂。培養基在高壓滅菌前用0.1MNaOH溶液調pH值為5.8，121'C滅菌15min。冷卻后切取茶樹品種"浙農129"和"浙農25"的莖段(長度約1cm)接種于培養上進行培養，培養條件為25士2'C，光照強度20001ux，每天光照16h，黑暗8h，每3個月繼代培養一次。以上述培養獲得的無菌苗作為基因轉化受體。2)遺傳轉化轉化之前將發根農桿菌15834置于含100mg/L利福平的YMB固體培養基上，在28°C黑暗培養活化兩次(每次12h)。挑取單菌落接種于20ml含100mmol/L乙酰丁香酮(AS，上海生工生物工程有限公司)液體YMB培養基中，28°C，250r/min震蕩培養至OD600為0.5-0.8用于侵染。將上述作為轉化受體的無菌苗置于發根農桿菌菌液中，侵染10-50min，無菌濾紙吸干多余的菌液，轉移于含100mmol/LAS的YMB培養基(共培養培養基)，黑暗共培養2d后，無菌水沖洗3~4次，用1000mg/L頭孢噻肟鈉(上海生工生物工程有限公司)浸泡20min以殺死農桿菌，用無菌濾紙吸干材料表面水分，轉移于含500mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養基(抑菌培養基)。25±2°C，黒暗培養。經過10天后，可以發現誘導出發狀根。3)轉化植株培養將上述具有發狀根的幼苗轉移到在附加0.010.1mg/LIAA的MS培養基繼續培養，使之形成健壯的茶苗。方法同上述"轉化受體制備"。6個月后對轉化植株進行咖啡因含量檢領J，發現有4個植株的咖啡因含量低于供試的對照福鼎大白茶(FD)，其中植株A的咖啡因含量僅為對照的1/3。試驗植株總數是200個，獲得陽性克隆16個，其中4株咖啡因含量降低50%以下，占比例2%(圖1)。本實施例由于利用現有高產、優質茶樹品種進行改造，可以較好地克服自然界現有低咖啡因茶樹資源在產量和品質方面存在的缺陷，容易培育出高產、優質的低咖啡因茶樹品種。序列表Upper:5，-AATCTAGAGGCGCGCCCAGCGGGTCCAAACTCS02ACAT-3,Lower:5'-AAGGATCCATCTCCACT-3，TTAAATTGATCCGTCCCTCTUoper:5，-AATCTAGAGGCGCGCCGCCCTTCAAAGGCCTCS03TGTCGTCTG-3'Lower:5，-AAGGATCCATCCACTA-3'TTAAATTGATCCGTCCCTCTTCS02Upper:AATCTAGAGGCGCGCCCAGCGGGTCCAAACACAT34Lower:AAGGATCCATTTAAATTGATCCGTCCCTCTCTCCACT37TCS03Upper:AATCTAGAGGCGCGCCGCCCTTCAAAGGCCTGTCGTCTG39Lower:AAGGATCCATTTAAATTGATCCGTCCCTCTCCACTA3權利要求1、一種培育低咖啡因茶樹的方法，其特征在于構建茶樹甲基轉移酶(TCS)雙鏈干涉基因表達載體(PFGC5941-TCS·PCR-TG1)，將TCS雙鏈干涉基因遺傳轉化，培養轉化植株。2、如權利要求l所述培育低咖啡因茶樹的方法，其特征在于構建茶樹甲基轉移酶(TCS)雙鏈干涉基因表達載體(PFGC5941-TCS*PCR-TG1)所用TCS基因來自福鼎大白茶嫩芽，擴增TCS基因片段采用了以下序列表達的兩對特異性引物TCS02和TCS03:TCS02Upper:5，-AA—TCTAGAGGCGCGCCCAGCGGGTCCAAACACAT-3'Lower:5，-AAGGATCCATTTAAATTGATCCGTCCCTCTCTCCACT-3'TCS03Upper:5，-AATCTAGAGGCGCGCCGCCCTTCAAAGGCCTGTCGTCTG-3'Lower:5，-AAGGATCCATTTAAATTGATCCGTCCCTCTCCACTA-3'全文摘要一種培育低咖啡因茶樹的方法，涉及轉基因培育低咖啡因茶樹的技術。包括構建茶樹甲基轉移酶(TCS)雙鏈干涉基因表達載體(PFGC5941-TCS·PCR-TG1)，將TCS雙鏈干涉基因遺傳轉化，培養轉化植株。所用TCS基因來自福鼎大白茶嫩芽，擴增TCS基因片段采用了以下序列表達的兩對特異性引物TCS02、TCS03。文檔編號C12N15/82GK101096683SQ20071006913公開日2008年1月2日申請日期2007年5月31日優先權日2007年5月31日發明者倩葉,張廣輝,杜穎穎,晨林,梁月榮,陸建良申請人:浙江大學