專利名稱：與谷子株高基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0641的制作方法
與谷子株高基因緊密連鎖的分子標(biāo)記Sl SV0641技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)記，具體地，涉及一種與谷子株高基 因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明還涉及該分子標(biāo)記的引物、該分子標(biāo)記在谷子株高基因定 位或谷子遺傳育種中的用途、一種谷子株高基因定位方法、以及一種谷子育種方法。
背景技術(shù)：
谷子(Setaria italica L. Beauv.)是起源于我國的重要糧食作物，主要在我國的 北方種植，在國家糧食生產(chǎn)和糧食安全中占有較為重要的地位。谷子是二倍體自花授粉作 物，其基因組較小，約470Mb，這些特性使其很適合作為基因組研究的對象。
目前，遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建已成為基因定位、圖位克隆以及基因組結(jié)構(gòu)與功能研 究的重要基礎(chǔ)。而分子標(biāo)記又是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的基礎(chǔ)。株高作為關(guān)系到作物高產(chǎn)和穩(wěn) 產(chǎn)的重要農(nóng)藝性狀，直接關(guān)系到品種的株型、抗倒伏性、區(qū)域布局和產(chǎn)量構(gòu)成性狀。因此，迫 切需要發(fā)現(xiàn)與谷子株高基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人依據(jù)全基因組序列，經(jīng)過大量的實驗和不懈的努力，提供了一種與谷子 (Setaria italica L. Beauv.)株高基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0641，并由此提供了下述 發(fā)明
本發(fā)明的一個方面涉及一種與谷子株高基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0641，其核 苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。其中加邊框部分為引物設(shè)計區(qū)段
520bp
IctCACTGCAAGACTCGACCT] cggcaggcatttatgcgctggctgcatcctgcacctcctccctcTCCCTCGCCCTGGTTTTGCTTGCGAGAGAGGCCAAAATGGCAGGAGACTATTATATAAAGTCTGCCCTGGCCATGTC TCTGAATCTGAGGGGGCGTTTTCTTCCCGTGTCTTATTTTTAGCACGTGTCACATCGAATGTTTAGATACTAATTAG GAGTAGTAAACGTAGACTATTTACAAAACCAATTACATAAGTGGAATCTAAACGGCGAGACGAATCTATTAAGCCTA ATTAATCCATCATTAGCAAATATTTACTGTAGCAACACATTGTCAAATCATGGACTCCTTTCCCTGTTGTTTTCTTG GTTGCAACTAGCGCCGTGCCACTTGGCTACTTGCGTGCGTTCAGCGAGCGTGCAGCCGTGCAGGTGCTTATATAGGTAGTAGAGGTCCAGAGCTACTAGCTAGGGATAGCAGACGGGCATGCAGTGGC |AATGGCATGGATGGGAl |AGCG(SEQ ID NO 1)
在本發(fā)明中，術(shù)語“與谷子株高基因緊密連鎖的分子標(biāo)記”是指這樣的分子標(biāo)記， 在遺傳連鎖圖譜中，該分子標(biāo)記與谷子株高基因的遺傳連鎖距離小于2cM或者小于3cM;或 者在谷子的大于400個樣本中，非矮株型的樣本中含有該分子標(biāo)記。
本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標(biāo)記的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示
SIsv0641F CTCACTGCAAGACTCGACCT(SEQ ID NO 2)
SIsv0641R :CGCTTCCCATCCATGCCATT(SEQ ID NO :3)。
本發(fā)明的分子標(biāo)記也可以為含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA片段；該 DNA片段的長度為適當(dāng)長度，但并不特別限定，例如，小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于 2，OOObp、小于 1，500bp、小于 1，200bp、小于 1，OOObp、或者小于 800bp。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標(biāo)記(含有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列 的DNA片段)為谷子基因組中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SEQ ID NO 1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因組中的序列，優(yōu)選地，為谷 子基因組中SEQID NO :1的5’端和/或3’端的上下游序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解， 只要擴(kuò)增或者檢測谷子基因組DNA中的該分子標(biāo)記，必然能夠檢測或擴(kuò)增得到含有SEQ ID N0:1所示的序列。SEQ ID NO :1的5，端和/或3，端的上下游序列的長度為適當(dāng)長度，并 不特別限定，例如，滿足分子標(biāo)記的長度小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于2，OOObp、小于 1，500bp、小于 1，200bp、小于 1，OOObp、或者小于 800bp。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標(biāo)記(含有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列 的DNA片段)所包含的SEQ ID NO 1的5，端和/或3，端可操作地連接有人工序列和/或 控制序列，例如啟動子、增強(qiáng)子、終止子、酶切位點(diǎn)、引物序列等等。其中，術(shù)語“可操作地” 在本發(fā)明中定義為一種如下構(gòu)象，在該構(gòu)象中，控制序列例如啟動子被適當(dāng)?shù)刂糜赟EQ ID NO 1的一個位置上，以致該控制序列指導(dǎo)SEQ ID NO 1編碼的多肽的產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一方面涉及一種重組載體，其含有本發(fā)明的分子標(biāo)記。所述重組載體 可以是插入有本發(fā)明的分子標(biāo)記的表達(dá)載體或者克隆載體。本發(fā)明的還一方面涉及一種重 組細(xì)胞，其含有該重組載體。
本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標(biāo)記的制備方法，包括下述步驟使用非矮 株型的谷子的基因組DNA作為模板，以上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物即含有所述 分子標(biāo)記；優(yōu)選地，還包括將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中， 所述非矮株型的谷子為張谷1號、張雜谷3號、或張雜谷3號自交產(chǎn)生的F2代中的非矮株型。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以理解，也可以DNA化學(xué)合成的方法得到本發(fā)明的分 子標(biāo)記。
本發(fā)明的還一方面涉及所述分子標(biāo)記的檢測方法，包括下述步驟
(1)根據(jù)本發(fā)明的分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計引物；
(2)以被檢測谷子的基因組DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增；
(3)判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在該分子標(biāo)記。
例如，可以以被檢測谷子的基因組DNA為模板，以上述引物(SEQID NO :2和SEQ ID NO 3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。可以將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序或者凝膠電泳。
本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標(biāo)記在谷子株高基因定位或檢測中的用途。
本發(fā)明的還一方面涉及一種谷子株高基因定位的方法，包括使用本發(fā)明的分子標(biāo) 記的步驟。
本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標(biāo)記在谷子輔助育種中的用途。
本發(fā)明的還一方面涉及一種谷子輔助育種方法，包括檢測本發(fā)明的分子標(biāo)記的步驟。
本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于今后的分子標(biāo)記輔助育種中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理 解，比如通過檢測是否存在本發(fā)明的分子標(biāo)記來篩選谷子的理想株型(例如，可以參考， DNA分子標(biāo)記在小麥抗病育種中的用途，隴東學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006年4月第16卷 第1期，P65-69)。檢測出具有本發(fā)明的分子標(biāo)記的為非矮株型，不具有該分子標(biāo)記的為矮 株型。所述檢測可以是PCR檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發(fā)明的分子標(biāo)記引物。 所述檢測還可以通過測序方法進(jìn)行。該谷子輔助育種方法具有簡便、快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)。
在本發(fā)明中，具體地，所述谷子可以為張谷1號、谷子A2不育系、張雜谷3號、或張 雜谷3號自交產(chǎn)生的F2代。其中，谷子A2不育系、張雜谷3號自交產(chǎn)生的部分F2代(株 高為IOOcm左右)，是矮株型；張谷1號、張雜谷3號、或張雜谷3號自交產(chǎn)生的另一部分F2 代(株高為130cm左右和150cm左右)為非矮株型。
發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供了與谷子株高基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，并將谷子基因組DNA與谷子 株高基因聯(lián)系起來，更有利于谷子分子標(biāo)記輔助育種體系的建立；所述分子標(biāo)記與株高基 因的遺傳緊密連鎖距離為2. IcM0本發(fā)明的分子標(biāo)記可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于谷子 輔助育種。


圖1 分子標(biāo)記引物(SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3)對F2代480個單株擴(kuò)增的部分結(jié)果。
M 表示 marker，其為 200bp DNA Ladder ；其分子量包括4000bp、3000bp、2500bp、 2000bp、1800bp、1600bp、1400bp、1200bp、1000bp、800bp、600bp、400bp、以及 200bp。泳道 1-12為F2代中12株非矮株型的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道13- 為F2代中12株矮株型 的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果顯示非矮株型的植株中條帶大小為520bp，矮株型的植株中 條帶大小小于520bp。
關(guān)于生物材料保藏的說明
本發(fā)明涉及以下生物材料
1.張谷1號種子，其于2010年9月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)， 保藏編號為CCTCC NO :P201012，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心， 430072。
2.谷子A2不育系種子，其于2010年9月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :P201013，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保 藏中心，430072。
3.張雜谷3號種子，其于2010年9月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :P201010，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保 藏中心，430072。
具體實施方式
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實施例1 谷子F2代分離群體的構(gòu)建
父本為張谷1號株型高(非矮株型，株高為150cm左右)，抗拿捕凈(拿捕凈是 一種除草劑)，旗葉長而窄，剛毛紅色，穎殼紅色，可育，葉色偏綠。
母本為A2不育系株型矮(矮株型，株高為IOOcm左右)，不抗拿捕凈，旗葉短而 寬，剛毛綠色，穎殼綠色，部分不育，葉色偏黃。
父本和母本雜交得到Fl (張雜谷3號，非矮株型，株高為130cm左右)。
Fl代自交產(chǎn)生F2代群體，共480個單株。對480個F2代個體進(jìn)行株高性狀分析， 發(fā)現(xiàn)非矮株型360株(株為高130cm左右和150cm左右)，矮株型120株(株高為IOOcm左 右)。
實施例2 父母本以及Fl代、F2代個體基因組DNA的提取
用CTAB法分別提取實施例1中的父母本、Fl代、以及480個F2代個體的基因組 DNA,具體方法如下
(1)稱取1. Og新鮮葉片，剪碎放入研缽，用液氮研磨后加入:3ml 1. 5XCTAB，研磨成 勻漿轉(zhuǎn)入15ml的離心管中，然后往研缽中加入Iml 1. 5 X CTAB沖洗再轉(zhuǎn)入離心管中。混勻 后于65°C水浴30分鐘，期間不時緩慢搖勻。
其中1. 5XCTAB 配方如下(IL)
CTAB15g
IM Tris. Cl (pH 為 8. 0)75ml
0. 5M EDTA30ml
NaCl61. 4g
加去離子水定容至1L，使用前加入終濃度為0. 2% (2ml)的巰基乙醇。
(2)待冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇04 1)，輕輕混勻，至下層液變?yōu)?深綠色。
(3) 4200rpm離心10分鐘，將上層水相移到新的15ml離心管，加2倍體積預(yù)冷的無 水乙醇，混合靜止5分鐘。于-20°C放置30分鐘沉淀DNA。
(4) 4200rpm離心10分鐘，棄掉上清，加入Iml 75%乙醇洗滌沉淀1次，倒置離心 管干燥DNA，加入200 μ 1 TE溶解DNA。
(5)用0. 8%的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA。
(6)將得到的父母本以及Fl代、F2代個體的基因組DNA存于_20°C備用。
實施例3 分子標(biāo)記的制備
以實施例2中提取的父本、Fl代、或F2代中的非矮株型的基因組DNA為模板，以 分子標(biāo)記引物(SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)體系如下
無菌水20·2μ1
10*Buffer (含 Mg2+)2. 5 μ 1
dNTPs (25mM)0. 15μ 1
Taq 酶(5υ/μ1)0. 15 μ 1
正向引物
反向引物
模板
總體積0. 5μ 10.5μ 11.0μ 1 25 μ 1
PCR反應(yīng)程序如下
94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸40秒，運(yùn)行35個循 環(huán)；最后72°C延伸3分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以在4°C保存。
將擴(kuò)增產(chǎn)物純化，得到分子標(biāo)記。純化后進(jìn)行測序，結(jié)果如SEQ IDNO :1所示。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以理解，也可以通過DNA化學(xué)合成的方法得到該分子 標(biāo)記。
實施例4 分子標(biāo)記弓I物的初步篩選
對父本進(jìn)行de novo 測序(60X contig N50 :22K, scaffold N50 :320K ；Total size :400Mb)，母本重測序(10X)。
根據(jù)父母本測序數(shù)據(jù)，利用SOAP軟件(例如S0AP2. 20，可以從http://SOap. genomics, org. cn/下載，也可以使用其它的序列比對軟件)比較父母本之間的序列差異， 然后基于差異的序列，在父本5’端和3’端外側(cè)約50bp位置，隨機(jī)選取20bp左右的長度， 用primerpremier軟件隨機(jī)設(shè)計引物，一共設(shè)計了 1105對引物，下面的表1中示出了其中 的部分引物的序列(SEQ ID NO :2-41)。
表1 :1105對隨機(jī)引物中的部分引物
權(quán)利要求
1.一種與谷子株高基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；或 者其為含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA片段。
2.一種重組載體，其含有權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記。
3.—種重組細(xì)胞，其含有權(quán)利要求2所述的重組載體。
4.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO 2和SEQ ID NO 3 所示。
5.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的制備方法，包括下述步驟使用非矮株型的谷子的基因組DNA作為模板，以權(quán)利要求4所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 優(yōu)選地，還包括將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟；具體地，所述非矮株型的谷子為張谷1 號、張雜谷3號、或張雜谷3號自交產(chǎn)生的F2代中的非矮株型。
6.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的檢測方法，包括下述步驟(1)根據(jù)權(quán)利要求1的分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計引物；(2)以被檢測谷子的基因組DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增；(3)判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在該分子標(biāo)記。
7.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在谷子株高基因定位或檢測中的用途。
8.一種谷子株高基因定位的方法，包括使用權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的步驟。
9.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在谷子輔助育種中的用途。
10.一種谷子輔助育種方法，包括檢測權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的步驟。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)記，具體地，涉及一種與谷子株高基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ IDNO1所示，或者其為谷子基因組中含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA片段。本發(fā)明還涉及該分子標(biāo)記的引物、該分子標(biāo)記在谷子株高基因定位或谷子遺傳育種中的用途、一種谷子株高基因定位方法、以及一種谷子育種方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了與谷子株高基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0641，將谷子基因組DNA序列與谷子株高基因聯(lián)系起來，更有利于谷子分子標(biāo)記輔助育種體系的建立。
文檔編號C12N5/10GK102031259SQ20101055330
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者全志武, 夏秋菊, 張耕耘, 彭小華 申請人:深圳華大基因科技有限公司