專利名稱：：用于血液致病菌檢測的基因芯片和檢測用試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種基因芯片和試劑盒，尤其涉及一種用于血液致病菌檢測的基因芯片和試劑盒。
背景技術：
：健康人的血液是無菌的，當人體局部感染向全身播散并出現全身感染癥狀時，血液中出現細菌，按程度不同可分為菌血癥、敗血癥和毒血癥。其中以敗血癥的臨床癥狀最為嚴重。菌血癥從病源微生物在感染部位的增殖開始，隨后在原位增殖或隨血液傳播，導致菌血癥，同時釋放大量微生物的結構成分脂多糖(或內毒素)、肽糖脂、脂磷壁酸、細胞外酶等，進而誘導內源性感染性介質的釋放。導致炎性介質如細胞因子、花生四烯酸代謝產物、凝集素、補體、一氧化氮、內啡肽、細胞激動素的釋放增加，以及誘導其他重要的生理效應，甚至導致多器官功能衰竭(MOF)死亡。敗血癥是指致病菌侵入血液循環，持續存在，迅速繁殖，產生大量毒素，引起嚴重的全身癥狀。一般在病人全身情況差和致病菌毒力大、數量多的情況下發生，是一種嚴重情況。敗血癥通常由一種病原菌引起，但也有由兩種或更多種類的病原菌所引起，稱為復數菌敗血癥，在全部的敗血癥中，其發病率超過10%。敗血癥的預后較茳，死亡率一般為3050%;復數菌敗血癥的死亡率更高，可達70%80%。中國常見的10類血液致病菌，包括金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌屬、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌、克雷伯氏菌/腸桿菌(肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌；陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌)、大腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、弗氏檸檬酸桿菌。現有較先進的臨床菌血癥檢驗系統有兩類"自動血培養檢測和分析系統"和"微生物數碼分類鑒定系統(API)"。這兩種被醫院廣泛采用的系統均對被測標本進行增菌培養之后需要生化鑒定或血清學反應，通常需要3到5天。最大弊端是所需時間較長，在這之前廣譜抗生素的濫用造成臨床診斷復雜化，不能滿足臨床需要，這往往使臨床醫生錯過了最佳的治療時機。而生物芯片由于具有高通量的特點，可以通過一次試驗確定芯片上涵蓋的多種細菌種類，因而避免了時間的浪費，縮短了菌血癥檢驗的時間，對臨床醫生有效施治具有重要的指導意義。從二十世紀九十年代開始，基因芯片技術作為一種全新的分析檢測技術建立了起來，并隨著人類基因組計劃的開展逐步發展起來。該技術綜合運用了分子生物學技術、集成電路制造技術、計算機技術、半導體技術、共聚焦激光掃描技術、熒光標記技術使檢測過程具有敏感性高、特異性強、大規模集成化、自動化、操作簡便快捷、效率高等特點，受到科研人員的青睞。目前生物芯片技術已廣泛應用到了分子生物學、疾病的預防、診斷和治療、新藥研發、環境污染監測等諸多領域。眾所周知，原核生物細胞中的16SrRNA基因的序列十分保守，不受微生物所處環境條件的變化、營養物質的豐缺的影響而有所變化，可以看作為生物進化的時間標尺，記錄著生物進化的真實痕跡。細菌的16SrRNA基因具有相當的變異性，從而在序列上表現多型性，已經被廣泛用于細菌進化關系分析和種的鑒定。因此，分析原核生物細胞中的16SrRNA基因的堿基序列，比較所分析的微生物與其他微生物種之間16SrRNA基因序列的同源性，可以真實地揭示它們親緣關系的距離和系統發育地位。根據16SrRNA基因建立的生命樹認為，生命由細菌域(Bacteria)、古菌域(Archaea)和真核生物域(Eucarya)構成。三域生物間序列相似性<60%，域內相似性>70%，同種序列相似性>97%。16SrRNA基因序列變化變漫，跨越整個生命進化過程，分子中含有進化速度不同區域，可以作為分類的基礎。綜上所述，有必要發明出一種利用基因芯片技術來快速、準確、可靠的對血液致病菌檢測的產品及其方法。
發明內容鑒于上述情況，本發明的一個目的是提供一種用于血液致病菌檢測的基因芯片，以彌補傳統血液致病菌檢測技術存在的不足，實現血液致病菌檢測的快速、準確和可靠。本發明的另一目的是提供一種至少包括上述基因芯片的用于檢測血液致病菌的試劑盒。本發明的再一目的是提供利用所述的基因芯片和試劑盒來快速、準確、靈敏地檢測血液致病菌的方法。為實現上述目的，本發明采用了如下技術方案-本發明提供了一種用于血液致病菌檢測的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其中所述的寡聚核苷酸探針包括從一類或幾類血液致病菌的16SrRNA基因序列和m/c基因序列中選取的DNA片段。所述的DNA片段為SEQIDNO:1-SEQIDNO:28的至少一種。本發明的較佳實施例中，所述的寡聚核苷酸探針還包括陽性對照探針、陰性對照探針和熒光探針。本發明的較佳實施例中，所述的熒光探針具有SEQIDNO:29的核苷酸序列；陰性對照探針具有SEQIDNO:30的核苷酸序列；陽性對照探針具有SEQIDNO:31的核苷酸序列。本發明中所述的一類或幾類血液致病菌選自金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌屬、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌、克雷伯氏菌/腸桿菌、大腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、弗氏檸檬酸桿菌。其中所述的克雷伯氏菌/腸桿菌包括肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌。本發明中所述的基因芯片可用于金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌屬、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌、克雷伯氏菌/腸桿菌、大腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、弗氏檸檬酸桿菌血液致病菌的至少一種的檢測,其中所述的克雷伯氏菌/腸桿菌包括肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌。其中應用的檢測探針為SEQIDNO:32-SEQIDNO:37中的至少一種。本發明還提供一種用于血液致病菌檢測的試劑盒，該該試劑盒包括本發明所述的基因芯片。本發明所述的試劑盒，還包括SEQIDNO:32-SEQIDNO:37的檢測探針的至少一種。本發明所述的試劑盒，還可以包括雜交盒、雜交液和分析鑒定結果用的判讀軟件以及說明書。本發明所述的試劑盒可用于金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌屬、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌、克雷伯氏菌/腸桿菌、大腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、弗氏檸檬酸桿菌血液致病菌的至少一種的檢測，其中所述的克雷伯氏菌/腸桿菌包括肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌。本發明還提出應用所述的基因芯片和試劑盒檢測血液致病菌的方法，包括以下步驟(1)根據16SrRNA基因序列兩側適宜和高度保守的區域設計用于擴增16SrRNA基因序列的通用引物；(2)按常規方法制備待測樣品的基因組DNA，使用步驟(1)中的引物對待測樣品基因組DNA進行PCR擴增并純化擴增得到的耙序列；(3)標記步驟(2)中得到的靶序列；(4)將標記后的靶序列與上述基因芯片雜交；(5)用生物芯片掃描儀獲取雜交信號并分析鑒定雜交結果。在本發明的較佳實施例中，上述步驟(1)中根據16SrRNA基因序列兩側適宜和高度保守的區域設計的上游引物序列為SEQIDNO.32-33，下游引物序列為SEQIDNO:34-SEQIDNO:37。在本發明的較佳實施例中，上述步驟(5)中使用判讀軟件BactarrayAnalyzer分析鑒定雜交結果。由上述的技術方案可見，利用本發明的基因芯片可以達到檢測并確定血液感染患者所感染細菌種類的目的，由于操作簡便，準確性高，重復性強，在24小時內能給出檢測結果，對于臨床醫生的用藥有一定的指導意義。為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下面特舉較佳實施例，并配合說明書附圖，作詳細說明如下。圖1為本發明一個實施例的基因芯片的外形示意圖。圖2為本發明基因芯片的一個實施例上探針的排布示意圖。圖3A-圖3J為用本發明基因芯片的一個實施例進行樣品檢測的雜交掃描結果。圖4A-圖4B為將本發明基因芯片的一個實施例進行樣品檢測的雜交掃描結果儲存為.gpr文件的過程示意圖。圖5為利用本發明基因芯片的一個實施例進行檢測的分析結果報告。圖6為64種細菌16SrRNA基因系統的進化樹。具體實施例方式為進一步說明本發明的用于血液致病菌檢測的基因芯片及其檢測方法，特舉以下較佳實施例進行說明，這些實施例是為了說明而不是以任何方式限制本發明。實施例一:探針的設計和制備1.序列獲得從Ge"5朋A:中下載得到上述10類血液致病菌的16SrRNA基因序列。2.探針設計用ClustalX軟件比對所有下載序列，根據比對結果，在16SrRNA基因序列的變異區設計針對每一類細菌的探針，共設計上述10類血液致病菌的寡核苷酸探針75條。3.探針篩選通過766次雜交實驗進行探針篩選，最終得到31條適用探針，包括28條針對血液致病菌的特異探針、l條陽性對照探針、l條陰性對照探針和熒光探針，其堿基序列如下表l、表2所示。其中，編號為N0.1-N0.28的28條探針(SEQIDNO:l-NO:28)分別選自血液常見致病菌中的金黃色葡萄球菌、鏈球菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌、克雷伯氏菌/腸桿菌、大腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、弗氏檸檬酸桿菌的16SrRNA基因序列，這些探針可從檢測樣品中分別檢測出相應的來源菌。用帶有熒光標記Cy3的多聚T序列對玻璃片基的質量進行監控以及對掃描結果圖上的探針位置進行定位。用含有多個T的探針作為陰性對照探針，用于對非特異雜交情況進行監控。編號為N0.31的探針用作陽性對照探針，用于檢測樣品中是否含有細菌。表1.本發明基因芯片一實施例中所選用的探針序列及相應的檢測菌<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>TTTCGCNO:24N0.24大腸桿菌CAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGC大腸桿菌NO:25N0.25屎腸球菌ATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTG屎腸球菌NO:26N0.26屎腸球菌CAAAACCGCATGGTTTTGATTTG屎腸球菌NO:27NO.27糞腸球菌ACGTTAGTAACTGAACGTCCCCTG糞腸球菌NO:28N0.28糞腸球菌ATGCCGCATGGCATAAGAGTG糞腸球菌NO:29N0.29熒光探針^1，'1"J、r^，f-、」，'|、^|"|、f|",|,、1"|，r「「(，，1"1，f|國，TTTTTTTTTTT-Cy3作為熒光對照NO:30NO.30陰性對照探針作為陰性對照NO:31N0.31陽性對照探針ACTCCTACGGGAGGCAGC作為陽性對照4.探針合成按照表1中的序列合成探針，在5'端進行poly(T)和氨基修飾。實施例二:引物的設計和制備利用Primer5.0等生物信息學軟件分析GenBank等公共數據庫內的序列資源，在16SrRNA基因序列兩側適宜和高度保守的區域設計了用于擴增16SrRNA基因序列的通用引物2條，該引物序列及其用途如下表2所表3.16SrRNA基因擴增通用引物及用途引物編號引物序列(5'-3')引物用途15，-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3，(SEQIDNO:32)和5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(SEQIDNO:33)16S上游引物<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例三:基因芯片的制備1.溶解探針將實施例一中合成的探針溶解于50%DMSO溶液中，使探針的終濃度達到1嗎~1。2.點樣利用自動生物芯片點樣儀(Spotarmy72)將探針點到玻片上，形成設計好的微陣列。如圖1所示，本實施例中使用的芯片是以57.5mmx25.5mmxlmm(長x寬x高)的經過醛基化的玻片為固相載體，將實施例一中合成的31條寡核苷酸探針點在玻片上3mmx3mm的點樣區內，構成中低密度DNA微矩陣，玻片上的六個點樣區內陣列排布規律相同。如圖2所示，詳細給出了每個點樣區的探針排布，每個點樣區內為9(行)xl2(列)個探針點，每條探針重復點樣3次，括號中的編號為表1中的探針標號，對照表1即可詳細了解每條探針的位置。將點樣后的玻片干燥、紫外交聯，即獲得根據本發明較佳實施例的用于檢測血液重要致病菌的基因芯片。實施例四:利用上述制備好的基因芯片快速檢測血液中的致病菌在利用上述制備好的基因芯片檢測血液致病菌的方法中，本發明對檢測步驟、檢測條件等因素均作了一系列的實驗摸索，如PCR反應混合物中各成分比例，PCR循環條件，雜交溫度，雜交時間等及主要試劑配方，如雜交液，洗液等(配方詳見以下實施例)，均為經過梯度實驗后得到的優良比例。PCR循環條件，尤其是退火時間及延伸時間亦為梯度實驗后選出的優良條件。血液重要致病菌檢測基因芯片的實驗流程亦為優化后結果。另外，本發明使用的從臨床樣品(陽性或陰性，即是全自動血液培養儀報警后的陽性或陰性血培養物)提取細菌基因組的方法為堿洗/熱裂解的方法(詳見以下實施例所述)，該方法能有效地從血培養物中提取細菌基因組，適用于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌。該方法還能夠消除血培養物中對后續反應(主要是PCR)的抑制劑，并且具有較高的靈敏度。本發明的檢測方法為提取待測樣品基因組后，經過PCR雙鏈擴增，純化雙鏈PCR產物，利用下游引物PCR單鏈標記，純化單鏈PCR產物，得到標記產物，將標記產物與雜交液l:l混合加于基因芯片上的探針陣列固定區域，5(TC水浴雜交1.5小時，雜交完成后，用配制好的洗液按離子強度由高到低的順序對基因芯片進行洗漆，風干后，在635nm、532nm波長下掃描芯片，得到靶序列與芯片雜交的圖譜和數據信息，通過計算機軟件分析，判斷出感染細菌的種類。以下為利用上述制備好的基因芯片檢測血液致病菌的較佳實施例，詳細說明如下1.芯片的預雜交(1)將上述紫外交聯的芯片放入500ml42。C預熱的預雜交液中，42°C靜置1小時。預雜交液配方1%BSA(牛血清蛋白)(W/V)5xSSC(氯化鈉-檸檬酸鈉溶液)0.1%SDS(十二烷基硫酸鈉)(W/V)(2)在ddH20中提洗1分鐘兩次，95%乙醇脫水2分鐘，冷風吹干，備用o2.樣品來源陽性樣品臨床采集患者靜脈血5ml注入血培養瓶中，35。C培養一定時間至全自動血液培養儀報警后的陽性血培養物。(注研究中的陽性樣品來自美國BD和法國梅里埃血培養儀)陰性樣品全自動血液培養儀報警為陰性的血培養物。3.樣品提取(1)取450^d臨床樣品加入到1.5ml螺口離心管中。(2)加入900pl樣品提取液I(0.5M氫氧化鈉，0.05M檸檬酸鈉)，反復顛倒混勻IO分鐘。(3)13，000xg離心5分鐘，立刻傾倒上清。(4)沉淀用500jil樣品提取液I1(0.5MTris-HClpH8.0)重懸。(5)13,000xg離心5分鐘，立刻傾倒上清。(6)沉淀用50(^1樣品提取液II重懸。(7)13，000xg離心5分鐘，棄上清。(8)沉淀用100i!l樣品提取液in(10mMTris-HClpH8.0，lmMEDTA)重懸，IO(TC煮沸IO分鐘。(9)13,000xg離心15分鐘，取上清60|il轉移到一個新的1.5ml滅菌離心管中，進行后續PCR反應或-20。C儲存。4.擴增和標記(1)PCR雙鏈擴增取上述步驟3得到的提取物3^1加入到雙鏈擴增PCR反應混合液中，雙鏈擴增PCR反應混合液的配方如下表3所示。表4雙鏈擴增PCR反應混合液配方成分來源濃度加樣量(pl)PCR緩沖液大連寶生物rTaq自帶10x3dATP大連寶生物100mM0.024dCTP大連寶生物100mM0.024dGTP大連寶生物訓mM0.024dTTP大連寶生物訓mM0扁■P上海生工勵mM0細Taq酶寶生物0.4DNaseI大連寶生物70，10.07引物1上海生工lOO(xM0.08引物2上海生工lOOpM0.08UNG酶上海生工1，0.1ddH20Millipore-23.174S共40個循環注上表中引物1和引物2為表2中所列的引物。將反應管放入PCR儀(Biometra)中，設定的循環參數如下37°C15分鐘94°C10分鐘94°C40秒50°C40秒72°C40秒72°C5分鐘4°C20小時(2)雙鏈PCR產物的純化將上述步驟(1)中擴增得到的雙鏈PCR產物，加入純化柱(MILLIPORE公司)內，補水至400(^1，1,000xg，離心15分鐘，棄液，在純化柱膜上加30^1ddH20，37'C靜置5分鐘，將純化柱倒扣在一新的1.5ml離心管上，l,OOOxg，離心2分鐘，離心所得的溶液即為雙鏈PCR的純化產物。(3)PCR單鏈標記取上述步驟(2)中得到的雙鏈PCR純化產物lOpl加入到單鏈標記PCR反應混合液中，單鏈標記PCR反應混合液的配方如下表4所示。表5:單鏈標記PCR反應混合液配方成分濃度加樣量(W)PCR緩沖液10xdATPlOOmMO週dCTPlOOmM0.024<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注上表中引物2為表2中所列的引物。將反應管放入PCR儀(Biometra)中，設定的循環參數如下94°C10分鐘94°C40秒50°C40秒72°C40秒'72°C5分鐘4°C20小時(4)獲得單鏈PCR5.雜交雜交反應液的制備上述步驟4獲得的單鏈PCR產物8pl，5(TC預熱的2x雜交液8[！1，混合均勻，離心消泡備用。取上述實施例三中制備好的基因芯片置于雜交盒(博奧公司)內，蓋上定制的蓋片(博奧公司)，將制備好的雜交反應液點在該芯片的探針陣列區域，注意蓋片和芯片之間不能有氣泡，蓋緊雜交盒，放入5(TC水浴鍋中1.5h。雜交結束后，取出雜交盒，去除蓋片，分別依次在洗液A中洗滌3分鐘，洗液B中洗滌3分鐘，洗液C中洗滌1.5分鐘，并在空氣中風干。雜交液配方10%硫酸葡聚糖(dextranSulfate);25°/。甲酰胺(fo醒mide);0.1%SDS;6xSSPE洗液A:lxSSC，0.1%SDS洗液B:0.05xSSC洗液C:95%乙醇6.掃描使用GenePixPersonal4100A生物芯片掃描儀，運行GenePixPro4.1程序，選擇635nm和532nm雙通道，PMT值調至600，掃描結果存為JPG,TIF格式的文件。用上述制備好的基因芯片分別檢測樣品為上述10類細菌時的雜交掃描結果如圖3A-圖3J所示。其中圖3A-圖3J分別表示的樣品為A、粘質沙雷氏菌，B、糞腸球菌，C、大腸桿菌，D、金黃色葡萄球菌，E、克雷伯氏氏菌/腸桿菌，F、銅綠假單胞菌，G、屎腸球菌，H、凝固酶陰性葡萄球菌，I、肺炎鏈球菌，J、弗氏檸檬酸桿菌。調用套圈文件，獲取每一個探針位點的熒光強度值，并將結果儲存為.gpr文件，如圖4A和圖4B所示。7.結果判讀1.安裝與使用結果判讀軟件BactarrayAnalyzer(由天津生物芯片技術有限責任公司開發)。2.運行BactarrayAnalyzer程序，并輸入用戶名、密碼。3.點擊工具欄上的"新建項目"按鈕新建一個項目，然后按"導入文件"導入待分析的.gpr文件。按下Ctrl鍵，可同時選擇并打開多個文件。4.點擊"處理數據"按鈕，軟件將會自動生成一個處理過程的記錄文件。在"文件列表"頁面點擊文件名，報告頁面會自動切換到該文件的分析結果報告。分析結果報告已被自動保存在本項目所在目錄之下。5.結果判讀如圖5所示，報告給出送檢文件名稱、樣品編號、結果、微生物名、可信度、分值、特異探針雜交率、熒光強度、軟件判讀日期、軟件操作人等信息。其中，"微生物"項即為菌血癥中檢測到的細菌名。實施例五:對基因芯片進行特異性鑒定選取了64種較為常見的血液致病菌，利用它們的16SrRNA序列構建系統進化樹。系統進化樹可以清晰地顯示各種菌株之間的進化關系，以及該芯片所檢測的10類細菌所處的進化位置。利用得到的這一分析結果，我們選用與靶標細菌進化關系非常接近的一些細菌進行特異性實驗。如能準確區分這些近緣細菌，則說明探針有較高的特異性，也就必然可以區分其它進化關系更遠的遠緣細菌。本實施例選用的構建進化樹的64種細菌包括1Acinetobactercalcoaceticussubsp.anitratus醋酸鈣不動桿菌石肖酸鹽陰性亞禾中；2Adnetobacterbaumannii鮑氏不動木干菌；3Acinetobactercalcoaceticus酉昔酸f丐不動桿菌；4Aerococcusviridans綠色氣球菌；5Alcaligenesfaecalissubsp.faecalis類產石僉桿菌類亞禾中；6Achromobacterxylosoxidanssubsp.xylosoxidans氧化木糖無色桿菌氧化木糖亞種；7Bacilluscereus蠟樣芽胞桿菌；8Bacillussubtilissubsp.subtilis枯草桿菌枯草亞禾中；9Bacteroidesfragilis脆弱擬桿菌；10Brucellamelitensisbiovarabortus馬爾他布魯氏桿菌流產生物型；11Brucellamelitensis馬爾他布魯氏桿菌；12Brucellamelitensisbiovarneotomae馬爾他布魯氏桿菌木鼠生物型；13BrucellamelitensisbiovarOvis馬爾他布魯氏桿菌羊生物型；14Corynebacteriumdiphtheriae白喉棒桿菌；15Citrobacterfreundii弗氏檸檬酸桿菌；16Clostridiumperfringens產氣莢膜梭狀芽胞桿菌；17Enterobacteraerogenes產氣腸桿菌；18Pantoeaagglomerans成團泛菌；19Enterobactercloacaesubsp.cloacae陰溝腸桿菌陰溝亞種；20Enterobacterhormaechei霍氏腸桿菌；21Enterococcusfaecalis糞腸球菌；22Enterococcusfaecium屎腸球菌；23Enterococcusgallinarum鵓雞腸球菌；24Escherichiacoli大腸桿菌；25Haemophilusinfluenzae流感嗜血桿菌；26Hafoiaalvei蜂房哈夫尼亞菌；27Klebsiellaoxytoca產酸克雷伯氏菌；28Klebsiellapneumoniae肺炎克雷伯氏菌；29Listeriamonocytogenes單核增生李其j特氏菌；30Micrococcusluteus藤黃微球菌；31Mycobacteriumtuberculosis結核分枝桿菌；32Neisseriagonorrhoeae淋病奈瑟菌；33Propionibacteriumacnes短小棒狀桿菌；34Proteusmirabilis奇異變形桿菌；35Pseudomonasaeruginosa銅綠假單胞菌；36Pseudomonasfluorescens熒光假單胞菌；37Pseudomonasfluorescens熒光假單胞菌；38Pseudomonasputida惡臭假單胞菌；39Pseudomonasstutzeri施氏4叚單胞菌；40Streptococcusagalactiae無乳鏈球菌；41Streptococcussalivarius唾液鏈球菌；42Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphi傷寒沙門氏菌；43Salmonellaentericasubsp.enterica腸道沙門氏菌沙門亞禾中；44Serratiamarcescenssubsp.marcescens粘質沙雷氏菌粘質亞種；45Sphingobacteriummultivorum多食鞘氨醇桿菌；46Staphylococcusaureussubsp.aureus金黃色葡萄球菌金黃色亞禾中；47Staphylococcuscohniisubsp.cohnii科氏葡萄球菌禾斗氏亞禾中；48Staphylococcusepidermidis表皮葡萄球菌；49Staphylococcushaemolyticus溶血性葡萄球菌；50Staphylococcushominissubsp.hominis人葡萄球菌人亞禾中；51Staphylococcusintermedius中間葡萄球菌；52Staphylococcussaprophyticussubsp.saprophyticus腐生葡萄球菌腐生亞禾中；53Staphylococcussciurisubsp.sciuri松鼠葡萄球菌松鼠亞禾中；54Staphylococcussimulans模仿葡萄球菌；55Staphylococcusxylosus木糖葡萄球菌；56Stenotrophomonasmaltophilia嗜麥芽窄食單胞菌；57Streptococcusoralis口腔鏈球菌；58Streptococcuspneumoniae月市炎鏈球菌；59Streptococcuspyogenes"[七膿'性f連球菌；60Tetragenococcusdoogicus;61Tetragenococcuskoreensis;62Aeromonashydrophilasubsp.hydrophila嗜水氣單胞菌嗜水亞種；63Moraxella(Branhamella)catarrhalis卡他莫拉菌感；64Lactobacillusacidophilus嗜酸乳桿菌，具體參見圖6。通過449次雜交實驗，證明該芯片可以準確區分同源性在95%至95.5%之間的糞腸球菌、屎腸球菌和鶉雞腸球菌(進化樹中位置23，24，25);同源性為97.4%的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(進化樹中位置:52和54);同源性為92.1%的肺炎鏈球菌和唾液鏈球菌(進化樹中位置47和64);同源性為93.0%的銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌(進化樹中位置41和42);同源性94%至97.1%之間的大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、粘質沙雷氏菌和沙門氏菌(進化樹中位置26、31、50、48和49)。另外，本實施例還利用一些較遠緣的細菌，如嗜麥芽寡養單胞菌、不動桿菌、腐生葡萄球菌和蜂窩哈夫尼亞氏菌進行了特異性實驗，均取得很好的結果。本檢測芯片可以在24小時內完成檢測中國常見的9類致病菌。從2005年3月到2006年1月共完成647例本芯片檢測范圍內細菌感染患者的臨床標本，具體情況見下表完成例數傳統檢測和芯片檢測結果符合率芯片檢測正確率64774.65%98.6%傳統檢測和芯片檢測結果符合率是指傳統檢測和芯片檢測符合的例數占整個病例數的比例。對于不符合的病例，將進行16S測序驗證。芯片檢測正確率經16SrDNA測序驗證后，證明芯片檢測結果正確的例數占整個病例數的比例。雖然本發明己以較佳實施例披露如上，但并非用以限定本發明，任何所屬
技術領域：
的技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，可以作些許的更動與改進，因此本發明的保護范圍當以權利要求所界定者為準。序列表<110>天津生物芯片技術有限責任公司<120>用于血液致病菌檢測的基因芯片和檢測用試劑盒<130>5P13002-CN<160>37<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>49<212>DNA<213>選自金黃色葡萄球菌的"wc基因序列<400>1tttttttttttttttttttttttttaacggacgagaagcttgcttctct<210>2<211>49<212>DNA<213>選自金黃色葡萄球菌的"w基因序列<400>2ttttttttttttttttttttttttttgatacacctgaaacaaagcatcc<210>3<211>49<212>DNA<213>選自金黃色葡萄球菌的m/c基因序列<400>3tttttttttttttttttttttttttttgtgtagagaaatatggtcctga<210>4<211>49<212>DNA<213>選自金黃色葡萄球菌的16SrRNA基因序列<400>4ttttttttttttttttttttttttttttgacaaaggtcaaagaactgat<210>5<211>49<212>DNA<213>選自肺炎鏈球菌的16SrRNA基因序列<400>5tttttttttttttttttttttttttttgttagaccctttccggggttta<210>6<211>49<212>DNA<213>選自肺炎鏈球菌的16SrRNA基因序列<400>6tttttttttttttttttttttttttaagagtagatgttgcatgacattt<210>7<211>49<212>DNA<213>選自肺炎鏈球菌的16SrRNA基因序列<400>7ttttttttttttttttttttttttttgtgagagtggaaagttcacactg49494949494949<210>8<211>49<212>DNA<213>選自凝固酶陰性葡萄球菌/金黃色葡萄球菌的16SrRNA基因序列<400>8tttttttttttttttttttttttttttcctacctataagactgggataa49<210>9<211>49<212>DNA<213>選自凝固酶陰性葡萄球菌/金黃色葡萄球菌的16SrRNA基因序列<400>9tttttttttttttttttttttttt加taacttcgggaaaccggagct49<210>10<211>49<212>DNA<213>選自凝固酶陰性葡萄球菌/金黃色葡萄球菌的16SrRNA基因序列<400>10tttttttttttttttttttttttt加tgtcacttatagatggacccg49<210>11<211>49<212>DNA<213>選自銅綠假單胞菌的16SrRNA基因序列<400>11ttttttttttttttttttttttttttcatacgtcctgagggagaaagtg49<210>12<211>49<212>DNA<213>選自銅綠假單胞菌的16SrRNA基因序列<400>12tttttttttttttttttttt加gggcagtaagttaataccttgctgt49<210>13<211>49<212>DNA<213>選自銅綠假單胞菌的16SrRNA基因序列<400>13ttttttttttttttttttttttttttatgaagggagcttgctcctggat49<210>14<211>49<212>DNA<213>選自銅綠假單胞菌的16SrRNA基因序列<400>14tttttttttttttttttttttmtttttccgttgggatccttgagatc49<210>15<211>49<212>DNA<213>選自粘質沙雷氏菌的16SrRNA基因序列<400>15tttttttttttttttttttttttttttacgctcatcaattgacgttact49<210>16<211>49<212>DNA<213>選自粘質沙雷氏菌/弗氏檸檬酸桿菌的16SrRNA基因序列<400>16ttttttttttttttttttttttttttgcacaggggagcttgctccctgg49<210>17<211>49<212>DNA<213>選自粘質沙雷氏菌的16SrRNA基因序列<400>17ttttttttttttttttttttttttggtggtgaacttaatacgttcatca49<210>18<211>49<212>DNA<213>選自克雷伯氏菌/腸桿菌的16SrRNA基因序列<400>18ttttttttttttttttttttttttggcgataaggttaataaccttgtcg49<210>19<211>49<212>DNA<213>選自克雷伯氏菌/腸桿菌/弗氏檸檬酸桿菌的16SrRNA基因序列<400>19Tttttttttttttttttttttttttttagcacagagagcttgctctcgg49<210>20<211>49<212>DNA<213>選自克雷伯氏菌/腸桿菌/粘質沙雷氏菌/大腸桿菌/弗氏檸檬酸桿菌的16SrRNA基因序列<400>20tttttttttttttttttttttttttcaaagtgggggaccttcgggcctc49<210>21<211>49<212>DNA<213>選自大腸桿菌/粘質沙雷氏菌/克雷伯/腸桿菌/弗氏檸檬酸桿菌的16SrRNA基因序列<400>21tttttttttttttttttttt加tttttcttgccatcggatgtgccca<210>22<211>49<212>DNA<213>選自大腸桿菌的16SrRNA基因序列<400>22tttttttttttttttttttttttagggagtaaagttaatacctttgctc<210>23<211>49<212>DNA<213>選自大腸桿菌的16SrRNA基因序列<400>23tttttttttttttttttttt加ttcaggaaacagcttgctgtttcgc<210>24<211>49<212>DNA<213>選自大腸桿菌的16SrRNA基因序列<400>24ttttttttttttttttttttttttttcaggaagaagcttgcttctttgc49<210>25<211>49<212>DNA<213>選自屎腸球菌的16SrRNA基因序列<400>25tttttttttttttttttttt臓atgagagtaactgttcatcccttg49<210>26<211>49<212>DNA<213>選自屎腸球菌的16SrRNA基因序列<400>26ttttttttttttttttttttttttttcaaaaccgcatggttttgatttg49<210>27<211>49<212>DNA<213>選自糞腸球菌的16SrRNA基因序列<400>27tttttttttttttttttttttttttacgttagtaactgaacgtcccctg49<210>28<211>49<212>DNA<213>選自糞腸球菌的16SrRNA基因序列<400>28tttttttttttttttttttttttt加atgccgcatggcataagagtg49<210>29<211>49<212>DNA<213>熒光探針序列<400>29tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt臓49<210>30<211>49<212>DNA<213>陰性對照探針序列<400>30tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt臓49<210>31<211>49<212>DNA<213>陽性對照探針序列<400>31加加tttttttttttttttttttttttactcctacgggaggcagc49<210>32<211>20<212>DNA<213>檢測探針上游引物序列<400>32agagtttgatcatggctcag20<210>33<211>20<212>DNA<213>檢測探針上游引物序列<400>33agagtttgatcctggctcag20<210>34<211>20<212>DNA<213>檢測探針下游引物序列<400>34ccgtcaattcatttaagttt20<210>35<211>20<212>DNA<213>檢測探針下游引物序列<400>35ccgtcaattcatttgagttt20<210>36<211>20<212>DNA<213>檢測探針下游引物序列<400>36ccgtcaattcctttaagttt20<210>37<211>20<212>DNA<213>檢測探針下游引物序列<400>37ccgtcaattcctttgagttt20權利要求1.一種用于血液致病菌檢測的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特征在于所述的寡聚核苷酸探針包括從一類或幾類血液致病菌的16SrRNA基因序列和nuc基因序列中選取的DNA片段。2.根據權利要求l所述的基因芯片，其特征在于所述的DNA片段包括SEQIDNO:1-SEQIDNO:28的至少一種。3.根據權利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸探針還包括陽性對照探針、陰性對照探針和熒光探針。4.根據權利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述的熒光探針具有SEQIDNO:29的核苷酸序列。5.根據權利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述的陰性對照探針具有SEQIDNO:30的核苷酸序列。6.根據權利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述的陽性對照探針具有SEQIDNO:31的核苷酸序列。7.根據權利要求l-4任一項所述的基因芯片，其特征在于所述的一類或幾類血液致病菌選自金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌屬、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌、克雷伯氏菌/腸桿菌、大腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、弗氏檸檬酸桿菌。8.根據權利要求7所述的基因芯片，其特征在于所述的克雷伯氏菌/腸桿菌包括肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌。9.權利要求1所述的基因芯片的應用，其特征在于該基因芯片用于金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌屬、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌、克雷伯氏菌/腸桿菌、大腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、弗氏檸檬酸桿菌血液致病菌的至少一種的檢測，其中所述的克雷伯氏菌/腸桿菌包括肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌。10.根據權利要求9所述的基因芯片的應用，其特征在于所應用的檢測微十包括SEQIDNO:32-SEQIDNO:37中的至少一種。11.一種用于血液致病菌檢測的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括權利要求l所述的基因芯片。12.根據權利要求11所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括SEQIDNO:32-SEQIDNO:37的檢測探針的至少一種。13.根據權利要求12所述的試劑盒,其特征在于所述的試劑盒還包括雜交盒、雜交液和分析鑒定結果用的判讀軟件以及說明書。14.權利要求11-13任一項所述的試劑盒的應用，其特征在于所述的試劑盒用于金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌屬、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌、克雷伯氏菌/腸桿菌、大腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、弗氏檸檬酸桿菌血液致病菌的至少一種的檢測，其中所述的克雷伯氏菌/腸桿菌包括肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌。全文摘要本發明涉及一種用于血液致病菌檢測的基因芯片和檢測用試劑盒，該基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其中所述的寡聚核苷酸探針包括從一類或幾類血液致病菌的16SrRNA基因序列和nuc基因序列中選取的DNA片段。本發明的試劑盒包括所述的基因芯片。用所述的基因芯片進行雜交，根據雜交信號，可檢測出血液中的致病菌。利用本發明的基因芯片可達到檢測血液致病菌的目的，操作簡便，準確性高，重復性強，在24小時內能給出檢測結果，對于臨床醫生的用藥有一定的指導意義。文檔編號C12Q1/04GK101407837SQ20071016400公開日2009年4月15日申請日期2007年10月12日優先權日2007年10月12日發明者露馮,曹勃陽,磊王,韓巍青申請人:天津生物芯片技術有限責任公司