專利名稱：：一種提高無核葡萄育種效率的方法
技術領域：
：本發明屬于植物育種
技術領域：
，涉及用外源植物生長調節物質和調控植物生殖器官胚的生長發育進程，并和胚挽救技術相結合，以促進在雜交授粉后，獲得更多雜交后代，提高無核葡萄育種效率的方法。技術背景無核葡萄因食用方便，在鮮食和制干方面都深受消費者的歡迎，但是現有的無核葡萄品種多屬歐亞品種群，該類品種風味品質較好，但是抗病性差，在許多葡萄產區生長季需要施用很多農藥。在當今，農產品安全性問題日益受到關注，而且生活水平不斷提高的消費者對各種不同風味特點的無核葡萄品種需求愈見旺盛。因此選育優質、大粒、抗病的無核葡萄，已成為葡萄育種者的重要目標。無核葡萄根據其授粉受精結實特性，可分為單性結實(Parthenocarpy)和假單性結實(Pseudo-parthenocarpy)兩種類型。單性結實類型的子房不經授粉受精就可發育成果實，但品種類型在雜交授粉后不能將該特性遺傳給后代，因此在雜交選育沒有利用價值。而假單性結實類型又叫種子敗育型(Stenospermocarpy)，其子房需要正常的授粉受精，在果實發育過程中胚乳和胚中途停止發育，在漿果中留下種子痕跡，我們常見的無核葡萄如無核白、森田尼無核、火焰無核都屬于這種類型。20世紀80年代之前的無核葡萄品種中，70%左右是通過用有核品種(有無核傾向的)作母本，無核品種作父本雜交獲得的。但這樣雜交后代中出現無核植株比率很低，只有0%15%。如果采用種子敗育型的無核葡萄品種之間進行雜交，后代無核植株比例將會大為提高。而以無核蔔萄品種為母本進行雜交的前提，必須能夠促進幼胚發育，得到雜種植株或能萌發成植株的雜交種子。1982年Ramming等首次報道利用無核葡萄胚珠，在胚敗育前取出離體培養，使胚在離體條件下繼續發育，即胚挽救技術，獲得了2株無核葡萄實生苗〔1]。其后Cain等，Emershad等w，Spiegile-Roy等w，Gray等[5]分別報道了葡萄胚的胚珠內培養，并培育出無核植株。我國學者在21世紀90年代開始，利用葡萄胚挽救技術進行無核葡萄新品種的選育，已獲得可喜成果[6]。現在該技術已在世界各地的無核葡萄育種中得到廣泛的應用。胚挽救技術是在常規的雜交育種基礎上，將已授粉受精的胚珠在無菌條件下取出，進行離體培養，促進胚在胚珠內繼續發育，再經過轉換幾次培養基，最終使胚萌發成苗，獲得雜交植株。不同雜交品種的胚在胚珠內的發育率差異很大，除了與父本品種基因型有關外，最主要是由母本基因型決定的。目前，無核葡萄胚挽救技術中，發育胚的萌發率和成苗率一般都能達到70%以上，影響胚挽救效率的主要因素是胚珠在離體培養后，其內部胚的發育率不高，而且不同品種胚發育率差異很大，在069.6%之間。因此，要完善胚挽救技術，雖然胚珠離體培養的條件要進一步研究，但母本基因型的影響是考慮的首要因素。無核白(ThompsonSeedless)、森田尼無核(又叫無核白雞心，CentennialSeedless)和火焰無核(FlameSeedless)是在生產中常見的優良無核品種。它們的合子胚在發育過程的初期，即分裂到幾十個細胞時就開始敗育，所以漿果成熟時種痕都非常小，食用時幾乎感覺不到。因此它們的胚珠在離體培胚的自然發育率也很低，且易受環境條件和父本的影響，一般無核白為1.94.4%，森田尼無核為02.5%，火焰無核為為7.116.5%，都屬于自然胚發育率低的無核品種類型。雖然它們的優點顯著，例如可溶性固形物含量高、肉脆、豐產、果粒和果穗外觀好，但由于在胚挽救中極低的胚發育率，在雜交中以它們作母本，獲得的雜交后代數量極少，很難在少量的雜交后代中選出綜合優良性狀的株系，導致浪費大量人力物力，因此限制了該品種在雜交育種中的使用。在20世紀70年代無核蔔萄胚挽救技術產生之前，有育種家利用植物生長調節劑促進假單性結實的無核蔔萄胚發育，阻止無核葡萄胚的早期敗育，形成具有生活力或發芽力的種子，以彌補無法用無核品種作母本進行雜交的缺陷，從而簡化育種程序,提高無核葡萄育種效率[7]。育種家受赤霉素(GA)誘導有核葡萄無籽化技術的啟發，用某些與赤霉素作用相反的乙稀利、激動素、生長抑制劑類物質等誘導雌性發育，在一些品種上直接獲得了有發芽率的種子[8]。但是用無核葡萄有籽化技術獲得的雜交后代的數量比率還很有限，離應用于雜交育種的實踐還相差甚遠。引用出處[1]RammingD.W,EmershadR丄.In-ovuleembryocultureofseededandseedless艦vz'm/,/(Abst.肌Hortscience,1982，17(3):487.[2]CainD.W.，EmershadR.L.，丁arai]oR,E,InovuleembryocultureandSeedlingdevelopmentofseededandseedlessgrape(v/to由，"L)[J].vitis,1983,22:9-14.[3]EmershadR.L.,RammingD.W.In-ovuloembryocultureofFtoWmy^raL.cv,"Thompsonseedless，，[J].Amer.J.Bot',1984,7l(6):873-877.[4]Spiegle曙RoyP.，SaharPN，BaronJ.etal./"vz>ocultureandplantformationfromgrapecultivarswithabortiveovulesandseeds[J].J.Amer.Soc.Hort.Sci"1985,110:109-112,[5]GrayD.J.，FisherL.C.,Mortensen,丄A.Comparisonofmethodlogiesforinovuloembryorescueofseedlessgrapes[J].Hortscience,1987,22:1334-1335.[6]蔣愛麗，李世誠，金佩芳，楊天儀，駱軍.胚培無核葡萄新品種一一滬培l號的選育[J].果樹學報，2007,24(3):402-403.[7]LedbetterC,A.,shonnardC.B.Improvedseeddevelopmentandgerminationofstenosermicgrapesbyplantgrowthregulators[J].JournalofHorticulturalScience,1990,65(3):269-274.[8]BordelonB.P.,Moore丄N.Promotingstenospermicgrapeseedtracedevelopmentandgerminationwithplantgrowthregulators[J].丄Amer.Hort.Sci.,1994,119(4):719-726.
發明內容針對上述現有技術中存在的缺陷與不足，本發明的目的在于提供一種用外源植物生長調節物質調控植物生殖器官胚的生長發育進程，并和胚挽救技術相結合，以促進在雜交授粉后，獲得更多雜交后代，提高無核葡萄育種效率的方法。實現上述發明目的的技術方案是一種提高無核葡萄育種效率的方法，具體包括下列步驟1)對胚發育率較低的無核品種，在開花前1020天，氣溫在1528°C，小穗已經分開，但小穗中的小花仍擠在一起的葡萄花穗上噴施50500mg.L一1的生長抑制劑類物矮壯素(CCC，Chlormequat,2-氯乙基三甲基氯化銨，分子式C5H13NCL2)溶液或者10100mg.L—1細胞分裂素類物質6-BA(6-Benzylamin叩urine，6-卞氨基嘌呤，分子式C,皿)溶液，噴至藥劑浸潤全部花穗；2)在開花期經常規的授粉受精，在花后4050天，摘取幼果放入容器中，用自來水沖洗數次后，加入75%乙醇浸潤30秒，無菌水沖洗一次，加入2.5%次氯酸鈉浸泡510分鐘，進行表面滅菌，無菌水沖洗23次；3)在無菌條件下剖開果粒取出胚珠，接種到ER或改良ER培養基中；暗培養兩個月后無菌剖開胚珠，在胚珠的喙部，發現有白色胚的，即為已發育的胚；4)將胚取出轉接到WP+BA0.2萌發培養基中，一周后即可萌發，再轉到1/2MS+IBA0.1成苗培養基中成苗，就得到完整的無核葡萄雜交胚挽救試管苗，將雜交胚挽救試管苗進行繼代擴繁，用試管苗進行煉苗移栽，成活后定植大田，即得到無核葡萄雜交植株。所述的ER培養基是大量元素為Ca(N03)2.4H20600mg.L—'，認03160mg.L_1，KC165mg.L—1，NH4N03360mg.L_1，MgS04.7H20750mg.L—1，NaS04200mg.L_1，NaH2P04.H2019mg,L—1。微量元素為MnS04.H203.0mg,L-'，H3B030.5mg.L—1，ZnS04.7H200.5mg.L—1,C。C12.6H200.025mg.L—L,C哉.5貼0.025mg.L、NaMo04.2H200.025mg.L—'。鐵鹽為檸檬酸鐵10.0mg.L—'。有機物為肌醇50.0mg.L—\甘氨酸3.0mg.L—'，鹽酸硫胺素0.25mg.L—l,鹽酸吡哆醇0.25mg.L—\泛酸鈣0.25mg.L—\水解酪蛋白50.0mg.L—、附加物質半胱氨酸1.21mg.L_1,蔗糖60,000mg.L—\活性炭3，000mg.L—、PH6.0。所述的改良ER培養基是大量元素為跳762.6mg.L;1，NH4N03293.6mg.L—，MgS04.7H201254.6mg.L—，NaH2P04.2H20780.0mg.L—'，Ca(N03)2.4H20236.0mg.L—1。其它部分同ER培養基。所述的萌發培養基是大量元素為NH4N03400mg.LT，Ca(N03)2.4H20556mg.L—'，K2S04990mg.L/1,KH2P04170mg.L-'，MgS(X370mg.L-1,CaCL,2H2096mg.I/1。微量元素為M載.H2022.5mg,L、ZnS04.7H208.6mg.L-\H3B036.2mg.L—\Na2Mo04.2H200.25mg.L—'，CuS04.5H200.25mg.L—'。鐵鹽Na2.EDTA37.3mg.L—\FeS04.7H2027.8mg.L—、有機物為肌醇100.0mg.L—\甘氨酸2.0mg.L—1，鹽酸硫胺素1.0mg.L—\鹽酸吡哆醇0.5mg.L—'，煙酸0.5mg.L—。附加物質蔗糖20,000mg.L—',活性炭1，500mg.L、BA0.2mg.L一1。PH6.0。所述的成苗培養基是大量元素為KN03950mg.L—',NH4N03825mg.L—'，MgS04.7H20185mg.L—'，KH2P0.，85mg.L—'，CaCl2.2H20220mg.L_1。微量元素為MnS04.4H2022.3mg.L-'，ZnSO一7H208.6mg.L—'，H:肌6.2mg.L—'，KI0.83mg.L-1,Na2Mo04.2H200.25mg.L一1,C載.5H.200.025mg丄'，C。C12.6H200.025rag.i;1。鐵鹽Na2.EDTA37.3mg.L—'，FeS04.7H2027.8mg.L—'。有機物為肌醇100.0mg.L—\甘氨酸2.0mg.L—\鹽酸硫胺素0.4mg.L—\鹽酸吡哆醇0.5mg.LV煙酸0.5mg.L—!。附加物質蔗糖20，000mg.L—^活性炭1，000mg.L、IBA0.1mg.L_1。PH6.0。所述的無核品種是無核白葡萄、森田尼無核葡萄、火焰無核葡萄。所述的矮壯素溶液是按下列方法配制首先配制矮壯素1000mg.l^母液，稱取lg矮壯素，用100ml左右的蒸餾水溶解后，用蒸餾水定容至lOOOml，即為1000mg丄—i母液，室溫保存，近期使用；當配制50mg.L/t的矮壯素溶液時，用量筒量取50ml母液，定容至1000ml，再加入lml的吐溫一20，即0.1%濃度，混勻，即為50mg.L—'的矮壯素溶液；配制500mg.L—1的矮壯素溶液時，用量筒量取500ml母液，定容至1000ml，再加入lml的吐溫一20，即0.1%濃度，混勻，即為500mg丄—'的矮壯素溶液;要配制50和500mg.L—'之間的濃度，方法類似。所述的6-BA溶液是按下列方法配制首先配制6-BA1000mg.L—'母液，稱取lg6-BA，用50100ml的稀鹽酸溶解，逐漸加入蒸餾水，邊加邊攪拌，以防產生沉淀，用蒸餾水定容至1000ml，并用Na0H調PH值到7.0左右，即為1000mg.L—'母液，室溫保存，近期使用；配制10mg.L—t的6-BA溶液時，用量筒量取10ml母液，定容至1000ml，再加入lml的吐溫一20,即0.1%濃度，混勻，即為10mg.L—'的6-BA溶液；配制100mg.L—1的6-BA溶液時，用量筒量取100ml母液，定容至1000ml，再加入lml的吐溫一20，即0.1%濃度，混勻，即為100呢丄'的6-BA溶液;要配制10和100mg.L—'之間的濃度，方法類似。胚珠在ER或改良ER培養基中培養條件為溫度25±3°C，空氣濕度4060%。胚在WP+BA0.2萌發培養基中培養條件為光照強度3000Lux，光周期12小時，溫度25士3。C，空氣濕度406C)Q^。本發明能在胚挽救的基礎上明顯增加無核白、森田尼無核、火焰無核葡萄的胚發育率，即提高了影響胚挽救效率的主要決定因素——不同基因型的胚發育率，從而在源頭上提高了無核葡萄胚挽救效率。通過提髙這些無核葡萄胚發育率，能增加后繼成苗的基數，從而得到更多的雜交植株后代，避免具綜合優良形狀的后代株系夭折在早期合子胚的階段，最終提高育種效率，擴大了無核葡萄雜交育種的親本選擇范圍，加速無核品種的選育進程。具體實施方式下面結合發明人給的具體實施例來進一步說明本發明的操作方法及其有益效果。在實施本發明所述的一種提高無核葡萄育種效率的方法中，具體涉及以下培養基所述的ER培養基是大量元素為Ca(N03)2.4H20600mg丄1，翻3160mg.L—、KCl65mg.L—'，NH4N03360mg.L—'，MgS04.7H20750mg.L—'，NaS04200mg.L—'，NaH2P04.H2019mg.L—1。微量元素為MnS04.H203.0mg.L—'，H3B030.5mg.L—\ZnS04.7H200.5mg丄1，CoCl2.6H200.025mg.L—\CuS04.5H200.025mg.L—'，NaMo04.2H200.025mg.L—1。鐵鹽為檸檬酸鐵10.0mg.L—'。有機物為肌醇50.0mg.L—i，甘氨酸3.0mg.L—1，鹽酸硫胺素0.25mg.L—\鹽酸吡哆醇0.25mg.L—'，泛酸鈣0.25mg.L/'，水解酪蛋白50.0mg.L—'。附加物質半胱氨酸1.21mg.L-1，蔗糖60，000mg.L_1，活性炭3，000mg.L-'。PH6.0。所述的改良ER培養基是大量元素為KN03762.6mg.L—'，NH4N0:,293.6mg.L—\MgS04.7H201254.6mg.L—'，NaH2P04.2H20780.0mg.L—\Ca(N03)2.4H20236.0mg.L—1。其它部分同ER培養基。所述的萌發培養基是大量元素為NH4N03400mg.L、Ca(N03)2.4H20556mg.L—\K2S04990mg.L_I，KH2P04170mg.L—\MgS04370mg.L—丄，CaCl2.2H2096mg.L-1。微量元素為MnS(VH2022.5mg.L-',ZnS(X7H208.6mg.L-',H3B036.2mg.L—',歸cA.2H200.25mg.L一1，C載.5H200.25mg,L鐵鹽Na2.EDTA37.3mg.L、FeS04.7H2027.8mg.L—'。有機物為肌醇100.0mg.L、甘氨酸2.0mg.L—1，鹽酸硫胺素1.0mg.L—\鹽酸吡哆醇0.5mg.L—'，煙酸0.5mg.L—、附加物質蔗糖20，000mg.L-1,活性炭1，500mg.L-\BA0.2rag.「1。PH6.0。所述的成苗培養基是大量元素為認03950mg.L_1，NH4N03825mg.L—'，MgS04.7H20185mg.L_1，KH2P0485mg.L—'，CaCl2.2H20220mg.L_1。微量元素為MnS04.4H2022.3mg.L—'，ZnS(V7H208.6mg.L/1，貼036.2mg.L—'，KI0.83mg.L—'，Na2Mo04.2H200.25mg.L—'，CuS(X5H200.025mg.L—'，CoCl2.6H200.025mg.L—'。鐵鹽Na2.EDTA37.3mg.L—'，FeSO,"7H2027.8mg丄—'。有機物為肌醇100.0mg.L—\甘氨酸2.0mg.L—'，鹽酸硫胺素0.4mg.L—\鹽酸吡哆醇0.5mg.LV煙酸0.5mg.L—'。附加物質蔗糖20,000mg.L—^活性炭1，000mg.L、服0.1mg.L_'。PH6.0。實施例1矮壯素溶液的制備矮壯素先溶解配制成1000mg.L—'母液稱取lg矮壯素(購自上海稼豐園藝用品有限公司，純度98%)，用100ml左右的蒸餾水溶解后，用蒸餾水定容至lOOOml,即為1000mg.L—'母液，室溫保存，近期使用。當配制50mg丄1的矮壯素溶液時，用量筒量取50ml母液，定容至lOOOml，再加入1ml的吐溫一20，即0.1%濃度，混勻，即為50mg丄"的矮壯素溶液。配制500mg.L—1的矮壯素溶液時，用量筒量取500ml母液，定容至lOOOml，再加入lml的吐溫一20，即0.1%濃度，混勻，即為500mg丄—'的矮壯素溶液；要配制50和500mg.L—'之間的濃度，方法類似。實施例26-BA溶液的制備6-BA同樣先配制成1000mg丄—'母液稱取lg6-BA(上海化學試劑公司出品，純度99.6%)，用50100ml的稀鹽酸溶解，逐漸加入蒸餾水，邊加邊攪拌，以防產生沉淀，用蒸餾水定容至1000ml，并用NaOH調PH值到7.0左右，即為1000mg.L/'母液，室溫保存，近期使用。配制10mg.L—的6-BA溶液時，用量筒量取10ml母液，定容至1000ml，再加入lml的吐溫一20，即0.1%濃度，混勻，即為10mg.L—1的6-BA溶液。配制100mg.L—'的6-BA溶液時，用量筒量取100ml母液，定容至1000ml，再加入lml的吐溫一20，即0.1%濃度，混勻，即為100mg.L—1的6-BA溶液；要配制10和100mg.r之間的濃度，方法類似。實施例3在無核白開花前1020天時，選擇氣溫在1528°C、無風、無雨的早晨或下午，用手持壓力噴壺噴施矮壯素100mg.L—1于小穗已經分開，但小穗中的小花仍擠在一起的葡萄花穗，噴至藥劑浸潤全部花穗。花穗前部用塑料板擋隔，以防藥劑接觸到其它枝葉花序。在開花期進行常規的去雄雜交授粉。4050天后，摘取幼果放入廣口瓶，用自來水沖洗數次后，加入75%乙醇浸潤30秒，無菌水沖洗一次，加入2.5%次氯酸鈉浸泡5分鐘，進行表面滅菌，無菌水沖洗2次。在無菌條件下剖開果粒取出胚珠，接種到改良ER固液雙層培養基中，進行暗培養，培養室溫度25士3t:，空氣濕度4060%。兩個月后，在解剖鏡下，無菌剖開胚珠，在胚珠的喙部，發現有白色胚的，即為已發育的胚。花前用矮壯素或6-BA處理的有發育胚的胚珠比率明顯增多。將胚取出，轉接到WP+BA0.2萌發培養基中，培養條件為光照強度3000Lux，光周期12小時，溫度25±3°C，空氣濕度4060%。一周后即可萌發，再轉到1/2MS+IBA0.1成苗培養基中成苗，在相同培養基中繼代擴繁(培養條件同萌發培養)后，煉苗移栽，成活后定植大田，即得到雜交植株。實施例4森田尼無核開花前1020天時，選擇氣溫在1528。C、無風、無雨的早晨或下午，用手持壓力噴壺噴施矮壯素500mg.L—i于小穗已經分開，但小穗中的小花仍擠在一起的葡萄花穗，噴至藥劑浸潤全部花穗。花穗前部用塑料板擋隔，以防藥劑接觸到其它枝葉花序。在開花期進行常規的去雄雜交授粉。4050天后，摘取幼果放入廣口瓶，用自來水沖洗數次后，加入75%乙醇浸潤30秒，無菌水沖洗一次，加入2.5%次氯酸鈉浸泡510分鐘，進行表.面滅菌，無菌水沖洗3次。在無菌條件下剖開果粒取出胚珠，接種到ER培養基中，進行暗培養，培養窒溫度25±3°C，空氣濕度4060%。兩個月后，在解剖鏡下，無菌剖開胚珠，在胚珠的喙部，發現有白色胚的，即為已發育的胚。花前用矮壯素或6-BA處理的有發育胚的胚珠比率明顯增多。將胚小心取出，轉接到WP+BA0.2萌發培養基中，培養條件為光照強度3000Lux，光周期12小時，溫度25士3'C，空氣濕度4060%。一周后即可萌發，再轉到1/2MS+IBA0.1成苗培養基中成苗，在相同培養基中繼代擴繁(培養條件同萌發培養)后，煉苗移栽，成活后定植大田，即得到雜交植株。實施例5火焰無核開花前1020天時，選擇氣溫在1528°C、無風、無雨的早晨或下午，用手持壓力噴壺噴施6-BA10mg.L—'于小穗已經分開但小穗中的小花仍擠在一起的葡萄花穗，噴至藥劑浸潤全部花穗。花穗前部用塑料板擋隔，以防藥劑接觸到其它枝葉花序。在開花期進行常規的去雄雜交授粉。4050天后，摘取幼果放廣口瓶，用自來水沖洗數次后，加入75%乙醇浸潤30秒，無菌水沖洗一次，加入2.5%次氯酸鈉浸泡510分鐘，進行表面滅菌，無菌水沖洗2次。在無菌條件下剖開果粒取出胚珠，接種到ER培養基中，進行暗培養，培養室溫度25士3。C，空氣濕度4060%。兩個月后，在解剖鏡下，無菌剖開胚珠，在胚珠的喙部，發現有白色胚的，即為已發育的胚。將胚取出，轉接到^+BA0.2萌發培養基中，培養條件為光照強度3000Lux，光周期12小時，溫度25土3t:，空氣濕度4060%。一周后即可萌發，再轉到1/2MS+IBA0.1成苗培養基中成苗，在相同培養基中繼代擴繁(培養條件同萌發培養)后，煉苗移栽，成活后定植大田，即得到雜交植株。實施例6在無核白開花前1020天時，選擇氣溫在1528。C、無風、無雨的早晨或下午，用手持壓力噴壺噴施6-BA100mg.LT'于小穗己經分開，但小穗中的小花仍擠在一起的葡萄花穗，噴至藥劑浸潤全部花穗。花穗前部用塑料板擋隔，以防藥劑接觸到其它枝葉花序。在開花期進行常規的去雄雜交授粉。4050天后，摘取幼果放入廣口瓶，用自來水沖洗數次后，加入75%乙醇浸潤30秒，無菌水沖洗一次，加入2.5%次氯酸鈉浸泡510分鐘，進行表面滅菌，無菌水沖洗23次。在無菌條件下剖開果粒取出胚珠，改良ER培養基中。暗培養兩個月后，在解剖鏡下，無菌剖開胚珠，在胚珠的喙部，發現有白色胚的，即為已發育的胚。將胚取出，轉接到WP+BA0.2萌發培養基中，培養條件為光照強度3000Lux，光周期12小時，溫度25土3。C，空氣濕度4060%。一周后即可萌發，再轉到1/2MS+IBA0.1成苗培養基中成苗，在相同培養基中繼代擴繁(培養條件同萌發培養)后，煉苗移栽，成活后定植大田，即得到雜交植株。實施例7以下是采用本發明的方法和采用常規的方法做對比，來進一步說明本發明提高無核葡萄育種效率的方法的有益效果，具體結果見表1。表l不同藥劑對各品種胚發育率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本發明通過提高這些無核葡萄胚發育率，增加了雜交后代成苗的基數，從而能得到更多的雜交后代，提高育種效率，擴大了可用于無核葡萄雜交育種的親本選擇范圍，加速無核品種的選育進程。權利要求1.一種提高無核葡萄育種效率的方法，其特征在于，包括下列步驟1)對胚發育率較低的無核品種，在開花前10～20天，氣溫在15～28℃，小穗已經分開，但小穗中的小花仍擠在一起的葡萄花穗上噴施50～500mg.L-1的生長抑制劑類物質矮壯素溶液或者10～100mg.L-1細胞分裂素類物質6-BA溶液，噴至藥劑浸潤全部花穗；2)在開花期經常規的授粉受精，在花后40～50天，摘取幼果放入容器中，用自來水沖洗3～5次后，加入75％乙醇浸潤30秒，無菌水沖洗一次，加入2.5％次氯酸鈉浸泡5～10分鐘，進行表面滅菌，無菌水沖洗2～3次；3)在無菌條件下剖開果粒取出胚珠，接種到ER或改良ER培養基中，暗培養兩個月后無菌剖開胚珠，在胚珠的喙部，發現有白色胚的，即為已發育的胚；4)將胚取出轉接到WP+BA0.2萌發培養基中，一周后即可萌發，再轉到1/2MS+IBA0.1成苗培養基中成苗，就得到完整的無核葡萄雜交胚挽救試管苗，將雜交胚挽救試管苗進行繼代擴繁，用試管苗進行煉苗移栽，成活后定植大田，即得到無核葡萄雜交植株；所述的ER培養基是大量元素為Ca(NO3)2.4H2O600mg.L-1，KNO3160mg.L-1，KCl65mg.L-1，NH4NO3360mg.L-1，MgSO4.7H2O750mg.L-1，NaSO4200mg.L-1，NaH2PO4.H2O19mg.L-1；微量元素為MnSO4.H2O3.0mg.L-1，H3BO30.5mg.L-1，ZnSO4.7H2O0.5mg.L-1，CoCl2.6H2O0.025mg.L-1，CuSO4.5H2O0.025mg.L-1，NaMoO4.2H2O0.025mg.L-1；鐵鹽為檸檬酸鐵10.0mg.L-1；有機物為肌醇50.0mg.L-1，甘氨酸3.0mg.L-1，鹽酸硫胺素0.25mg.L-1，鹽酸吡哆醇0.25mg.L-1，泛酸鈣0.25mg.L-1，水解酪蛋白50.0mg.L-1；附加物質半胱氨酸1.21mg.L-1，蔗糖60,000mg.L-1，活性炭3,000mg.L-1，PH值為6.0；所述的改良ER培養基是大量元素為KNO3762.6mg.L-1，NH4NO3293.6mg.L-1，MgSO4.7H2O1254.6mg.L-1，NaH2PO4.2H2O780.0mg.L-1，Ca(NO3)2.4H2O236.0mg.L-1；其它部分同ER培養基；所述的萌發培養基是大量元素為NH4NO3400mg.L-1，Ca(NO3)2.4H2O556mg.L-1，K2SO4990mg.L-1，KH2PO4170mg.L-1，MgSO4370mg.L-1，CaCl2.2H2O96mg.L-1；微量元素為MnSO4.H2O22.5mg.L-1，ZnSO4.7H2O8.6mg.L-1，H3BO36.2mg.L-1，Na2MoO4.2H2O0.25mg.L-1，CuSO4.5H2O0.25mg.L-1；鐵鹽Na2.EDTA37.3mg.L-1，FeSO4.7H2O27.8mg.L-1。有機物為肌醇100.0mg.L-1，甘氨酸2.0mg.L-1，鹽酸硫胺素1.0mg.L-1，鹽酸吡哆醇0.5mg.L-1，煙酸0.5mg.L-1；附加物質蔗糖20,000mg.L-1，活性炭1,500mg.L-1，BA0.2mg.L-1，PH值為6.0；所述的成苗培養基是大量元素為KNO3950mg.L-1，NH4NO3825mg.L-1，MgSO4.7H2O185mg.L-1，KH2PO485mg.L-1，CaCl2.2H2O220mg.L-1；微量元素為MnSO4.4H2O22.3mg.L-1，ZnSO4.7H2O8.6mg.L-1，H3BO36.2mg.L-1，KI0.83mg.L-1，Na2MoO4.2H2O0.25mg.L-1，CuSO4.5H2O0.025mg.L-1，CoCl2.6H2O0.025mg.L-1；鐵鹽Na2.EDTA37.3mg.L-1，FeSO4.7H2O27.8mg.L-1；有機物為肌醇100.0mg.L-1，甘氨酸2.0mg.L-1，鹽酸硫胺素0.4mg.L-1，鹽酸吡哆醇0.5mg.L-1，煙酸0.5mg.L-1；附加物質蔗糖20,000mg.L-1，活性炭1,000mg.L-1，IBA0.1mg.L-1，PH值為6.0。2.根據權利要求1所述的提高無核葡萄育種效率的方法，其特征在于，所述的無核品種是無核白葡萄、森田尼無核葡萄、火焰無核葡萄。3.根據權利要求1所述的提高無核葡萄育種效率的方法，其特征在于，所述的矮壯素溶液是按下列方法配制先配制1000mg.L—'矮壯素母液，稱取lg矮壯素，用100ml左右的蒸餾水溶解后，用蒸餾水定容至1000ml，即為1000mg.L—'母液，室溫保存，近期使用；當配制50mg丄—1勺矮壯素溶液時，用量筒量取50ml母液，定容至1000ml，再加入lml的吐溫_20，即0.1%濃度，混勻，即為50mg.L—1的矮壯素溶液。4.根據權利要求1所述的提高無核葡萄育種效率的方法，其特征在于，所述的6-BA溶液是按下列方法配制先配制1000mg.L—'6-BA母液，稱取lg6-BA，用501(X)ml的稀鹽酸溶解，逐漸加入蒸餾水，邊加邊攪拌，以防產生沉淀，用蒸餾水定容至1000ml，并用NaOH調PH值到7.0左右，即為1000mg.L—i母液，室溫保存，近期使用；配制10mg.L—1勺6-BA溶液時，用量筒量取10ml母液，定容至1000ml，再加入lml的吐溫一20，即0.1%濃度，混勻，即為10mg.L—4勺6-BA溶液。5.根據權利要求l所述的提高無核葡萄育種效率的方法，其特征在于，胚珠在ER或改良ER培養基中培養條件為溫度25士3"，空氣濕度4060%。6.根據權利要求1所述的提高無核葡萄育種效率的方法，其特征在于，胚在WP+BA0.2萌發培養基中培養條件為光照強度3000Lux，光周期12小時，溫度25士3。C，空氣濕度4060%。全文摘要本發明公開了一種提高無核葡萄育種效率的方法，它是將一種植物生長抑制劑類物質矮壯素，或細胞分裂素類物質6-BA溶解配制成的藥劑，在花前10～20天噴施到花穗上，在花后40～50天摘取葡萄果粒，取出胚珠進行胚挽救，使用本發明的胚發育率無核白由0～4.4％提高至8.3～11.9％；森田尼無核由0.5～2.5％提高到1.8～21.9％；火焰無核由7.1～17.1％提高到14.1～25.4％。本發明通過提高這些無核葡萄胚發育率，增加了雜交后代成苗的基數，從而能得到更多的雜交后代，提高育種效率，擴大了可用于無核葡萄雜交育種的親本選擇范圍，加速無核品種的選育進程。文檔編號C12N5/04GK101238791SQ20071030651公開日2008年8月13日申請日期2007年12月29日優先權日2007年12月29日發明者唐冬梅,王躍進,蔡軍社,趙榮華申請人:西北農林科技大學