專利名稱：一個與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記及其建立方法
技術領域：
本發明涉及分子標記的建立方法，尤其涉及與亞麻抗銹病基因相連鎖 的分子標記的建立方法。
背景技術：
亞麻(￡/"Mmww'totow>m^L.)是重要的纖維和油料作物。亞麻的莖稈 可以剝取高檔纖維用于紡織業，籽粒可以榨制富含高不飽和脂肪酸的營養 保健油品。隨著人們生活水平的提高，發展亞麻生產顯得越來越重要。長 期以來亞麻生產受到許多病害的影響，其中由亞麻銹病菌(^fe/"m;wora Ehrenb丄ev.)引起的銹病是世界性的亞麻病害。篩選和培育抗病品種是防治 亞麻銹病最為經濟、安全和有效的方法。
但是，目前抗銹病亞麻品種的選育都是依靠傳統的育種方法，需要在 田間進行銹病抗性的選擇鑒定，周期長，工作量大。另外，抗銹病性狀受 遺傳背景及環境因素影響較大，給依靠表型選擇造成了困難。近幾年發展 起來的分子標記輔助育種技術，為植物育種學家提供了一條新的途徑。該 技術是將分子標記技術與傳統育種學相結合，用穩定、可靠的DNA分子標 記代替易受環境影響的表型標記，對育種材料進行篩選。利用分子標記輔 助育種的關鍵是篩選到與目標基因緊密連鎖的分子標記，因此，開發研究 一個與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記的建立方法，以滿足有關方面的 需要，將具有十分重要的意義。

發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一個與亞麻抗銹病基因相連鎖的分 子標記及其建立方法，以滿足有關方面的需要。 本發明的技術構思是這樣的
本發明根據"群體分離分組法(bilked segregant analysis, BSA)"的原 理，利用亞麻抗銹病材料與感銹病材料的雜交分離群體，通過RAPD技術 開展亞麻抗銹病基因分子標記研究，尋找與亞麻抗銹病基因連鎖的RAPD 標記，以用于亞麻抗銹病的早期鑒定和針對該特性的分子標記輔助育種。
1、 本發明所說的與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記，其特征在于， 所述的分子標記OPA18432，是用下述方法得到的
(1) 、按照潘家駒主編的《作物育種學總論》(中國農業出版社2003年 出版)所敘述的亞麻雜交和自交方法，將上海市農業科學院園藝研究所保 存的的亞麻高抗銹病的親本NM4和高感銹病親本Bison進行雜交，得到Fl 代，再經過自交獲得F2分離群體。
(2) 、用SDS方法(在本文的具體實施方式
中有詳細描述)提取F2代 單株的DNA，并選取10株高抗銹病的單株DNA等量混合為抗病池(R池)， 選取10株高感銹病的單株DNA混合為感病池(S池)；
(3) 、利用兩個親本和兩個基因池篩選引物，再利用獲得的候選引物對 F2代單株進行PCR擴增，驗證多態片段的穩定性；
(4) 、篩選出的分子標記OPA18432，經過連鎖性鑒定，與亞麻抗銹病基 因相連鎖。
2、 與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記是采用RAPD分子標記進行篩選的，具體的方法是
(1) 、親本間和基因池間DNA多態性分析
采用上海生工生物工程有限公司合成的10bp寡核苷酸作為隨機引物，
在Mastercycler 5333型PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20 pl， 其中25 mmol/L MgCl22.0^il， 10XPCRBuffer 2.0 pl， 10 mmol/L dNTP 0.5 |_d， 5 U/ Taq E 0.5 ^tl， 20ng / pi Primer 2.0 |il， 10ng/ pi模板DNA 3 pl，滅菌
雙蒸水10 pi,加蓋一滴礦物油進行擴增。擴增程序為9fC預變性5 min; 94。C變性lmin， 37。C退火1 min， 72。C延伸1.5 min， 40個循環；72。C延伸 10 min后15'C保存。RAPD擴增產物電泳分析采用濃度為15 g/L的瓊脂糖 凝膠(含0.15 ng/L EB)，電泳緩沖液為lxTAE，保持90 V恒壓(4~5 V/cm) 電泳1.5 2h，凝膠成像儀成像分析。
(2) 、分子標記的連鎖性鑒定
在同一條件下鑒定F2代分離群體的銹病發生情況。用Mapmaker/3.0軟 件對分離群體單株的銹病抗性和分子標記的分離數據進行連鎖分析，利用 Kosambi函數將重組率轉化為遺傳圖距cM ( centimorgan )。所說的 Mapmaker/3.0軟件在生物谷網站(http:〃www.bioon.com/Soft)可以下載。
本發明的與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記，可用于亞麻抗銹病的 早期鑒定和針對該特性的分子標記輔助育種。
有益效果
本發明利用分子標記方法得到與亞麻抗銹病基因緊密連鎖的分子標 記，可以用于亞麻抗銹病的早期鑒定和針對該特性的分子標記輔助育種， 有效地克服了常規鑒定方法所需時間周期長的缺點。同時也可利用這個標記進一步克隆抗銹病基因、并對其進行結構和功能分析，這對于進一步了 解亞麻抗銹病的分子遺傳學機理有積極意義。因此，本研究結果在亞麻育 種實踐及抗銹病理論研究上都很有價值。


圖l:隨機引物OPA18的RAPD擴增結果。
圖中1泳道是NM4; 2泳道是Bison; 3泳道是抗病池；4泳道是感病 池；5 14泳道是抗病株；15 24泳道是感病株；M是DL-2000分子量標準。
具體實施例方式
本發明的具體實施程序是利用亞麻高抗銹病親本NM4與高感銹病親 本Bison進行雜交得到Fl代，再經過自交獲得F2分離群體。提取F2分離 群體單株數共計96株，其中抗病單株79株，感病單株17株。
1、提取DNA
按如下程序提取亞麻單株材料的基因組DNA:
取新鮮組織2g，在液氮中研磨成粉，置于50ml離心管，加入8ml提 取液(100mMTrispH8.0, 50mMEDTA， 500mMNaCl， 1.5%SDS)， 65°C 情況下30分鐘，不時顛倒混勻，加2.5 ml 5M乙酸鉀冰浴10分鐘，加5 ml 氯仿，顛倒混勻，10000rmp離心8分鐘，取上清移入新管，加2 / 3體積預 冷異丙醇，顛倒混勻，-20。C置l-2小時，挑出絮狀白色DNA， 70%乙醇洗 1-2次，吹干，溶于100ul(或適量)TE中，并在1%瓊脂糖凝膠上電泳，用 標準XDNA作對照，估算亞麻DNA樣品的濃度，獲得高純度亞麻DNA。 從提取的樣品中選取10株高抗銹病的單株DNA等量混合為抗病池(R池)， 選取10株高感銹病的單株DNA混合為感病池(S池)；2、隨機擴增多態性DNA(RAPD)分析
(1) 、 PCR擴增
RAPD引物購自上海生工生物工程公司，共計520個。
反應體系為20 |il，其中25 mmol/LMgCl22.0^1， 10XPCRBuffer 2.0 (xl，
10 mmol/L dNTP 0.5 |il， 5 U/ (iL Taq E 0.5 pl， 20ng / |al Primer 2.0 pl， 10ng/ )il
模板DNA3(il，滅菌雙蒸水10pl，加蓋一滴礦物油，在Mastercycler 5333
型PCR儀上進行擴增。
反應程序為94"C預變性5 min; 94。C變性1 min， 37"退火1 min， 72
。C延伸1.5min， 40個循環;72'C延伸10 min后15'C保存。
(2) 、電泳檢測
RAPD擴增產物電泳檢測采用濃度為15 g/L的瓊脂糖凝膠(含0.15 ng/L EB)，電泳緩沖液為lxTAE，保持90 V恒壓(4-5 V/cm)電泳1.5 2h，凝膠 成像儀成像分析。
(3) 、引物篩選結果
用520個10堿基隨機引物對NM4和Bison兩份親本材料進行RAPD 分析，有445個引物能擴增出條帶，占擴增引物總數的85.6%，擴增片段大 小在300bp到2000bp之間。經多次重復試驗，只有OPA18、 OPC06兩個 引物能擴增出NM4材料特有的多態帶。
利用NM4XBison雜交組合F2代的抗病池(R)和感病池(S)對OPA18 和OPC06兩個引物的擴增反應進行驗證。結果OPA18引物在兩親本和兩 池間均能穩定地擴增出多態性，在抗病親本和抗病池顯示出432bp大小的 特異擴增帶。OPC06引物在兩池間沒有擴增出差異，故沒有對OPC06進行進一步分析。
用引物OPA18對NM4、 Bison、 R池、S池和組成抗、感基因池的20 個F2單株進行擴增反應，所有抗性植株均能給出432bp的特異擴增帶，而 感病植株沒有相應的擴增帶(圖1)。圖中1泳道是NM4; 2泳道是Bison; 3泳道是抗病池；4泳道是感病池；5 14泳道是抗病株；15~24泳道是感病 株；M是DL-2000分子量標準。
進一步對BisonXNM4雜交組合F2代群體的96個單株進行RAPD分 析，結果79株抗病單株中有77株擴增出432bp的片段，2株抗病單株和 17株感病單株沒有擴增出相應片段。利用Kasambi公式計算該RAPD標記 和M4基因之間的遺傳圖距為2.1cM，有連鎖關系。
權利要求
1. 一個與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記，其特征在于，所述的分子標記OPA18432，是用下述方法得到的(1)、利用亞麻高抗銹病親本NM4與高感銹病親本Bison進行雜交得到F1代，再經過自交獲得F2分離群體；(2)、用SDS方法提取F2代單株的DNA，并選取10株典型的高抗銹病的單株DNA等量混合為抗病池(R池)，選取10株高感銹病的單株DNA混合為感病池(S池)；(3)、利用兩個親本和兩個基因池篩選引物，再利用獲得的引物對F2代單株進行PCR擴增；(4)、篩選出分子標記OPA18432。
2、 根據權利要求1所述的與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記，其特 征在于，是采用RAPD分子標記進行篩選的，具體的方法是(1)、親本間和基因池間DNA多態性分析以10bp寡核苷酸作為隨機引物，進行PCR擴增，PCR反應體系為20 pl ， 其中25 mmol/L MgCl22.0^il， 10 X PCR Buffer 2.0 |il， 10 mmol/L dNTP 0.5 pl， 5 U/ fiL Taq E 0.5 (il， 20ng / jal Primer 2.0 (xl， 10ng/ |xl模板DNA 3 (xl，滅菌 雙蒸水10 pd，加蓋一滴礦物油進行擴增，擴增程序為94"C預變性5 min; 94。C變性lmin， 37。C退火1 min， 72。C延伸1.5 min， 40個循環;72。C延伸 10 min后15t:保存。RAPD擴增產物電泳分析采用濃度為15 g/L的瓊脂糖 凝膠(含0.15 ng/L EB)，電泳緩沖液為"TAE，保持90 V恒壓(4 5 V/cm) 電泳1.5 2h，凝膠成像儀成像分析；(2)、分子標記的連鎖性鑒定在同一條件下鑒定F2代分離群體的銹病發生情況，用Mapmaker/3.0 軟件對分離群體單株的銹病抗性和分子標記的分離數據進行連鎖分析，利 用Kosambi函數將重組率轉化為遺傳圖距cM (centimorgan)。
3、 一種與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記，其特征在于所說的分子 標記為OPA18432。
4、 根據權利要求3所述的與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記的應用， 其特征在于，用于亞麻抗銹病的早期鑒定和針對該特性的分子標記輔助育 種。
全文摘要
本發明公開了一個與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記的建立方法。本發明克服常規標記方法工作量大、易受環境影響、周期長等缺點。采用RAPD分子標記方法對高抗銹病和高感銹病的亞麻親本及其雜交后代“NM4×Bsion”進行抗銹病基因標記的篩選。PCR反應采用的是上海生工生物工程有限公司合成的10bp寡核苷酸隨機引物，篩選后得到與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記OPA18₄₃₂。該標記可用于亞麻抗銹病的早期鑒定和針對該特性的分子標記輔助育種，本發明對亞麻育種實踐及抗銹病理論研究都很有價值。
文檔編號C12Q1/68GK101445823SQ20071017112
公開日2009年6月3日 申請日期2007年11月28日 優先權日2007年11月28日
發明者洋 薄 申請人:洋 薄