專利名稱：一種溫度兩階段控制策略發(fā)酵生產(chǎn)F.solani pisi角質(zhì)酶的方法
一種溫度兩階段控制策略發(fā)酵生產(chǎn)i^o/am》W角質(zhì)酶的方法技術(shù)領(lǐng)域一種溫度兩階段控制策略發(fā)酵生產(chǎn)i^o/flm》/w'角質(zhì)酶的方法，涉及環(huán)境因 素(溫度、pH)分階段控制策略在發(fā)酵過程優(yōu)化中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景角質(zhì)酶(Qitinase)是一種多功能酶，屬絲氨酸酯酶的一種，相對分子質(zhì)量 約為22 30kD，是一種具有稱作cc/々水解酶折疊的共同結(jié)構(gòu)框架的蛋白質(zhì)，既 可水解不溶性多聚體角質(zhì)，也可以作用于其它長鏈、短鏈脂肪酸酯、乳化的甘 油三酯和可溶性的合成酯等。除了水解反應(yīng)外，角質(zhì)酶還能參與酯化、轉(zhuǎn)酯化 等反應(yīng)。因此其在紡織業(yè)、食品工業(yè)以及生物催化、化工工業(yè)等諸多領(lǐng)域有著 廣泛的應(yīng)用前景，特別是在紡織工業(yè)的應(yīng)用是近幾年開發(fā)的新領(lǐng)域，它是繼堿 性果膠酶之后的另一種主要新型紡織品清潔生產(chǎn)的酶制劑。其同樣可以作為棉 織物生物精練處理過程中重要的酶制劑，其研制及在棉針織物精練中的應(yīng)用， 使另一種全新溫和的綠色精練方式成為可能。角質(zhì)酶在生物精練處理過程中， 能有效分解棉纖維表面疏水性的角質(zhì)和臘酯，使疏水性物質(zhì)從棉纖維表面脫落， 從而達(dá)到精練效果，而纖維本身不受到損傷，如果角質(zhì)酶和堿性果膠酶混合使 用處理棉纖維則效果更佳。因此，經(jīng)生物精練的棉纖維能最大程度的保持纖維 強(qiáng)度，失重小，織物手感柔軟厚實，且富有彈性，并且克服了傳統(tǒng)堿精練過程 中棉纖維損失較大，強(qiáng)度損傷嚴(yán)重及環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點。角質(zhì)酶雖然有很廣泛的應(yīng)用前景，但國內(nèi)外迄今為止并沒有工業(yè)化生產(chǎn)角 質(zhì)酶的成功實例，角質(zhì)酶市場仍處于空白。本實驗室通過基因手段構(gòu)建的產(chǎn) i^o/"w/ p/w'角質(zhì)酶工程菌是以作為宿主，此菌種表達(dá)量較高， 通過在搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化以及在3 L發(fā)酵罐上發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定了發(fā)酵工 藝，為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)并且填補(bǔ)國際角質(zhì)酶工業(yè)化生產(chǎn)空白，同時帶 來極高經(jīng)濟(jì)價值。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用基于pH分階段控制的溫度兩階段控制策略 發(fā)酵生產(chǎn)i^o/am》W角質(zhì)酶的方法，本發(fā)明的優(yōu)點在于工藝簡單易行，能有效 地提高角質(zhì)酶的產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度。本發(fā)明的技術(shù)方案菌種重組芽孢桿菌(Bac77/w swto'fe ) WSHB 06-07為出發(fā)菌株，該菌株 已在中國生物工程雜志 China Biotechnology, 2008， 28 (5): 59 64公開。菌體保持培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨IO，酵母膏5，氯化鈉10，甘油50%(v/v)。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨12，酵母膏24，磷酸氫二鈉12.54， 磷酸二氫鉀2.31， pH7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖32.5，蛋白胨37，酵母膏24，磷酸氫二鈉12.54， 磷酸二氫鉀2.31,七水硫酸鎂4.4， pH7.5。培養(yǎng)方法將保藏好的菌種接入種子培養(yǎng)基中，500mL三角瓶裝50mL培 養(yǎng)基，回轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速200r/min， 37°C，培養(yǎng)14-16 h。將培養(yǎng)好的種子以4% 接種量接入到3 L全自動發(fā)酵罐KBT(KoBio Tech Co., Ltd.,韓國)中，裝液量1 L; 兩階段控制策略發(fā)酵生產(chǎn)i^/am';^'角質(zhì)酶:菌體生長階段:控制溫度為3°C、 pH7.5、攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min、通氣量為1.5 wm直到菌體OD6oo達(dá)到12.65;高 效表達(dá)階段當(dāng)菌體OD6。。達(dá)到12.65，菌體生長進(jìn)入對數(shù)生長期后，將發(fā)酵溫 度降到3(TC、 pH6.5、攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min、通氣量為1.5vvm，直到發(fā)酵結(jié)束。角質(zhì)酶活性測定取稀釋適當(dāng)倍數(shù)的樣品900 ^L，加入100nL2mol/L的 NaOH溶液，混勻后于沸水浴中反應(yīng)10min，立即用流動冷水冷卻至室溫，再向 其中加入lmL間苯二酚和3 mL 10 mol/L的HC1，混勻后于沸水浴中反應(yīng)8 min， 立即用流動冷水冷卻至室溫，然后用分光光度計測定其500nm處的吸光度。本發(fā)明的有益效果利用本發(fā)明能大幅提高角質(zhì)酶的產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度，產(chǎn) 量由170U/mL提高到312U/mL,生產(chǎn)強(qiáng)度由11.74 U/mL/h提高到13.2U/mL/h， 并能夠減少發(fā)酵液中雜蛋白的含量，提高了產(chǎn)品純度和下游提取時的效率，并 且減少了能耗，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，彌補(bǔ)了角質(zhì)酶工業(yè)化生產(chǎn)的空白， 推動了角質(zhì)酶在棉紡織業(yè)的應(yīng)用，從而促進(jìn)紡織工業(yè)的發(fā)展。本發(fā)明采用基于pH分階段控制策略的溫度兩階段控制策略在3 L罐上發(fā)酵 達(dá)到先進(jìn)水平，并且對其它的重組菌的發(fā)酵具有一定的指導(dǎo)意義。
具體實施方式
實施例1:本發(fā)明所采用的菌株為重組芽孢桿菌(5ad//^ w6ft'to) WSHB 06-07，在菌體生長階段控制pH7.5、溫度37。C，攪拌轉(zhuǎn)速600r/min、通氣量為 1.5vvm;當(dāng)菌體OD6oo達(dá)到12.65時，將pH調(diào)至7.5和溫度調(diào)至30 °C、攪拌轉(zhuǎn) 速600r/min、通氣量為1.5wm直到發(fā)酵結(jié)束，角質(zhì)酶產(chǎn)量為312 U/mL，生產(chǎn)強(qiáng) 度為13.2U/mL/h。對照實施例2:發(fā)酵過程中恒定溫度為37""C，恒定攪拌轉(zhuǎn)速600r/min、通氣 量為1.5wm，菌體生長時控制pH7.5，當(dāng)菌體006()()達(dá)到12.65時，將pH調(diào)至 6.5直到發(fā)酵結(jié)束，角質(zhì)酶產(chǎn)量170U/mL，生產(chǎn)強(qiáng)度為11.74 U/mL/h。對照實施例3:發(fā)酵過程中恒定溫度為3(TC，恒定攪拌轉(zhuǎn)速600r/min、通氣 量為1.5wm，菌體生長時控制pH7.5，當(dāng)菌體006()。達(dá)到12.65時，將pH調(diào)至 6.5直到發(fā)酵結(jié)束，角質(zhì)酶產(chǎn)量243.12 U/mL,生產(chǎn)強(qiáng)度為9.35 U/mL/h。
權(quán)利要求
1、一種溫度兩階段控制策略發(fā)酵生產(chǎn)F.solani pisi角質(zhì)酶的方法，其特征是采用分泌性表達(dá)載體重組芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WSHB 06-07為出發(fā)菌株，兩階段控制策略發(fā)酵生產(chǎn)F.solani pisi角質(zhì)酶(1)菌體生長階段控制溫度為37℃、pH 7.5、攪拌轉(zhuǎn)速600r/min、通氣量為1.5vvm，直到菌體OD600達(dá)到12.65；(2)高效表達(dá)階段當(dāng)菌體OD600達(dá)到12.65，菌體生長進(jìn)入對數(shù)生長期后，將發(fā)酵溫度降到30℃、pH 6.5、攪拌轉(zhuǎn)速600r/min、通氣量為1.5vvm，直到發(fā)酵結(jié)束。
全文摘要
一種溫度兩階段控制策略發(fā)酵生產(chǎn)F.solani pisi角質(zhì)酶的方法，屬于環(huán)境因素分階段控制策略在發(fā)酵過程優(yōu)化中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用分泌性表達(dá)載體重組芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WSHB 06-07為出發(fā)菌株，在菌體生長階段控制溫度37℃和pH為7.5，當(dāng)菌體的OD₆₀₀達(dá)到12.65時，將溫度調(diào)至30℃和pH調(diào)至6.5直到發(fā)酵結(jié)束。采用此策略進(jìn)行發(fā)酵，最終實現(xiàn)了提高角質(zhì)酶產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度的目的。本發(fā)明的優(yōu)點在于工藝簡單易行，能有效地提高角質(zhì)酶的產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度，并能夠減少發(fā)酵液中雜蛋白的含量，提高了產(chǎn)品純度和下游提取時的效率，并且減少了能耗，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/125GK101323848SQ200810022620
公開日2008年12月17日 申請日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日
發(fā)明者敬 吳, 張芙華, 堅 陳 申請人:江南大學(xué)