專利名稱：：一種提高微生物發酵生產1,3-丙二醇濃度的方法
技術領域：
：本發明是一種微生物發酵制備1,3-丙二醇的方法，特別涉及添加抗生素，減少營養物質及代謝產物出入細胞的傳遞阻力,有效促進細胞生長和提高微生物發酵生產1,3-丙二醇濃度的方法，屬于1，3-丙二醇的代謝合成
技術領域：
。
背景技術：
：1，3-丙二醇(l，3-propanediol，簡稱1，3-PD)在常溫下是一種無色或淡黃色粘稠液體。1，3-丙二醇與對苯二甲酸反應，聚合成聚酯纖維聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，是目前合成纖維新品種開發的熱點。1,3-丙二醇的化學結構式為HOCH2CH2CH2OH，由于其具有奇數碳，且雙官能團位于兩端，它能夠和其他物質聚合形成連續的亞甲基鏈，所得聚合物具有良好的伸縮性和回復性。近年來，應用微生物代謝甘油合成1，3-丙二醇的研究得到了廣泛的關注，微生物發酵法生產1，3-丙二醇以其原料易得、可利用再生資源、對環境友好展示了其美好的發展前景。我國已把大力發展1，3-丙二醇等單體原料列入《生物產業發展"十一五"規劃》，明確提出在以丙二醇、乙二醇、丁二醇等生物基多元醇聚酯纖維的技術開發和產業化方面進行重點突破，立足自主研發和創新，積極推進以生物質工程技術為核心的綠色生態纖維及材料的發展，實現我屈纖工業的產業升級。微生物發酵法生產l,3-丙二醇一般以甘油為底物，為了獲得高濃度l，3-丙二醇，人們對于發酵底物以及發酵工藝進行了大量的研究和探討。在發酵過程中，加入的物質和產生的副產物都會細胞代謝過程產生影響。1，3-丙二醇最終濃度的高低主要取決于細胞對底物、產物及副產物的耐受程度及代謝的酶活性；在1,3-丙二醇發酵過程中，細胞的生長與代謝受到底物和多種產物的抑制作用(Biebl1991;Zeng,etal.1994;Colin,etal.2000)。為了提高1,3-丙二醇產量和底物轉化率，必須克服底物甘油、產物1,3-丙二醇和其它副產物對細胞生長的抑制作用。[1]BieblH.Glycerolfermentationtol，3-propanedoilbyC/o,"rW謂6w/)r/c謡MeasurementofproductinhibitionbyuseofapH-auxostat.ApplMicrobiolBiotectnol1991，35:701~705[2]ZengAP，RossA,HibelHetal.MultipleproductinhibitionandgrowthmodelingofC7oWnVi/i//M6w/yn.cw附andA7e6j7.e〃a/wew附ow/aeinglycerolfermentation.BiotechnolBioeng1994,44:902-911[3]ColinT，BoriesA,MoulinG.InhibitionofC7oWrW謂6t^".c訓byl，3-propanedoilanddiolsduringglycerolfermentation.ApplMicrobiolBiotectnol2000，54:201205王婭君等和陳宏文等各自研究了不同底物對細胞內代謝甘油產生1,3-丙二醇三種關鍵酶活的影響以及發酵中的酶活變化，為培養基優化和營養物質的流加提供了幫助。蔣潔等認為，在發酵初始培養基中加入微量的乙酸能夠提高l，3-丙二醇的產量，但乙酸的添加會影響菌體生長。趙紅英等針對底物抑制現象，提出了菌種馴化和流加甘油發酵兩種解決途徑，結果表明采用經馴化培養獲得的耐底物抑制菌株菌株發酵，并控制甘油流加，可將最終1，3-丙二醇濃度和轉化率分別提高到53.0%和27.0%。[4〗王婭君，趙莉，徐佳杰等，克雷伯氏肺炎桿菌生產l,3-丙二醇代謝途徑中的酶活變化，華東理工大學學報:自然科學版2007，34(4):481-484.[5]陳宏文，王蔚，方柏山等，克雷伯桿菌生產l,3-丙二醇關鍵酶發酵條件研究，高校化學工程學報2004,18(5):621-627.問蔣潔，張栩，譚天偉，乙酸對l，3-丙二醇發酵的影響，北京化工大學學報2005，32(5):36-38.[7]趙紅英，張健，劉宏娟等，1，3-丙二醇發酵過程中底物抑制及其對策的研究，現代化工2002,22(7):34-38.細胞的通透性直接影響物質的吸收和代謝產物的分泌，從而影響到細胞內代謝的變化。細胞通透性的調節是微生物代謝調節的重要方式，外界物質的吸收或代謝產物的分泌都需經細胞膜的運輸，此外，細胞壁與細胞膜間還具有周質空間，含有蛋白酶、核酸酶和運送物質的結合蛋白等，如果細胞壁與細胞膜發生障礙，則胞內合成代謝物不能分泌出來，影響發酵產物收獲，或胞外營養物不能進入胞內，也影響細胞生長和產物合成，使產量下降。4從文獻中己知抗生素能有效地強化生物合成是與提高細胞透性有關(李柏林1997;張和春2002;鄒祥2005;劉俊紅2006)。當加入作用細菌細胞壁合成的抗生素(青霉素，頭孢菌素，桿菌肽，D-環絲氨酸)，加入影響細胞膜功能的抗生素(多粘菌素B，制霉菌素，兩性霉素，纈氨霉素)，可減少營養物質及代謝產物出入細胞的傳遞阻力，解除細胞透性對物質吸收和代謝產物分泌的障礙，解決發酵產物、副產物對微生物細胞生長和催化活性的抑制。因此，在微生物發酵過程中添加抗生素對增加終產物濃度，提高生產效率，縮短反應周期，降低生產成本，具有重要的現實意義。[8〗李柏林，儲炬，李友榮等，胞壁合成對慶大霉素生物合成的影響，中國抗生素雜志1997，22(4):246-249.[9]張和春，范衛民，張元興等，調節細胞通透性促進天藍色鏈霉菌藍色素生物合成。應用與環境生物學報2002，8(5):540543.[10]鄒祥，廖志華，周小里等，重組大腸桿菌產戶胡蘿卜素的發酵條件食品與生物技術學報2005,24(3):72-75.[11]劉俊紅，劉順誼，殷志敏，乳糖誘導大腸桿菌中重組谷氨酰胺合成酶的表達.南京師大學報(自然科學版)2006，29(3):66-70.微生物代謝合成過程中，細胞質膜和細胞壁的結構影響物質的進出，當控制物理、化學條件改進物質的進出速率，都有可能造成代謝產物的過量生產。本發明在l，3-丙二醇發酵過程中，采用添加抗生素減少營養物質及代謝產物出入細胞的傳遞阻力，一方面加快物質傳遞運輸，增加胞內胞外的物質平衡，從而提高提高細菌的生長和生產能力，繼而提高產物l，3-丙二醇濃度；另一方面促使微生物代謝產物易于分泌至胞外，利于消除產物、副產物抑制，特別是減少l,3-丙二醇對細胞生長和細胞催化活性的抑制，從而有利于l，3-丙二醇合成，有效提高微生物發酵生產l，3-丙二醇濃度。
發明內容技術問題本發明的目的在于提供一種通過添加抗生素減少營養物質及代謝產物出入細胞的傳遞阻力，一方面加快物質傳遞運輸，增加胞內胞外的物質平和生產能力，提高產物1,3-丙二醇濃度；另一方面促使微生物代謝產物易于分泌至胞外，利于消除產物、副產物抑制，特別是減少1，3-丙二醇對細胞生長和細胞催化活性的抑制，從而有利于1，3-丙二醇代謝合成，有效提高微生物發酵生產1，3-丙二醇濃度的方法。技術方案本發明的目的是提供一種有效提高微生物發酵生產1，3-丙二醇濃度方法，所涉及到的發酵菌種可以是克雷伯氏菌、弗氏檸檬菌、丁酸梭狀芽孢桿菌。本發明利用添加抗生素減少營養物質及代謝產物出入細胞的傳遞阻力，加快物質傳遞運輸的能力，促進細胞生長和產物合成；解決產物、副產物對細胞生長和細胞催化活性的抑制，提高發酵產物1，3-丙二醇濃度，其工藝過程為a.二級種子液制備取新鮮固體斜面菌種，接種于搖瓶種子培養基中，30。C35。C搖床，150rpm培養1224h,再接種到搖瓶種子培養基中，30°C~35°C培養1016h,制成二級種子培養液備用，b.發酵培養20-80g/L工業甘油做碳源，裝液量40%~75%，以體積比3%~15%的接種量將二級種子培養液接到其中，溫度34。C38。C，pH6.2~7.5，150400rpm培養2040h;中間間隔取樣測細胞濃度和產物l，3-丙二醇濃度，在發酵培養024小時，加入不同濃度、不同種類的抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加，發酵生產1，3-丙二醇的菌種包括克雷伯氏菌、弗氏擰檬菌、丁酸梭狀芽孢桿菌中的一種。以克雷伯氏菌發酵生產1，3-丙二醇，接種量10%，溫度34~37°C，轉速150400rpm，間歇式培養、補料分批式培養20~40h。發酵生產1,3-丙二醇過程中添加的抗生素為抑制細胞壁合成的青霉素、頭孢菌素、桿菌肽、D-環絲氨酸、影響細胞膜功能的多粘菌素B、制霉菌素、兩性霉素、纈氨霉素中的一種。發酵生產l,3-丙二醇過程中，在發酵培養0-24小時添加抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加，濃度范圍0.00110g/L。有益效果本發明提供了簡便有效經濟的發酵工藝，解決發酵終產物產量低以及發酵過程產物、副產物對細胞生長和細胞催化活性的抑制，減少營養物質及代謝產物出入細胞的傳遞阻力，最終將發酵產物1,3-丙二醇濃度提高了10%70%，代謝過程控制簡單，操作方便，易于實現工業化應用。具體實施方式菌種克雷伯肺炎桿菌(尺/7"e"wo"/"e)固體斜面培養基牛肉膏3g/L，MgS(V7H200.2g/L,蛋白胨5g/L，NaCl10g/L，瓊脂20g/L，甘油20g/L。搖瓶種子培養基酵母膏2g/L，MgS04*7H200.2g/L，檸檬酸0.42g/L，K2HP041.6g/L，K2HP043.4g/L,NH4C13.0g/L，甘油30g/L,CaCl20.5g/L。發酵培養基甘油2080g/L，K2HP04*3H201.36g/L，NH4C13.0g/L，酵母膏2.0g/L，MgS04'7H200.2g/L,CaCl22.0鐵溶液lmL/L，無機離子溶液2mL/L,Vbi2溶液1hiL/L，鈷溶液lmL/L。無機離子含CuCl2，H3B03,MnCl2,Na2Mo04，NiCl2，ZnS04，微量元素含量約在0.01~50mg/L。搖瓶二級種子液制備取新鮮固體斜面菌種，接種于搖瓶種子培養基中，30。C35。C搖床，150rpm培養1224h，再接種到搖瓶種子培養基中，30°C~35°C培養1016h，制成二級種子培養液備用。分批發酵培養20~80g/L工業甘油做碳源，裝液量40%~75%，以體積比3%~15%的接種量將二級種子培養液接到其中，溫度34°C~38°C，pH6.2~7.5，150400rpm培養2040h;中間間隔取樣測細胞濃度和產物1，3-丙二醇濃度。在發酵培養024小時，加入不同濃度、不同種類的抗生素，間隔取樣測細胞濃度和產物1,3-丙二醇濃度。添加的抗生素是，濃度范圍0.001~10g/L。抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加。實施例一菌種克雷伯肺炎桿菌(尺.p恥w附om'ae)400ml含45g/L工業甘油的發酵培養基置于1L搖瓶中，接入體積40ml二級種子液，溫度37'C，搖床180rpm培養。在發酵8h分別加入氨芐青霉素，使發酵液中氨芐青霉素的含量分別為0~500mg/L。每隔一段時間取樣一次，分光光度計比濁法測量細胞濃度，波長650nm，細胞濃度即菌體量表示為OD;氣相色譜分析1，3-丙二醇的濃度。24小時結束發酵。表1氨芐青霉素添加量對1，3-丙二醇產出影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例一研究了在發酵甘油生產l,3-丙二醇工藝中，添加氨芐青霉素，濃度從0500mg/L范圍內，不同氨芐青霉素濃度對克雷伯肺炎桿菌生長和l,3-丙二醇產量的影響。從發酵24h的菌體生長和l,3-丙二醇生產情況(見表l)來看，加入氨芐青霉素對菌體生長和產物合成有促進作用，適宜濃度氨芐青霉素有助于提高l,3-丙二醇產量，當添加量為200mg/L時，1,3-丙二醇產量提高了27.6%,轉化率提高了43.4%。分析以上結果的原因，添加氨芐青霉素的發酵培養工藝，氨芐青霉素作為抗生素，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有一定的作用，其機理為抑制細菌細胞壁的合成，與細胞膜相互作用而影響膜的滲透性。在微生物發酵過程中加入適當濃度的氨芐青霉素可以改變細胞的通透性而不致于殺死細菌，從而可加快物質傳遞運輸，增加胞內胞外的物質平衡，從而提高提高細菌的生長和生產能力，提高產物1，3-丙二醇濃度。但是隨著氨芐青霉素濃度的提高，氨芐青霉素對微生物生長也表現出一定的毒害作用，菌體生長受抑。實施例二400ml含45g/L工業甘油的發酵培養基置于1L搖瓶中，接入體積40ml二級種子液，溫度37°C，搖床180rpm培養。分別在4h、8h、12h、16h及20h加入200mg/L氨芐青霉素并且調節其pH值。兩個平行樣取平均值，實驗結果如下(表2)。表2氨芐青霉素加入時間的對1，3-丙二醇產量影響氨芐青霉素不同時間加入1，3-丙二醇相對百分含量(%)不加100.04h加入80.88h加入88.712h加入113.616h加入134.820h加入104.4從上表可知，在發酵不同時期加入氨芐青霉素對l,3-丙二醇的產出有較大影響，在發酵前期與中期添加氨芐青霉素，對l，3-丙二醇的生物合成不利，原因在于菌體在這個時期尚未到達生長穩定期，大部分增殖細胞胞壁合成不完全甚至整個胞壁合成受阻，導致菌體無法正常代謝增殖。在發酵中后期16小時添加氨芐青霉素，1，3-丙二醇產量提高了34.8%。所以在不影響細胞正常生長的條件下，添加氨芐青霉素提高了細胞的通透性，加大了細胞分泌l，3-丙二醇的能力。過晚加入青霉素，作用不大。工業發酵生產l，3-丙二醇，主要是腸道細菌，細胞生長產生莢膜，并覆蓋在細胞表面，造成胞壁與質膜通透性差。添加抗生素改變細胞的通透性，減少營養物質及代謝產物出入細胞的傳遞阻力，對代謝產物的合成有顯著促進作用，此外細胞通透性的增加可有效地解除產物對自身的反饋抑制，這為提高l,3-丙二醇的產量提供了保障。對比抗生素添加后克雷伯肺炎桿菌細胞形態變化，發現抗生索添加后細胞莢膜消失，細胞從小的短桿形變成非正常的伸長和膨大，隨著菌齡增加其受抑制作用逐漸減弱，非正常伸長和膨大的細胞數量減少。當青霉素添加量過大時，大部分增殖細胞胞壁合成不完全甚至整個胞壁合成受阻，導致菌體無法正常代謝增殖。因此當菌體處于穩定期，加入適當濃度的青霉素，改善細胞通透性，可促進l,3-丙二醇分泌，部分解除產物抑制。實施例三5L發酵罐，裝液量3.8L，接入200ml二級種子液。控制溫度37。C，用4mol/L的NaOH調節pH維持在6.87.0，攪拌速率在300r/min~450r/min，通氣量在0.4vvm2.8vvm，流加甘油使濃度穩定在20g/L~30g/L，分別在12h、15h、18h、21h添加氨芐青霉素，每次加入50mg/L,中間每隔4h取樣，測生物量、甘油濃度和產物l,3-丙二醇濃度。發酵30小時，與不添加氨芐青霉素相比，1，3-丙二醇濃度提高了43.7%。通過上述實驗可以證明，在甘油發酵生產l，3-丙二醇代謝途徑中，通過添加抗生素增加細胞的通透性，可有效促進細胞生長，提高發酵終產物1,3-丙二醇濃度工藝簡便經濟。權利要求1、一種提高微生物發酵生產1，3-丙二醇濃度的方法，其特征在于利用添加抗生素減少營養物質及代謝產物出入細胞的傳遞阻力，加快物質傳遞運輸的能力，促進細胞生長和產物合成；解決產物、副產物對細胞生長和細胞催化活性的抑制，提高發酵產物1，3-丙二醇濃度，其工藝過程為a.二級種子液制備取新鮮固體斜面菌種，接種于搖瓶種子培養基中，30℃～35℃搖床，150rpm培養12～24h，再接種到搖瓶種子培養基中，30℃～35℃培養10～16h，制成二級種子培養液備用，b.發酵培養20～80g/L工業甘油做碳源，裝液量40％～75％，以體積比3％～15％的接種量將二級種子培養液接到其中，溫度34℃～38℃，pH6.2～7.5，150～400rpm培養20～40h；中間間隔取樣測細胞濃度和產物1，3-丙二醇濃度，在發酵培養0～24小時，加入不同濃度、不同種類的抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加。2、根據權利要求1所述的提高微生物發酵生產1,3-丙二醇濃度的方法，其特征在于發酵生產1,3-丙二醇的菌種包括克雷伯氏菌、弗氏檸檬菌、丁酸梭狀芽孢桿菌中的一種。3、根據權利要求2所述的提高微生物發酵生產1,3-丙二醇濃度的方法，其特征在于以克雷伯氏菌發酵生產1,3-丙二醇，接種量10%，溫度34~37°C,轉速150400rpm，間歇式培養、補料分批式培養20~40h。4、根據權利要求1所述的提高微生物發酵生產1,3-丙二醇濃度的方法，其特征在于發酵生產1，3-丙二醇過程中添加的抗生素為抑制細胞壁合成的青霉素類、頭孢菌素類、桿菌肽、D-環絲氨酸、影響細胞膜功能的多粘菌素B、制霉菌素、兩性霉素、纈氨霉素中的一種。5、根據權利要求4所述的提高微生物發酵生產1,3-丙二醇濃度的方法，其特征在于發酵生產1，3-丙二醇過程中，在發酵培養0-24小時添加抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加，濃度范圍0.001~10g/L。全文摘要一種提高微生物發酵生產1，3-丙二醇濃度的方法特別涉及添加抗生素，減少營養物質及代謝產物出入細胞的傳遞阻力，有效促進細胞生長和提高微生物發酵生產1，3-丙二醇濃度的方法，其工藝過程為在發酵培養液中接入二級種子培養液，同時向發酵液中添加能改善細胞通透性的抗生素，添加抗生素改變細胞通透性，減少營養物質及代謝產物出入細胞的傳遞阻力，從而促進菌體的生長和生產能力，提高產物1，3-丙二醇濃度；并且還促使微生物將代謝產物分泌至胞外，降低代謝產物在細胞內的積累，利于消除產物、副產物抑制，特別是減少1，3-丙二醇對細胞生長和細胞催化活性的抑制，最終將發酵產物1，3-丙二醇濃度提高10％~70％。該工藝過程簡便，生產成本低。文檔編號C12R1/145GK101323863SQ20081002264公開日2008年12月17日申請日期2008年7月18日優先權日2008年7月18日發明者敏吳,苗茂棟,鄭穎平申請人:東南大學