專利名稱：：一種提取食用油脂中核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種提取食用油脂中核酸的方法。
背景技術(shù)：
：DNA提取技術(shù)的建立是保障PCR或相應(yīng)下游實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵，到目前為止，保存較好的生物材料、加工或部分深加工生物材料基本均可做到利用生物
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的DNA提取技術(shù)(普通DNA提取試劑或利用市售特殊裝置如純化柱法、磁珠法、超濾離心法等)順利完成適用DNA的提取過(guò)程。就利用PCR等技術(shù)進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)而言，許多實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常遇到特殊的實(shí)驗(yàn)材料難以提取到適用于PCR或相應(yīng)下游實(shí)驗(yàn)的DNA的問(wèn)題，食用油脂是該特殊實(shí)驗(yàn)材料中的一種。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外諸多相關(guān)實(shí)驗(yàn)室均力圖建立可重復(fù)的、穩(wěn)定的食用油脂中適用于PCR或相應(yīng)下游實(shí)驗(yàn)的DNA提取方法，但至今尚未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可重復(fù)的、穩(wěn)定的食用油脂中適用于PCR的DNA的提取方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所述的提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步驟進(jìn)行(1)食用油脂中極性成分的萃取采用水作為萃取劑，用離心的方法進(jìn)行油液分離；(2)萃取液的濃縮全部轉(zhuǎn)移萃取液于電熱恒溫干燥設(shè)備或其它干燥設(shè)備內(nèi)，充分干燥；(3)食用油脂中DNA的粗提；(4)粗提DNA的純化。上述步驟(1)中，在萃取過(guò)程中，必須采取離心等方法去除油水界面物質(zhì)，根據(jù)下層水相渾濁程度分多次共需萃取初搾大豆油約400mL-600mL、初搾菜籽油約700mL-1000mL、初榨玉米油約700mL-1000mL、各種精練油約2000-3000mL、花生油、芝麻油等約400mL-600mL、棕櫚油600mL-800mL。當(dāng)待測(cè)油脂為初榨大豆油時(shí)，步驟(3)中DNA的粗提按照以下方法進(jìn)行取預(yù)熱至約80-90°CCTAB提取液8-10mL，分多次小心洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物轉(zhuǎn)移至15mL離心管。加入等體積的船/氯仿/異戊醇，充分震蕩約30s，7500Xg室溫離心lOmin;分別小心吸取上清至另一15mL離心管，再次加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加入0.2至0.3倍體積的預(yù)冷異丙醇，充分上下倒置混勻，置0。C約20-40min后10000-12500Xg，4。C離心6min，沉淀置(TC待用；上清于27000-30OOOXg，4。C離心10min，棄取上清，沉淀加入500yL70%_80%預(yù)冷的乙醇，充分上下倒置混勻，27000-30000Xg，4。C離心5min，棄去上清，置核酸真空干燥儀干燥；上述10000-12500Xg離心所獲沉淀加入約1200uL70%_80%預(yù)冷的乙醇，充分上下倒置混勻，27000-30000Xg，4'C離心5min，棄去上清，置核酸真空干燥儀干燥。當(dāng)待測(cè)的油脂為初搾菜籽油、玉米油、花生油、芝麻油、棕櫚油、棉籽油或各種精煉油等時(shí)，步驟(3)中DNA的粗提按照以下方法進(jìn)行取預(yù)熱至約80-90。CCTAB提取液8-10mL，充分溶解干燥的萃取物于15mL離心管，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，充分震蕩約30s，7500Xg室溫離心10min;上清按1/10體積加入3MNaAc，混勻，加入LA溶液，混勻，加入等體積異丙醇，混勻，-20。C靜置約40min-60min后，27000-30OOOXg，4。C離心10min，棄取上清，沉淀加入500uL70%-80%預(yù)冷的乙醇，充分上下倒置混勻，27000-30OOOXg，4'C離心5min，棄去上清，置核酸真空干燥儀干燥。所述步驟(4)粗提DNA的利用特制的長(zhǎng)片段核酸富集純化裝置來(lái)進(jìn)行，該長(zhǎng)片段核酸富集純化裝置包括一個(gè)筒狀主體1，在兩端開(kāi)口端口包覆半透膜2，在筒狀主體上設(shè)有取液孔3和加樣槽4，取樣孔3帶有膠塞5。在加樣槽下方的部分筒狀主體內(nèi)充填有瓊脂糖凝膠，而取液孔下方的部分筒狀主體保持為空腔，用作注入電泳緩沖液。具體的操作方法如下(a)電泳槽加入電泳緩沖液；(b)取液孔下方的部分筒狀主體的空腔加滿電泳緩沖液，并蓋緊取液孔膠塞；(C)將核酸富集純化裝置浸入電泳槽內(nèi)電泳緩沖液中；(d)待純化核酸與上樣緩沖液(含指示染料)混勻后，加入到加樣槽，并通電；(e)待指示染料條帶全部進(jìn)入取液孔下方緩沖液中，棄去取液孔下方的緩沖液；(f)重新注滿電泳緩沖液于取液孔下方的空腔，蓋緊取液孔膠塞，重新放入電泳槽中，繼續(xù)通電電泳，收集取液孔下方空腔的緩沖液進(jìn)行酚氯仿抽提。本方法適用于初榨大豆油、菜籽油、玉米油，精練大豆油、菜籽油、玉米油、多種調(diào)和油，以及花生油、芝麻油、橄欖油、棉籽油、棕櫚油等食用油脂的適用于PCR或相應(yīng)下游實(shí)驗(yàn)的DNA的提取。以下將通過(guò)本具體地實(shí)施方式來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。圖1A大豆油內(nèi)源基因檢測(cè)電泳圖譜；圖1B菜籽油內(nèi)源基因檢測(cè)電泳圖譜圖1C玉米油內(nèi)源基因檢測(cè)電泳圖譜圖1D其余多種植物油內(nèi)源基因檢測(cè)電泳圖譜；圖1E其余多種植物油內(nèi)源基因檢測(cè)電泳圖譜圖2A初榨大豆油、精煉大豆油內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)圖譜(含陽(yáng)性參比、陰性參比、試劑空白)圖2B初榨大豆油、精練大豆油抗除草劑基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)圖譜(含陽(yáng)性參比、陰性參比、試劑空白)圖2C初搾大豆油、精練大豆油NOS終止子基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)圖譜(含陽(yáng)性參比、陰性參比、試劑空白)圖2D初榨大豆油、精練大豆油35S啟動(dòng)子基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)圖譜(含陽(yáng)性參比、陰性參比、試劑空白)圖2E初榨菜籽油、精練菜籽油內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)圖譜(含陽(yáng)性參比、陰性參比、試劑空白)圖2F初榨玉米油、精練玉米油內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)圖譜(含陽(yáng)性參比、陰性參比、試劑空白)圖2G花生油、芝麻油、棉籽油、棕櫚油、橄欖油植物內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)圖譜(含陽(yáng)性參比、陰性參比、試劑空白)圖3如圖所示為所述的長(zhǎng)片段核酸富集純化裝置的結(jié)構(gòu)示意圖具體實(shí)施例方式1.試劑(全部試劑均為生物級(jí)別或優(yōu)級(jí)純級(jí)別)1.1生物級(jí)別用水1.2CTAB裂解液:3%CTAB(w/w),1.4mmol/L氯化鈉，0.2%(v/v)巰基乙醇，20咖ol/LEDTA，100mmol/LTris-HC1，pH8.01.3TE緩沖液(pH8.0):量取10mL1mol/LTris-Cl(pH8.0)和2mL0.5raol/LEDTA(pH8.0),加水定容至1000mL，分裝后高壓滅菌備用1.4酚氯仿異戊醇(體積比25:24:1)1.5異丙醇1.675%乙醇(v/v)1.7LA溶液1.8溴化乙錠lmg/mL1.9DNA:分子量標(biāo)記物100bp-2000bp、1000-20000bp1.10瓊脂糖1.1150XTAE緩沖液稱取484gTris，量取114.2mL冰乙酸，200mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，溶于蒸餾水中，定容至2L。分裝后高壓滅菌備用。使用時(shí)，50倍稀釋1.1210X上樣緩沖液:含0.25%溴酚藍(lán)(w/v)，0.25。/。二甲苯青FF(w/v)，30%甘油(v/v)水溶液1.13氯化鎂1.14dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP1.157kDNA聚合酶1.16引物和探針引物濃度為20pmo1/L，探針濃度為20pmo1/L1.17DNA:分子量標(biāo)記100bp-2000bp1.18PCR反應(yīng)緩沖液1.19UNG酶2.設(shè)備和材料2.1高速冷凍離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速18000r/min)2.2臺(tái)式離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速18000r/min)2.3微型個(gè)人離心機(jī)2.4雙溫水浴(37°C±1。C、65°C±1°C)2.5制冰機(jī)2.6電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱或其它干燥設(shè)備2.7冰箱(2°C8°C、-20°C)2.8超純水發(fā)生器(分子生物學(xué)級(jí)別)2.9雙蒸水器2.10生物安全柜2.11高壓滅菌鍋2.12核酸真空干燥系統(tǒng)2.13核酸蛋白分析儀2.14凝膠成像分析系統(tǒng)2.15電泳儀2.16電泳槽2.17實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀2.18基因擴(kuò)增儀2.19PCR反應(yīng)管200PL2.20超凈工作臺(tái)2.21微量可調(diào)移液器及配套吸頭(2.5PL10PL、2叱20PL、10叱100叱、50PL200PL、100叱1000HL、500|-iL5000PL)。2.22離心管(1.5mL、2mL、15mL、50mL)。2.23表面皿(直徑15cm-20cm)3.實(shí)驗(yàn)方法3.1食用油脂中極性成分的萃取取50mL離心管4支，每支分別加入25mL雙蒸水;每支分別加入25mL油樣(棕櫚油需加入適量正己烷，使其在室溫下呈溶解狀態(tài))，充分震蕩2min(約300次)，10OOOXg室溫離心5min，棄取上層油液；再次加入油樣，同上震蕩、離心，并棄上層油液；同上述操作反復(fù)萃取至下層水相盡量渾濁，在萃取過(guò)程中，必須采取離心等方法去除油水界面物質(zhì)，根據(jù)下層水相渾濁程度分多次共需萃取初榨大豆油約400mL-600mL、初榨菜籽油約700niL-1000mL、初榨玉米油約700mL-lOOOmL、各種精練油約2000-3000mL、花生油、芝麻油等約400mL-600mL、棕櫚油600mL-800mL。樣品極性成分過(guò)低可適當(dāng)增加樣品量。3.2萃取液的濃縮全部轉(zhuǎn)移萃取液(下層水相)分多次置一表面皿中，于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱或其它干燥設(shè)備內(nèi)，充分干燥。3.3食用油脂中DNA的粗提3.3.1初榨油脂(植物油)中的DNA粗提3.3.1.1初搾大豆油中DNA的粗提取預(yù)熱至約80-90°CCTAB提取液8_10mL，分多次小心洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物轉(zhuǎn)移至15mL離心管。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，充分震蕩約30s，7500Xg室溫離心10min;分別小心吸取上清至另一15mL離心管，再次加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加入0.2至0.3倍體積的預(yù)冷異丙醇，充分上下倒置混勻，置0卩約20-40min后10000-12500Xg，4。C離心6min，沉淀置0。C待用；上清于27000-30000Xg，4'C離心10min，棄取上清，沉淀加入500PL70%_80%預(yù)冷的乙醇，充分上下倒置混勻，27000-30OOOXg，4。C離心5rain，棄去上清，置核酸真空干燥儀干燥；上述10000-12500Xg離心所獲沉淀加入約1200uL70%-80%預(yù)冷的乙醇，充分上下倒置混勻，27000-30OOOXg，4。C離心5min，棄去上清，置核酸真空干燥儀干燥。取預(yù)熱至約80-90°CTE緩沖液溶解干燥提取物，此為初榨大豆油DNA粗提物。3.3.1.2初榨菜籽油中DNA的粗提取預(yù)熱至約80-9CTCCTAB提取液8-10mL，分多次洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物轉(zhuǎn)移至15mL離心管，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，充分震蕩約30s,7500Xg室溫離心lOmin;上清按1/10體積加入3MNaAc，混勻，加入LA溶液，混勻，加入等體積異丙醇，混勻，-2(rC靜置約40min-60min后，27000-30OOOXg，4'C離心10min，棄取上清，沉淀加入500uL70%-80%預(yù)冷的乙醇，充分上下倒置混勻，27000-30000Xg，4。C離心5min，棄去上清，置核酸真空干燥儀干燥。加入適量預(yù)熱至約80-9(TC的TE緩沖液充分溶解干燥提取物，此為初榨菜籽油DNA粗提物。3.3.1.3初榨玉米油中DNA的粗提同初榨菜籽油。3.3.1.4各種精練油中DNA的粗提同初榨菜籽油。3.3.1.5花生油、芝麻油、棕櫚油等油脂中DNA的粗提同初搾菜籽油。3.4粗提DNA的純化按2iiL上樣緩沖液/15uL樣品的比例加入IOX上樣緩沖液(含指示染料)于DNA粗提物，混勻。利用特制的長(zhǎng)片段核酸富集純化裝置，按操作說(shuō)明純化并收集純化液。如圖所示為所述的長(zhǎng)片段核酸富集純化裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。該裝置包括一個(gè)透明的筒狀主體l，在兩端開(kāi)口端口通過(guò)密封膠蓋8包覆半透膜2，在筒狀主體上設(shè)有取液孔3和加樣槽4，取樣孔3帶有膠塞5。在加樣槽下方的部分筒狀主體內(nèi)充填有瓊脂糖凝膠，而取液孔下方的部分筒狀主體保持為空腔，用作注入電泳緩沖液。具體的操作說(shuō)明如下(a)電泳槽加入電泳緩沖液；(b)打開(kāi)核酸富集純化裝置取液孔膠塞5，用一次性滴管加電泳緩沖液于取液孔內(nèi)，至加滿，蓋緊取液孔膠塞；(c)將核酸富集純化裝置浸入電泳槽內(nèi)電泳緩沖液中；(d)待純化核酸與上樣緩沖液(含指示染料)混勻后，加入到加樣槽，打開(kāi)電源，按10V/cm調(diào)整電壓，并通電；指示染料的分子量比目標(biāo)核酸的分子量稍小。(e)待指示染料條帶全部進(jìn)入取液孔下方緩沖液中(即或繼續(xù)電泳30-60min)，從電泳槽取下富集純化裝置，打開(kāi)取液孔膠塞，用另一支一次性滴管吸出取液孔內(nèi)全部液體，加入少量電泳緩沖液于取液孔內(nèi)，反復(fù)小心吸排沖洗后吸出；當(dāng)指示染料條全部進(jìn)入取液孔下方緩沖液中時(shí)，表明分子量比染料的分子量小的DNA等雜質(zhì)巳從凝膠進(jìn)入到取液孔下方的緩沖液中，并且由于半透膜的截留，這些雜質(zhì)停留在取液孔下方的緩沖液中，棄去這部分緩沖液，則去除了分子量比目的DNA小的雜質(zhì)。(f)重新注滿電泳緩沖液于取液孔內(nèi)，蓋緊取液孔膠塞，重新放入電泳槽中，繼續(xù)通電，約5-6小時(shí)(可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間)后，關(guān)閉電源；(g)打開(kāi)取液孔膠塞，用另一支干凈的一次性滴管吸出取液孔下方全部液體，于一支1.5mL或2mL離心管，加入少量電泳緩沖液于取液孔內(nèi)，反復(fù)小心吸排沖洗后吸出并同樣轉(zhuǎn)移至該離心管，盡量控制總體積在1.6mL內(nèi)；混勻上述(g)步驟收集的液體釆用酚/氯仿法再次抽提。具體方法為加入等體積酚/氯仿/異戊醇，充分震蕩約30s，7500Xg室溫離心10min;分別小心吸取上清至另一1.5mL離心管，按1/10體積加入3MNaAc，混勻，加入LA溶液，混勻，加入等體積異丙醇，混勻，-20。C靜置約40min-60min后，27000-30000Xg，4。C離心10rain，棄取上清，沉淀加入500yL70%-80%預(yù)冷的乙醇，充分上下倒置混勻以清洗沉淀，27000-30000Xg，4'C離心5min，棄去上清，置核酸真空干燥儀干燥。取預(yù)熱至約80-90°CTE緩沖液30-50uL充分溶解干燥提取物，此即為DNA純化產(chǎn)物。3.5DNA含量的測(cè)定吸取5uLDNA純化產(chǎn)物，適當(dāng)稀釋，選擇0.D.值在0.4-0.8之間讀數(shù)，計(jì)算DNA濃度，調(diào)整DNA濃度為100ng/pL，PCR待用。3.6內(nèi)源基因的PCR檢測(cè)經(jīng)上述操作所獲得的DNA必須利用普通PCR或熒光PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到其相應(yīng)的內(nèi)源基因，方可確定提取到適用的DNA，并可進(jìn)一步進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。3.6.1普通PCR定性檢測(cè)3.6.1.1普通PCR定性檢測(cè)所用引物序列及反應(yīng)參數(shù)普通PCR定性檢測(cè)所用引物序列及反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表1表l普通PCR定性檢測(cè)所用引物序列及反應(yīng)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>試劑反應(yīng)體系中的終濃度注UNG酶在活化條件下可以降解含有dU的雙鏈或單鏈DNA。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中加入U(xiǎn)NG酶，可以有效防止以前以dUTP代替dTTP合成的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所致的遺留污染。實(shí)驗(yàn)室如果選擇采用UNG酶作為防止污染措施，可在每次PCR反應(yīng)的反應(yīng)休系中以dUTP代替dTTP并加入U(xiǎn)NG酶；否則，反應(yīng)體系中不必加入U(xiǎn)NG酶，dNTP溶液為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。3.6.1.3PCR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)制備2%的瓊脂糖凝膠，按常規(guī)電泳方法，以100bpLadderDNAMarker作為分子量標(biāo)記，進(jìn)行電泳。電泳后，利用凝膠成像儀觀察特異性泳帶的出現(xiàn)，并拍攝作成像記錄。3.6.2實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)3.6.2.1實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)所用引物序列和探針序列實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)所用引物序列和探針序列見(jiàn)表3表3實(shí)時(shí)熒光PCR所用引物和探針序列<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>試劑反應(yīng)體系中的終濃度注UNG酶在活化條件下fiJ以降解含有dU的雙鏈或單鏈DNA。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中加入U(xiǎn)NG酶，可以有效防止以前以dLlTP代替dTTP合成的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所致的遺留污染。實(shí)驗(yàn)室如果選擇采用UNG酶作為防止污染措施，可在每次PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系中以dUTP代替dTTP并加入U(xiǎn)NG酶；否則，反應(yīng)體系中不必加入U(xiǎn)NG酶，dNTP溶液為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。3.6.2.3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表5。使用不同實(shí)時(shí)熒光PCR儀，可對(duì)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。表5實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)1)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注反應(yīng)休系中不使用UNG酶時(shí)，反應(yīng)參數(shù)仍按照表中條件。3.6.2.4儀器檢測(cè)通道的選擇設(shè)置PCR反應(yīng)管熒光信號(hào)收集條件，應(yīng)與探針標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法可參照儀器使用說(shuō)明書。4結(jié)果判斷4.1普通PCR結(jié)果判斷參比DNA分子量標(biāo)記物，根據(jù)凝膠成像儀所觀察到的樣品DNA的PCR產(chǎn)物特異性泳帶的出現(xiàn)，確定利用本方法提取到適用于PCR的DNA。4.2熒光PCR結(jié)果判斷根據(jù)常規(guī)實(shí)時(shí)熒光PCR要求，設(shè)定基線和閾值陽(yáng)性參比相應(yīng)內(nèi)源基因擴(kuò)增結(jié)果均Ct《40;試劑空白和陰性參比相應(yīng)內(nèi)源基因擴(kuò)增結(jié)果均Ct>40或45(根據(jù)PCR時(shí)所設(shè)定的循環(huán)數(shù)而定)。樣品DNA相應(yīng)內(nèi)源基因擴(kuò)增結(jié)果Ct《40或45(根據(jù)PCR時(shí)所設(shè)定的循環(huán)數(shù)而定)，確定利用本方法提取到適用于PCR的DNA。權(quán)利要求1.一種提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步驟進(jìn)行(1)食用油脂中極性成分的萃取采用水作為萃取劑分多次對(duì)食用油脂進(jìn)行萃取，并用離心的方法進(jìn)行油液分離；(2)萃取液的濃縮全部轉(zhuǎn)移萃取液于電熱恒溫干燥設(shè)備或其它干燥設(shè)備內(nèi)，充分干燥；(3)食用油脂中DNA的粗提；(4)粗提DNA的純化。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于在步驟(1)的萃取過(guò)程中，采用離心方法去除油水界面物質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于在步驟(1)中，共需萃取初榨大豆油400mL-600mL、或初搾菜籽油約700raL-1000mL、或初搾玉米油約700mL-1000mL、或者花生油、芝麻油400mL-600mL、或者棕櫚油600mL-800mL。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于當(dāng)待測(cè)油脂為初搾大豆油時(shí)，步驟(3)中DNA的粗提按照以下方法進(jìn)行取預(yù)熱至約80-90°CCTAB提取液8-10mL，分多次小心洗下表面皿上千燥的萃取物，吸取洗下的萃取物轉(zhuǎn)移至15mL離心管。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，充分震蕩約30s，7500Xg室溫離心10rnin;分別小心吸取上清至另一15mL離心管，再次加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加入0.2至0.3倍體積的預(yù)冷異丙醇，充分上下倒置混勻，置(TC約20-40min后10000-12500Xg，4'C離心6min，沉淀置0。C待用；上清于27000-30OOOXg，4。C離心10min，棄取上清，沉淀加入500yL70%-80%預(yù)冷的乙醇，充分上下倒置混勻，27000-30000Xg，4。C離心5min，棄去上清，置核酸真空干燥儀干燥；上述10000-12500Xg離心所獲沉淀加入約1200"L70%-80%預(yù)冷的乙醇，充分上下倒置混勻，27000-30OOOXg，4。C離心5min，棄去上清，置核酸真空干燥儀干燥。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于當(dāng)待測(cè)油脂為初搾菜籽油、玉米油、花生油、芝麻油、棕櫚油、棉籽油或各種精煉油等時(shí)，歩驟(3)中DNA的粗提按照以下方法進(jìn)行取預(yù)熱至約80-9(TCCTAB提取液8-10mL，充分溶解干燥的萃取物于15mL離心管，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，充分震蕩約30s，7500Xg室溫離心10min;上清按1/10體積加入3MNaAc，混勻，加入LA溶液，混勻，加入等體積異丙醇，混勻，-20°<:靜置約40min-60min后，27000-30OOOXg，4。C離心10min，棄取上清，沉淀加入500UL70%-80%預(yù)冷的乙醇，充分上下倒置混勻，27000-30000Xg，4。C離心5rain，棄去上清，置核酸真空干燥儀干燥。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特正在于所述步驟(4)粗提DNA的純化利用特制的長(zhǎng)片段核酸富集純化裝置來(lái)進(jìn)行，該長(zhǎng)片段核酸富集純化裝置包括一個(gè)筒狀主體(1)，在兩端開(kāi)口端口包覆半透膜(2)，在筒狀主體上設(shè)有取液孔(3)和加樣槽(4)，取樣孔(3)帶有膠塞(5)，在加樣槽下方的部分筒狀主體內(nèi)充填有瓊脂糖凝膠(6)，而取液孔下方的部分筒狀主體保持為空腔(7)，用作注入電泳緩沖液；所述的裝置具體的操作方法如下(a)電泳槽加入電泳緩沖液；(b)取液孔下方的部分筒狀主體的空腔加滿電泳緩沖液，并蓋緊取液孔膠塞；(C)將核酸富集純化裝置浸入電泳槽內(nèi)電泳緩沖液中；(d)待純化核酸與上樣緩沖液(含指示染料)混勻后，加入到加樣槽，并通電；(e)待指示染料條帶全部進(jìn)入取液孔下方緩沖液中，棄去取液孔下方的緩沖液；(f)重新注滿電泳緩沖液于取液孔下方的空腔，蓋緊取液孔膠塞，重新放入電泳槽中，繼續(xù)通電電泳，收集取液孔下方空腔的緩沖液進(jìn)行酚氯仿抽提。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步驟進(jìn)行(1)食用油脂中極性成分的萃取，采用水作為萃取劑，用離心的方法進(jìn)行油液分離；(2)萃取液的濃縮，全部轉(zhuǎn)移萃取液于電熱恒溫干燥設(shè)備或其它干燥設(shè)備內(nèi)，充分干燥；(3)食用油脂中DNA的粗提；(4)粗提DNA的純化。本方法適用于初榨大豆油、菜籽油、玉米油，精煉大豆油、菜籽油、玉米油、多種調(diào)和油，以及花生油、芝麻油、橄欖油、棉籽油、棕櫚油等食用油脂的適用于PCR或相應(yīng)下游實(shí)驗(yàn)的DNA的提取。文檔編號(hào)C12N15/10GK101348784SQ20081002911公開(kāi)日2009年1月21日申請(qǐng)日期2008年6月30日優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日發(fā)明者萬(wàn)宇平,何方洋,李丹寧,鐘國(guó)強(qiáng),鐘玉清,高東微申請(qǐng)人:廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心;北京望爾生物技術(shù)有限公司