專利名稱：家蠶性染色體連鎖基因slc35b1及其隱性致死突變基因和它們在家蠶性比控制中的應用的制作方法
家蠶性染色體連鎖基因SLC35B1及其隱性致死突變基因和它們在家蠶性比控制中的應用技術領域
本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一個來自家蠶性染色體，具有隱性致死突變特征的5Z0557 (solute carrier family 35member Bi)基因及其在家蠶雜交后代性比控制中的應用。
背景技術：
就一個蠶品種而言，雄蠶繭的繭層率和鮮繭出絲率要比雌蠶繭高，且雄蠶食桑量少，葉絲轉化率高；此外，雄蠶體質強健，更容易飼養，而且雄蠶絲纖度細、凈度好，適于剿制高品位生絲。為此，世界各國科學家對專養雄蠶技術進行了一系列的探索。1975年俄羅斯科學家V. A. ^rurmikov等運用輻射誘變等技術手段，育成了家蠶性連鎖平衡致死系。在性連鎖平衡致死系內自交，其后代雌雄性個體各有一半存活，使品系得以保持。當平衡致死系的雄蟲與常規品系的雌蟲交配的后代只有雄蟲能夠存活，雌蟲全部致死，達到專養雄蠶的目的。
1996年春，浙江省農業科學院從俄羅斯科學院引進了以家蠶性連鎖平衡致死系 S-8、S-14，并開展了利用性連鎖平衡致死技術實現專養雄蠶的研究。經10年攻關研究，創建了家蠶性連鎖平衡致死系細胞控制基因和導入方法(專利號ZL01132108. 3)、回交改良家蠶性連鎖平衡致死系的方法(專利號ZL01U6809. 3)、一種雜交改良家蠶性連鎖平衡致死系性狀的方法(專利號200810061660. 5)三項國家發明專利；建立了一個低成本的雄蠶雜交種繁育方法；育成了秋華X平30、華菁X平60等家蠶性連鎖平衡致死實用蠶品種， 雄蠶率達99. 8%，繭層率和出絲率比常規品種提高23%，綜合經濟效益提高20%左右。
家蠶屬于雌異型昆蟲，雌蠶性染色體為ZW，雄蠶為TL·，如果在其Z染色體上有一個隱性致死突變基因，則在雌性個體中，隱性致死突變基因發揮作用，使雌性個體死亡；而在雄性個體中，由于有兩個Z染色體，如果僅有一個Z染色體上帶有隱性致死突變，另一個Z 染色體上是正常基因，則這樣的雄性個體仍然存活。
家蠶性連鎖平衡致死系性比控制的關鍵在于隱性致死突變基因，家蠶性連鎖平衡致死系雌性個體的Z染色體上有一個隱性致死突變基因I1 (SLBL-I1)；在其W染色體上有一個來自Z染色體的易位片段，能夠掩蓋Z染色體上隱性致死突變基因的致死作用，其基因組為fi11。家蠶性連鎖平衡致死系雄性個體的兩個Z染色體上各含有一個非等位的隱性致死突變基因，一個Z染色體上含有一個隱性致死突變基因I1 (SLBL-I1),另一個Z染色體上含有一個隱性致死突變基因厶(51見-4)，其基因型為Z"Z"。家蠶性連鎖平衡致死系自交，后代有四種基因型(雌，活)，z"浐(雄，活)，w"浐(雌，死)，z"z"(雄，死)，雌雄各有一半死亡；當常規雌蠶與性連鎖平衡致死系的雄蠶雜交，后代雌蠶全部死亡，雄蠶全部存活，從而達到控制性比、專養雄蠶的目標。發明內容
為了解決家蠶后代性比控制的技術問題。本發明的第一個目的是提供家蠶性染色體連鎖基因5Z0557及一種基因編碼的蛋白質；本發明的第二個目的是提供上述的家蠶性染色體連鎖基因突變的一個家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因51見及其編碼的蛋白質；本發明的第三個目的是提供上述的基因用于選育雄蠶；本發明的第四個目的是提供一種分子標記法進行致死基因51見向常規品系轉育的方法；本發明的第五個目的是提供用于鑒定致死基因SLBL-I2的方法及其特異性引物。
為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案家蠶性染色體連鎖基因5Z0557，該基因具有kq ID NO. 1所示的mRNA序列。
上述的kq ID NO. 1所示的mRNA序列包含7個外顯子，編碼的蛋白質屬于糖苷轉運相關蛋白，參與保持細胞內內質網的動態平衡及胚胎的發育。上述的mRNA序列編碼的蛋白質，該蛋白質具有^^ ID NO. 2所示的氨基酸序列共319個氨基酸。經RNA干擾研究發現，注射基因dsRNA的家蠶在胚胎期出現死亡現象，致死時期在反轉期終了期 (25°C條件下催青第6天左右)。
為了實現上述的第二個目的，本發明采用了以下的技術方案家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因，該基因由kq ID NO. 1所示的mRNA序列經過突變得到。
作為優選，本發明提供了家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因51見-4，該基因具有 Seq ID NO. 3所示的mRNA序列。上述的mRNA序列編碼的蛋白質，該蛋白質具有kq ID NO. 4 所示的氨基酸序列。51見基因是由于缺失了包含第四個外顯子在內1，019 bp的片段， 該基因在表達時第五外顯子隨內含子一起被切除，產生的mRNA只有5個外顯子，只有1，617 bp，編碼249個氨基酸的蛋白質。蛋白質功能結構域不完整，喪失正常生理功能，引起胚胎發育停止(25°C條件下催青第6天左右)，其表型與SLC35B1基因的RNA干擾結果一致。
為了實現上述的第三個目的，本發明采用了以下的技術方案上述的基因5Z0557突變基因以及基因51見用于選育雄蠶。本發明提供的家蠶基因SLC35B1經過突變或缺失得到的基因，能夠引起雌蠶在胚胎期致死，而雄蠶可以存活，具有控制家蠶雜交后代性比的特性。
為了實現上述的第四個目的，本發明采用了以下的技術方案分子標記法進行所述的致死基因SLBL-I2向常規品系轉育的方法，該方法包括以下的步驟1)選擇家蠶性連鎖平衡致死系的雄蠶與正常品系的雌蠶雜交，Fl代雌蠶全部死亡，雄蠶有兩種基因型TL11或TL12全部存活，雄蠶飼養至蛾期，與正常品系的雌蠶進行單蛾雜交， 雄蛾與卵圈一一對應，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性的PCR引物進行PCR檢測，選擇基因型為TL12的雄蛾的后代F2繼續飼養，不含基因的卵圈棄去；2)將F2代蠶飼養至蛾期，選擇雄蛾與正常品系的雌蠶進行單蛾雜交，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性的PCR引物進行PCR檢測，選擇基因型為U12的雄蛾的后代F3繼續飼養；如此反復多代雜交，即將基因SLBL-I2導入正常品系中。
本發明采用分子標記輔助育種，便于將SLBL-I2基因轉育到常規家蠶品種中，加速育種進程。作為最優選，上述的特異性的PCR引物如下正向引物 GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC，反向引物GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC ；基因型為 TZ12 的雄蛾含有基因SLBL-I2,能夠擴增出750 bp片段。
為了實現上述的第五個目的，本發明采用了以下的技術方案用于鑒定致死基因51見的方法，該方法采用特異性的PCR引物，正向引物 GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC,反向引物GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC，進行 PCR 檢測，能夠擴增出750bp片段為致死基因SLBL-I20
用于鑒定致死基因SLBL-I2的特異性引物，該特異性引物由正向引物 GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC,反向引物GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC 組成。該特異性弓丨物還可以用于進行致死基因SLBL-I2向常規品系的轉育及性比控制品種的分子鑒定。
本發明提供了一個家蠶性染色體連鎖基因及其隱性致死突變基因 SLBL-I2的序列及PCR鑒定的特異性引物；利用標記輔助育種技術可加速51見向常規品系的轉育，在家蠶后代性比控制、專養雄蠶、提高絲質品質等生產中有重大的應用價值。


圖1為家蠶性染色體連鎖基因SLC35B1及其隱性致死突變基因SLBL-I2的結構模式圖。
圖2為攜帶基因蠶胚胎發育圖，胚胎在反轉期停止發育(25°C條件下催青第6天左右)。
圖3 敏SLC35B1基因dsRNA的家蠶胚胎發育圖，家蠶在胚胎期出現死亡現象， 致死時期在反轉期終了期(25°C條件下催青第6天左右)，死亡胚胎尚未著色。
圖4為家蠶性連鎖平衡致死系與常規品系雜交育種圖。
具體實施方式
下面就本發明的具體實施方式
進行詳細說明。需要指出的是，以下實施例僅用于說明本發明，一下實施例中如無特殊說明均按常規條件或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1、家蠶SLC35B1基因的克隆1.1用Trizol試劑(購自hvitrogen公司)提取家蠶P50等常規品系的總RNA，以 Olig-d(T) 18為引物，用M-MLV反轉錄酶(Promega公司)將獲得的RNA反轉錄為cDNA，以所合成的 cDNA 為模板，以正向引物(SLC35B1 F 5‘ -ATTGACGTACGACATTCGTACTTTCG-3‘)和反向引物(SLC35B1 R: 5' -GATCTAAACAGATATGGTATATCCG-3')進行 PCR 擴增，PCR 產物連接到 pMD-18載體(大連Takara公司)中，得到重組質粒pMD_SLC35Bl，經序列測定，獲得的PCR擴增產物產物為1，733 bp，序列如kq. NOl所示，其編碼區為219-1，175，所編碼的蛋白質含有319個氨基酸，序列如kq. N02所示。
1. 2提取家蠶P50等常規品系的基因組DNA，以正向引物(SLC;35B1 F 5'-ATTGACG TACGACATTCGTACTTTCG-3‘)和反向引物(SLC35B1 R: 5‘ -GATCTAAACAGATATGGTATATCCG-3‘) 進行PCR擴增，PCR經克隆、序列測定，并與前面的RNA序列比對，發現家蠶5Z0557基因的 mRNA包含7個外顯子(如圖1)。
1.3 用特異性的 PCR 引物(正向引物5 ‘ -GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC-3 ‘，反向引物5'-GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC-3')對家蠶P50等常規品系的基因組DNA進行PCR擴增， PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳及序列測定，發現擴增產物為1，769 bp。
實施例2、家蠶性連鎖平衡致死系致死基因I2 (SLBL-I2)基因的克隆2. 1提取家蠶性連鎖平衡致死系的總RNA，以Olig-(KT)w為引物，用M-MLV反轉錄酶(Promega公司)將獲得的RNA反轉錄為cDNA，以所合成的cDNA為模板，以正向弓丨物(SLC35B1 F :5'-ATTGACGTACGACATTCGTACTTTCG-3')和反向引物(SLC35B1 R: 5' -GATCTAAACAGATATGGTATATCCG-3')進行 PCR 擴增，PCR 產物連接到 pMD-18 載體(大連 Takara公司)中，經序列測定，獲得的PCR擴增產物為1，523 bp，序列如kq. N03所示，其編碼區為219-965，所編碼的蛋白質含有249個氨基酸，序列如kq. N04所示。
2. 2提取家蠶性連鎖平衡致死系的基因組DNA，以正向引物 (SLC35B1 F :5'-ATTGACGTACGACATTCGTACTTTCG-3')和反向引物(SLC35B1 R: 5 ‘ -GATCTAAACAGATATGGTATATCCG-3 ‘)進行PCR擴增，PCR經克隆、序列測定，并與正常 SLC35B1基因的RNA序列比對，HSLBL-I2基因缺失了包含第四個外顯子在內1，019 bp 的片段，造成基因在表達時第五外顯子隨內含子一起被切除，產生的mRNA只有5個外顯子 (如圖1)。
2.3 用特異性的 PCR 引物(正向引物5‘ -GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC-3‘，反向引物5' -GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC-3')對家蠶性連鎖平衡致死系的基因組DNA進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳及序列測定，發現擴增產物為750 bp.利用該特異性的PCR 引物可對家蠶5Z0557正常基因及其隱性致死突變基因進行鑒定。
實施例3、家蠶SLC35B1基因的RNA干擾3.1 重組質粒 pMD-SLC;35Bl 為模板，用 T7+SLC35B1 F (5‘ -TAATACGACTCACTATAGGGATT GACGTACGACATTCGTACTTTCG-3‘)、T7+SLC35B1 R(5‘-TAATACGACTCACTATAGGGGATCTAAACAGAT ATGGTATATCCG-3')引物進行PCR，獲得的PCR產物用HKcribeTM RNAi轉錄試劑盒(購自 BioLabs公司)轉錄合成dsRNA。
3. 2選取家蠶PND品系的雌蛾產卵后2小時左右的新鮮蠶卵，按照每粒蠶卵注射 5 nl濃度為2 yg/μ 的dsRNA，注射后的蠶卵放在25°C條件下催青，第6、第7、第8天后分別取部分解剖蠶卵，在顯微鏡下觀察胚胎的發育。
3. 3顯微觀察發現，注射了 SLC35B1基因的dsRNA的蠶卵胚胎在催青第6后停止了發育，胚胎不能轉色，表型與胚胎的表型一致(如圖2、圖3所示)。
實施例4、分子標記輔助進行基因向常規品系的轉育選擇家蠶性連鎖平衡致死系的雄蠶與常規品系的雌蠶雜交，Fl代雌蠶全部死亡，雄蠶有兩種基因型(ZZ"或ZZ")全部存活，雄蠶飼養至蛾期，與常規品系的雌蠶進行單蛾雜交，雄蛾與卵圈一一對應，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性的PCR引物(正向引物 5'-GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC-3'，反向引物5'-GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC-3')進行 PCR 檢測，選擇能夠擴增出750 bp (表示含有基因)片段的雄蛾的后代(F2代，基因型為U12、繼續飼養。不含基因的卵圈棄去，減少養蠶工作量。
將F2代蠶飼養至蛾期，選擇雄蛾與常規品系的雌蠶進行單蛾雜交，交配后的雄蛾提取基因組DNA，進行PCR檢測，選擇能夠擴增出750 bp片段的雄蛾的后代(F3代，基因型為ZZ")繼續飼養。如此反復多代雜交，就可將基因導入常規品系中(如圖4)。
權利要求
1.家蠶性染色體連鎖基因51^557，其特征在于該基因具有^^ID NO. 1所示的mRNA 序列。
2.權利要求1所述的mRNA序列編碼的蛋白質，其特征在于該蛋白質具有kqID NO. 2 所示的氨基酸序列。
3.家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因，其特征在于該基因fikqID NO. 1所示的 mRNA序列經過突變得到。
4.家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因51見-4，其特征在于該基因具有^^ID NO. 3 所示的mRNA序列。
5.權利要求3或4所述的基因用于選育雄蠶。
6.分子標記法進行權利要求4所述的致死基因SLBL-I2向常規品系轉育的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)選擇家蠶性連鎖平衡致死系的雄蠶與正常品系的雌蠶雜交，Fl代雌蠶全部死亡，雄蠶有兩種基因型TL11或TL12全部存活，雄蠶飼養至蛾期，與正常品系的雌蠶進行單蛾雜交， 雄蛾與卵圈一一對應，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性的PCR引物進行PCR檢測，選擇基因型為TL12的雄蛾的后代F2繼續飼養，不含基因的卵圈棄去；2)將F2代蠶飼養至蛾期，選擇雄蛾與正常品系的雌蠶進行單蛾雜交，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性的PCR引物進行PCR檢測，選擇基因型為U12的雄蛾的后代F3繼續飼養；如此反復多代雜交，即將基因SLBL-I2導入正常品系中。
7.根據權利要求6所述的分子標記法進行權利要求4所述的致死基因SLBL-I2向常規品系轉育的方法，其特征在于步驟1)和步驟2)中特異性的PCR引物如下正向引物 GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC，反向引物GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC ；基因型為 TL12 的雄蛾含有基因SLBL-I2,能夠擴增出750 bp片段。
8.用于鑒定權利要求4所述的致死基因SLBL-I2的方法，其特征在于該方法采用特異性的PCR引物，正向引物GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC，反向引物 GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC，進行PCR檢測，能夠擴增出750bp片段為權利要求3所述的致死基因SLBL-I20
9.用于鑒定權利要求4所述的致死基因的特異性引物，其特征在于該特異性引物由正向引物GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC，反向引物GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC 組成。
10.權利要求9所述的特異性引物用于進行權利要求3所述的致死基因SLBL-I2向常規品系的轉育及性比控制品種的分子鑒定。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一個來自家蠶性(Z)染色體，具有隱性致死突變特征的SLC35B1(solutecarrierfamily35memberB1)基因及其在家蠶雜交后代性比控制中的應用。本發明所公開的家蠶SLC35B1基因來自于家蠶性(Z)染色體，其隱性致死突變是來自于家蠶性連鎖平衡致死系(sex-linkedbalancedlethal(SLBL))的致死基因l2(SLBL-l2)，能夠引起雌蠶在胚胎期致死，而雄蠶可以存活，具有控制雜交后代性比的特性，利用其序列特性，在家蠶育種過程中，輔助進行家蠶性連鎖平衡致死系的轉育，專養雄蠶，提高絲質品質。
文檔編號C12N15/11GK102533773SQ201110457128
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月31日 優先權日2011年12月31日
發明者何麗華, 劉巖, 孟智啟, 柳新菊, 牛寶龍, 祝新榮, 翁宏飆, 譚安江, 黃勇平 申請人:浙江省農業科學院