專利名稱：：檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人泌尿生殖道分泌物中病原體的檢驗，尤其涉及一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法。技術(shù)背景隨著我國對外開放程度的逐步加深，加上社會上有些人受到"性自由"思想的影響和對性傳播疾病的無知，在一些開放城市和經(jīng)濟發(fā)達(dá)地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)了新的性病患者，加之當(dāng)今各地之間的人員流動非常頻繁，性病的發(fā)生及傳播呈愈演愈烈之勢。如2004年全國31個省(直轄市、自治區(qū))共累計報告性病(HIV/AIDS除外)809，550例，較上一年就上升了10%。2004年全國性病疫情分析報告顯示，淋病奈瑟氏球菌(簡稱淋球菌，NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)已成為三種主要的導(dǎo)致性病的病原體。對本市部分就診者的檢測顯示，合并2種或3種病原體感染的患者正在逐年增加。性傳播疾病對人類健康的危害性很大。特別是對青年人，后果更為嚴(yán)重，有的會導(dǎo)致終身的健康問題，包括不孕、不育、慢性疼痛以及增加感染艾滋病的危險，對人們的身心健康和家庭社會構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。對性傳播疾病實行早期監(jiān)測和診斷，是性病防治工作中的一個重要組成部分，對于提高性病治愈率，縮短病程和傳染期，控制和消滅傳染源，阻止性疾病的蔓延有著重要的作用。目前對淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體的檢驗方法主要有涂片檢査，細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)、血清學(xué)試驗和PCR法。涂片檢查是檢測淋球菌的主要方法，但尿道分泌物的狀態(tài)會影響檢測的敏感度；細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)是將標(biāo)本接種于合適的培養(yǎng)基或細(xì)胞，使其擴增，并進一步作出鑒定。培養(yǎng)法特異性高，能檢出病人分泌物內(nèi)活的病原體，結(jié)合藥敏試驗?zāi)茏鳛樗幬锆熜У呐袛啵^去常作為檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于受專業(yè)化技術(shù)、試劑、設(shè)備、周期長等因素的影響，目前臨床一般不采用，僅在科研單位進行科研活動，或作為新診斷試劑方法學(xué)評價的金標(biāo)準(zhǔn)；血清學(xué)試驗可以提供快速診斷，曾被認(rèn)為是一種理想的診斷方法，但因為敏感性和特異性不夠高，進口抗體的昂貴價格而不能用于過篩實驗；PCR法用于感染早期的病原體診斷，己逐漸成為病原體檢測的新寵。PCR法操作簡單、耗時較少、靈敏度高，理論上只要有一個拷貝便可被檢出。但是作為高度敏感的擴增實驗，操作不當(dāng)極易造成污染而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。近年來出現(xiàn)的實時熒光定量PCR(real-timequantitativePCR)技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它基本解決了過去實驗過程因污染出現(xiàn)的假陽性。實時熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量PCR技術(shù)中，特異性熒光探針的選擇和設(shè)計是至關(guān)重要的。它是把熒光化合物標(biāo)記到特異性的寡核苷酸上形成熒光標(biāo)記的DNA探針，通過探針與PCR產(chǎn)物特異性的結(jié)合，在PCR過程中可對產(chǎn)物實現(xiàn)均相、實時、定量檢測。根據(jù)熒光基團標(biāo)記和實現(xiàn)能量共振轉(zhuǎn)移方式的不同，熒光PCR所用的探針可以分為五大類，分別是Taqman探針，分子信標(biāo)，光標(biāo)記引物，雜交探針，DNA-RNA-DNA嵌合探針。在實時熒光定量PCR技術(shù)中，定量PCR儀的發(fā)展是另一決定因素。多色多通道檢測是當(dāng)今的主流趨勢，多通道指可同時檢測一個樣品中的多種熒光，使得在單管內(nèi)可同時檢測多模板。目前，在大部分醫(yī)院都具有多通道的熒光PCR儀。此外，為滿足多色多通道檢測的需求，目前已開發(fā)了包括FAM，TET，VIC，HEX等近十種的熒光基團。但是，目前幾乎所有臨床上使用的都是單檢PCR產(chǎn)品，一次只能檢測出一種病原體，不利于對混合感染的檢測，而且操作過程相對費時，成本高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的探針。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物，包括以下引物對中的至少一對(1)用于擴增淋病奈瑟氏球菌靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO:1的至少15個連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO:2的至少15個連續(xù)核苷酸；(2)用于擴增解脲支原體靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO:3的至少15個連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO:4的至少15個連續(xù)核苷酸；(3)用于擴增沙眼衣原體靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO:5的至少15個連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO:6的至少15個連續(xù)核苷酸。較佳地，所述引物對至少包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2;禾口/或SEQIDNO:3、SEQIDNO:4;禾口/或SEQIDNO:5、SEQIDNO:6。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的探針，包括至少以下的一種寡核苷酸序列(1)與上述引物對擴增的淋病奈瑟氏球菌的靶核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:7或其互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸；(2)與上述引物對擴增的解脲支原體的靶核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:8或其互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸；(3)與上述引物對擴增的沙眼衣原體的靶核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:9或其互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸。較佳地，所述探針至少包括SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9中的一種寡核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的方法，包括以下步驟-(1)提取核酸樣本；(2)用至少一對上述的引物序列，以步驟(l)提取的核酸為模板，擴增病原體的耙核酸序列；(3)檢測擴增產(chǎn)物，并分析結(jié)果。較佳地，所述步驟(2)中還包括加入能與步驟(2)所用引物對擴增的靶核酸序列進行雜交的探針序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的試劑盒，包括至少一對本發(fā)明所述的引物序列。較佳地，所述試劑盒還包括至少一種本發(fā)明所述的探針序列，該探針序列與所含引物序列擴增的耙核酸序列進行雜交。更佳地，所述試劑盒包含以下引物和探針組合中的至少一種組合(1)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:7;(2)SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:8;(3)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:9。在本發(fā)明中，術(shù)語"引物"是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點，在上述條件下可以誘發(fā)合成與核酸鏈互補的引物擴增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液中并在合適的溫度下進行上述合成。優(yōu)選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設(shè)計用途，但一般在1525個核苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物不必反應(yīng)模板的準(zhǔn)確序列，但必須充分互補，以與模板雜交并引發(fā)DNA合成。在本發(fā)明中，術(shù)語"探針"是指能識別特異核苷酸序列的帶標(biāo)記的一段單鏈DNA或RNA分子，它只與被檢測的特定核苷酸序列結(jié)合。探針位置盡可能地靠近上游引物。為保證結(jié)合特異性，探針的合適長度一般在1545個核苷酸之間。由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法，可以在一個反應(yīng)管內(nèi)同時檢測淋病奈瑟氏球菌(NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)三種不同的病原體，不僅提高性傳播疾病的早期檢出率，而且減少醫(yī)務(wù)人員的操作時間，降低成本，并減輕病人經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。圖1是本發(fā)明檢測的淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體三種病原體的電泳圖；圖2是本發(fā)明單獨檢測淋病奈瑟氏球菌的熒光定量PCR圖；圖3是本發(fā)明單獨檢測解脲支原體的熒光定量PCR圖；圖4是本發(fā)明單獨檢測沙眼衣原體的熒光定量PCR圖；圖5是本發(fā)明同時檢測淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體三種病原體的熒光定量PCR圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1檢測淋病奈瑟氏球菌(NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)的引物、探針序列及方法1.淋病奈瑟氏球菌的引物和探針根據(jù)淋病奈瑟氏球菌的靶核酸序列(GenbankAcession:M10316)，選擇合適的區(qū)域設(shè)計引物與探針，共設(shè)計了兩組引物和探針，經(jīng)過實驗比較，選擇了其中的一組，具體的序列如下NG-Fl:5'-GCTACGCATACCCGCGTTGC-3'(SEQIDNO:1，位于靶序列3141-3160bp)NG-Rl:5'-CGAAGACCTTCGAGCAGACA-3'(SEQIDNO:2，位于靶序列3531-3512bp)NG-Fl，NG-Rl的擴增產(chǎn)物長391bp(見圖1),對應(yīng)于靶序列的隱蔽質(zhì)粒區(qū)。雜交探針NG-PI:FAM-5'-CTGTTTMGTCGTCCAGCTCGTTC-3'-BHQ1(SEQIDNO:7，位于耙序列3251-3275bp)經(jīng)檢測，NG-F1、NG-R1、NG-PI檢測的靈敏度能達(dá)到E3水平(見圖2)。2.解脲支原體的引物和探針根據(jù)解脲支原體的靶核酸序列(GenbankAcession:X51315),選擇合適的區(qū)域設(shè)計引物與探針，共設(shè)計了兩組引物和探針，經(jīng)過實驗比較，選擇了其中的一組，具體的序列如下UU-Fl:5'-CAGGTAAATTAGTACCAG-3'(SEQIDNO:3，位于靶序列543-560bp)UU-R1:5'-ACGACGTCCATAAGCAACT-3'(SEQIDNO:4，位于靶序列757-739bp)UU-F1，UU-R1的擴增產(chǎn)物長215bp(見圖l)，位于尿酶基因區(qū)。UU-Pl:HEX-_CCGTCCTATCCAAGTTGGATCACA-B即(SEQIDNO:8，位于耙序列643-666bp)經(jīng)檢測，UU-F1、UU-R1、UU-P1檢測的靈敏度能達(dá)到E3水平(見圖3)。3.沙眼衣原體的引物和探針根據(jù)沙眼衣原體的靶核酸序列(GenbankAcession:CP000052)，選擇合適的區(qū)域設(shè)計引物與探針，共設(shè)計了兩組引物和探針，經(jīng)過實驗比較，選擇了其中的一組，具體的序列如下CT-Fl:5'-CTAGGCGTTTGTACTCCGTCA-3'(SEQIDNO:5，位于靶序列604-624bp)CT-Rl:5'-TCCTCAGAAGTTTATGCACT-3'(SEQIDNO:6，位于耙序列803-784bp)CT-F1，CT-R1的擴增產(chǎn)物長200bp(見圖1)，對應(yīng)于耙序列的隱蔽質(zhì)粒區(qū)。CT-PI:ROX-5'-GAGAGAACGTGCGGGCGATTTGC-3'-BHQ2(SEQIDNO:9，位于耙序列688-711bp)經(jīng)檢測，CT-F1，CT-R1，CT-P1檢測的靈敏度能達(dá)到E3水平(見圖4)。4.引物合成及純化方法合成方法是固相亞磷酸三酯法進行化學(xué)DNA合成，純化方法為聚丙烯酰胺凝膠電泳，引物在使用前經(jīng)稀釋后，使用紫外分光光度計進行檢測、重定量，確保其A260/A280〉1.7。5.探針合成及純化方法探針合成采用兩步法，第一步用亞磷酸三酯法將R印orter連接于DNA的5'端。第二步是采用Postlink方法將NHS活化酯化的Quencher連接上去(R印orter可用FAM，HEX，TET等；Quencher采用TAMRA，BHQ1,BHQ2等，可修飾于3'端或DNA中間)。因考慮到熒光染料在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，采用的合成單體為Fastamidite，以保證熒光的穩(wěn)定性。探針純化方法采用的是PAGE凝膠電泳法基礎(chǔ)上的HPLC純化，第一步是在Postlink連接Quencher之前，用PAGE將大部分的雜質(zhì)去掉，特別是將可能會與Quencher連接形成副產(chǎn)物的雜質(zhì)去掉，這有助于Quencher連接效率的提高和后面的純化工作；第二步是在連接了Quencher之后再用PAGE電泳在一定條件下將其它雜質(zhì)除去，以獲得比較高純度的產(chǎn)品；第三步即過dHPLC進行純化，對于純化后產(chǎn)品將檢驗其出峰位置及純度，再用紫外分光光度計在260nm波長下定量。探針在使用前經(jīng)稀釋后，使用紫外分光光度計進行檢測、重定量，確保其A260/A280〉1.7。6.其他材料純化水符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》要求，Hot-Start酶由超生生物公司提供、dNTP(dATP:dCTP:dGTP:dUTP=25mM:25mM:25mM:25mM)、UNG酶由普洛麥格公司提供。所有化學(xué)試劑為分析純或分析純以上級別，所有試劑均檢驗合格。7.對照品(1)陰性對照品純化水。替代試驗檢驗合格。(2)陽性對照品已知濃度的NG、UU、CT病原微生物菌液，已知濃度的NG、UU、CT病原微生物質(zhì)粒DNA溶液。8.檢測方法本發(fā)明應(yīng)用多重PCR熒光原理，在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢測淋球菌、解脲支原體、沙眼衣原體，在同一反應(yīng)管內(nèi)加入各自的引物與探針，由于三種探針的5'端分別標(biāo)記不同波長的報告熒光，PCR反應(yīng)進行時，不同的報告熒光基團釋放熒光，熒光測定儀器分別讀取三種波長的熒光信號進行分析，使三種病原體的檢測在一次實驗中完成。對反應(yīng)的條件進行優(yōu)化，最終確定的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下(1)多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系(選用40pL反應(yīng)體系)40|nL反應(yīng)體系中含有2.5pL10XPCRreactionbuffer(Mg2+free),3mmol/LMg2+，0.125mmol/LdNTP，0.25nmol/LNG_F，0.25網(wǎng)ol/LNG-R，0.125|iimol/LNG-P，0.25pmol/LUU-F，0.25pmol/LUU-R，0.156|mnol/LUU-P，0.25|umol/LCT_F，0.25)nmol/LCT-R，0.3125pmol/LCT-P，Hot-Start聚合酶2U，UNG酶0.2U，，模板量為3pL，補充水至40pL。(2)多重?zé)晒釶CR擴增條件PCR擴增條件確定為42°C5分鐘、95。C15分鐘預(yù)變性；95°C15秒、60°C60秒；37°C恒溫。采用的PCR儀為ABIPRISM7000PCR熒光檢測儀，選定檢測熒光為FAM，HEX,ROX通道，并在PCR循環(huán)第二步60°C時收集熒光信號。儀器檢測通道選擇通道l，2，4;其它為默認(rèn)值。檢測結(jié)果如圖5所示，在圖5中，三條上升的曲線中最上面一條曲線代表NG，中間的第二條曲線代表UU，第三條曲線代表CT。根據(jù)樣品、陽性對照、陰性對照及臨界對照的Ct值確定樣品中是否存在三種病原體的DNA，從而判定病人的病原體感染情況。實施例2檢測淋病奈瑟氏球菌(NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)的試劑盒的制備1.本發(fā)明試劑盒所采用的原材料(1)引物及探針本發(fā)明的引物及探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)合成。(2)其他材料純化水符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》要求，Hot-Start酶由超生生物公司提供、dNTP(dATP:dCTP:dGTP:dUTP=25mM:25mM:25mM:25mM)、UNG酶由普洛麥格公司提供。所有化學(xué)試劑為分析純或分析純以上級別，所有試劑均檢驗合格。(3)對照品1)陰性對照品純化水。替代試驗檢驗合格。2)陽性對照品己知濃度的NG、UU、CT病原微生物菌液，已知濃度的NG、UU、CT病原微生物質(zhì)粒DNA溶液。2.檢測方法(1)標(biāo)本裂解、從存有分泌物懸濁液的離心管中取樣300^1于0.5ml離心管中，15000rpm離心10分鐘，棄上清；加入裂解緩沖液50^1。于IO(TC加熱IO分鐘，15000rpm離心5分鐘，取3^1上清進行PCR反應(yīng)。要注意，裂解后的標(biāo)本應(yīng)保存在-2(TC，如結(jié)果有疑問，應(yīng)取出重復(fù)檢測，直至有了明確的結(jié)果后才可丟棄。每次重復(fù)實驗前，都要將裂解標(biāo)本離心(13000rpm，5分鐘)后取用。(2)PCR反應(yīng)試劑的制備1)引物及探針的制備引物，探針均為50D/管，將裝有引物或探針的1.5ml離心管13000rpm離心數(shù)秒，使引物干粉聚集于管底，加入500|til純化水，振蕩混勻后靜置10分鐘，探針需要避光靜置，使之充分溶解，13000rpm離心數(shù)秒。2)IOO人份三聯(lián)檢PCR反應(yīng)液的制備取4ml10Xbuffer，0.2ml25畫1/LdNTP，0.2ml50nmol/LNG-F，0.2ml50^imol/LNG-R，0.lml50|umol/LNG-P，0.2ml50pmol/LUU-F，0.2ml50nmol/LUU-R，0.125ml50,ol/LUU-P，0.2ml50^mol/LCT-F，0.2ml50^imol/LCT-R，0.25ml50,ol/LCT-P，用純化水定容至35ml，充分混勻。3)反應(yīng)液的質(zhì)控用待檢的反應(yīng)液檢測陰性內(nèi)控品、陽性內(nèi)控品，靈敏度內(nèi)控品，檢測結(jié)果符合陰性內(nèi)控品的CT值大于38或無CT值，陽性內(nèi)控品CT《28，靈敏度內(nèi)控品CT=2933，則為合格。(3)Hot-start聚合酶和UNG酶混合液(含0.5U/|iilHot-star聚合酶和0.05U/|nlUNG酶)的制備和質(zhì)控分別取2500UHot-start聚合酶、250UUNG酶混合，配備5ml酶溶液。替代試驗合格。(4)裂解緩沖液的制備取1MTris-HC1(pH8.0)溶液10ml，0.5MEDTA(pH8.0)2.0ml，5MNaCl20ml，10%TritionX-100100ml,補加純化水定容至1000ml，充分混勻后高壓滅菌。替代試驗合格。(5)對照品的制備1)陽性對照品的制備和質(zhì)控取含已知濃度的NG、UU、CT病原微生物質(zhì)粒DNA溶液，用TE稀釋，用企業(yè)內(nèi)控品測定陽性對照品CT《28。2)臨界對照品的制備取已知濃度的NG、UU、CT病原微生物菌液，用純化水稀釋10倍。用企業(yè)內(nèi)控品測定臨界對照品CT<36。(6)半成品檢定用企業(yè)內(nèi)控品檢定。1)特異性檢定取8份臨床確診為NG、UU、CT均為陰性的標(biāo)本作為陰性(特異性)參考品并進行PCR試驗，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行——陰性符合率應(yīng)為100%，為合格。2)準(zhǔn)確性檢定取臨床確診為NG、UU、CT均為陽性的標(biāo)本各3份作為準(zhǔn)確性參考品，進行PCR試驗，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行——陽性符合率應(yīng)100%，3)靈敏度檢定用高滴度(107copies/ml濃度用相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定)的臨床標(biāo)本以10倍的梯度逐級稀釋至103copies/ml，取103copies/ml、104copies/ml、105copies/ml、106copies/ml作為企業(yè)內(nèi)控敏感性參考品或已經(jīng)定量的標(biāo)準(zhǔn)株103copies/ml、104copies/ml、105copies/ml、106copies/ml作為敏感性參考品。取103copies/ml滴度的淋病奈瑟氏球菌，解脲支原體，沙眼衣原體混合，作為三檢試劑的臨界參考品，檢測結(jié)果CT符合CT二3236。4)精密度檢定用1份臨界對照，重復(fù)做10次，CT值變異系數(shù)不得大于15%。(7)分裝、貼簽、包裝1)分裝用微量移液器將準(zhǔn)備好的試劑分裝入清潔的離心管中，蓋緊管蓋，裝量如表1所示表l成份標(biāo)識量(pl)實際分裝量&1)PCR反應(yīng)液840900裂解緩沖液12001200Hot-start聚合酶+UNG酶4850陰性對照200200臨界對照200200陽性對照20202)貼簽'將檢驗合格的標(biāo)簽，貼在相應(yīng)的離心管上。3)包裝按照試劑盒的組成成份，將相應(yīng)的離心管插入盒內(nèi)襯上，裝入盒中，放入說明書，封口。試劑盒組裝要求如下表2所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3.試劑盒成品檢定(1)外觀檢定檢定方法目測。檢定標(biāo)準(zhǔn)試劑盒包裝完整無缺，并附有說明書；各試劑組分齊全、試劑分裝量符合組成要求。(2)特異性檢定、準(zhǔn)確性檢定、靈敏度檢定、精密度檢定同半成品檢定。4.保存及有效期在-2(TC保存條件下，自檢定合格之日起有效期為6個月。5.試劑盒使用說明本發(fā)明的試劑盒采用核酸擴增技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記探針雜交方法對NG、UU、CT的DNA進行定性檢測。使用方法(1)試劑準(zhǔn)備按標(biāo)本的數(shù)量和所需的對照數(shù)量配制反應(yīng)體系，存于4。C。(2)標(biāo)本裂解從存有分泌物懸濁液的離心管中取樣300nl于0.5ml離心管中，15000rpm離心10分鐘，棄上清；加入裂解緩沖液50^1。于IO(TC加熱10分鐘，15000rpm離心5分鐘，取3|il上清進行PCR反應(yīng)。(3)加樣在準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)液中分別加入裂解標(biāo)本上清液或定標(biāo)品。(4)PCR反應(yīng)按說明設(shè)定程序，在熒光PCR儀上進行擴增。保存于-2(TC保存，在有效期內(nèi)使用。序歹U表〈110〉上海申友健海生物技術(shù)有限責(zé)任公司<120>檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法〈130〉NP-07-11557<160>9〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉20<212>腿〈213〉人工序列〈220〉<221〉misc一feature〈223>引物〈400>1gctacgcatacccgcgttgc20〈210〉2〈211〉20<212>腿<213>人工序列〈220>〈221>misc—feature〈223>引物<400〉2cgaagaccttcgagcagaca20〈210〉3<211〉18〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉misc一feature<223〉引物〈400〉3caggtaaattagtaccag18〈210〉4<211〉19〈212〉■〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature〈223>引物<400〉4acgacgtccataagcaact19〈210〉5<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物〈400〉5ctaggcgtttgtactccgtca21<210>6<211>20〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc—feature<223>引物〈400〉6tcctcagaagtttatgcact20<210>7<211>24〈212>腿〈213〉人工序列〈400〉7ctgtttaagtcgtccagctcgttc24<210〉8〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉8ccgtcctatccaagttggatcaca24<210〉9〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉9gagagaacgtgcgggcgatttgc2權(quán)利要求1.一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物，其特征在于，包括以下引物對中的至少一對(1)用于擴增淋病奈瑟氏球菌靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO1的至少15個連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO2的至少15個連續(xù)核苷酸；(2)用于擴增解脲支原體靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO3的至少15個連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO4的至少15個連續(xù)核苷酸；(3)用于擴增沙眼衣原體靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO5的至少15個連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO6的至少15個連續(xù)核苷酸。2.如權(quán)利要求l所述的引物，其特征在于，所述引物對至少包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2;禾口/或SEQIDNO:3、SEQIDNO:4;和/或SEQIDNO:5、SEQIDNO:6。3.—種檢測人泌尿生殖道病原體的探針，其特征在于，該探針包括至少以下的一種寡核苷酸序列(1)與權(quán)利要求1所述引物對擴增的淋病奈瑟氏球菌的耙核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:7或其互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸；(2)與權(quán)利要求1所述引物對擴增的解脲支原體的耙核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:8或其互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸；(3)與權(quán)利要求1所述引物對擴增的沙眼衣原體的靶核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:9或其互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸。4.如權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于，所述探針至少包括SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9中的一種寡核苷酸序列。5.—種檢測人泌尿生殖道病原體的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)提取核酸樣本；(2)用至少一對權(quán)利要求1所述的引物序列，以步驟(l)提取的核酸為模板，擴增病原體的耙核酸序列；(3)檢測擴增產(chǎn)物，并分析結(jié)果。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中還包括加入能與步驟(2)所用弓I物對擴增的靶核酸序列進行雜交的探針序列。7.—種檢測人泌尿生殖道病原體的試劑盒，其特征在于，包括至少一對權(quán)利要求1所述的引物序列。8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括至少一種權(quán)利要求3所述的探針序列，該探針序列與所含引物序列擴增的靶核酸序列進行雜交。9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，包含以下引物和探針組合中的至少一種組合(1)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2禾QSEQIDNO:7;(2)SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:8;(3)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:9。全文摘要本發(fā)明公開了檢測人泌尿生殖道病原體的引物和探針，以及運用該引物和探針對人泌尿生殖道病原體進行檢測的方法。本發(fā)明方法可以在一個反應(yīng)管內(nèi)同時檢測淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體三種不同的病原體，不僅提高性傳播疾病的早期檢出率，而且減少醫(yī)務(wù)人員的操作時間，降低成本，并減輕病人經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。文檔編號C12Q1/68GK101117646SQ20071009393公開日2008年2月6日申請日期2007年7月6日優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日發(fā)明者張愛民,慧熊,謝立群,陳嘉錚申請人:上海申友健海生物技術(shù)有限責(zé)任公司