采用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法

文檔序號：563714閱讀：434來源：國知局

專利名稱：采用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用干細胞組織工程技術構建全層替代皮膚的方法，可以用于替代活體動物(或人體)皮膚用于毒理學試驗領域。
背景技術：
皮膚是人體最大的器官，是外源化學因素(化學品、藥品、化妝品等)或物理機械因素(紫外線、微波等)毒性作用的主要器官。利用動物或人體皮膚進行皮膚毒性測試是化妝品、藥品、食品添加劑及原料、農藥、生物制品、化學品健康安全評價的常規檢測項目。傳統的皮膚安全性評價實驗不僅要求一定數量和高質量的實驗動物，而且試驗周期長，成本高，某些反應會給動物造成極大的痛苦。世界各國非常重視實驗動物的福利問題，如上世紀歐洲各國、美國頒布的動物福利法，中國的《實驗動物管理條例》等。隨著國際動物保護和動物福利運動的興起，40多年前國外最先提出了以〃減少(reduce) 〃、〃替代(r印lace) 〃和〃優化(refine) 〃為核心內容的"3R原則"，并在此基礎上大力開展動物實驗替代方法的研究。特別是近20年，不再以動物模式為基礎的毒理學系統已被科學家采用，并被許多國家的政府、歐洲和國際法規所接受。2002年11月7 H歐洲議會與歐盟理事會在布魯塞爾達成協議，決定"從2009 年3月11 R起在歐盟范圍內禁止使用動物進行化妝品毒性和過敏實驗"，也"不允許成員國從外國進口和銷售進行動物實驗的化妝品"。歐盟新化學品法規REACH (化學品的注冊、評估、許可和限制)也提出鼓勵動物試驗替代方法的開發和應用。采用體外構建的組織工程皮膚進行毒性評價是動物試驗替代技術的關鍵領域之一。
組織工程化皮膚分為組織型表皮替代物、真皮替代物和器官型全層皮膚替代物幾類。1975年，Rheinwald和Green采用3T3成纖維細胞作滋養層，體外培養人自體表
皮細胞獲得成功(Rheinwald JG， Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinozytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 1975, 6:331-344)。美國Advanced Tissue Science公司生產的商品名為Dermagraft的人工真皮以高分子材料PGA、 PGL網為基礎，植入新生兒成纖維細胞后培養成人工真皮替代物，結合自體表皮膜片用于臨床移植(HarisbroughJF， Dore C， Hansbrough WB. Clinical trails of a living dermal tissue replacement placed beneath mesh， split-thickness skin grafts on excised burn wounds. J Burn Care Rehabil， 1992， 13:519-529)。美國Organogenesis公司生產的Testskin人工皮膚模型，其表皮層由人角質細胞分化形成，真皮層由人成纖維細胞種植于I型牛膠原支架構成 (Rodriguez H， 0'Connell C, Barker PE, et al. Measurement of DNA biomarkers for the safety of tissue-engineered medical products, using artificial skin as a model. Tissue Eng，2004， 10 (9—10):1332-1345)。 2001年2 月6閂伍津津等人申請了有關專利(中國專利申請號01107099. 4)，該發明包括膠原凝膠的制備和細胞的三維培養等。2002年9月2日金巖等人申請了有關專利(中國專利申請號02139398. 2)，該發明包括膠原凝膠的制備和全層皮膚的培養等內容。但這幾種皮膚替代物主要用于燒傷和潰瘍、創傷等皮膚缺損病人的臨床治療，還不能替代活體動物皮膚成熟用于皮膚毒性檢驗。作為組織工程皮膚也存在以下缺點人工表皮由于不含真皮層，還不是真正意義上的人工皮膚；現有的含雙層結構的人工皮膚組織構造上還有待改進；培養周期長，皮膚功能在體外維持時間短，不適用于慢性毒性試驗。因此，用于毒性檢驗的皮膚不僅要求形態和組織結構與人體皮膚接近，而且要求生理功能和活性與活體皮膚相似，構建的皮膚重復性好，批間差異小，便于毒性效應的統計學分析。

發明內容
本發明所要解決的技術問題，就是提供一種利用誘導分化的表皮干細胞或原代分離的表皮干細胞，采用筏式培養技術，制備毒性檢驗用全層皮膚的方法，該方法培養周期短，皮膚含表皮與真皮雙層結構，組織和結構與正常皮膚相似，功能和活性在體外維持時間較長，能滿足毒性檢驗領域的需要。
實現本發明依次包括以下幾個步驟 1、高分子真皮支架的制備與修飾
1) PHBV支架制備:
(a) 將3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物(poly[3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvalericacid],PHBV)溶于氯仿中制成濃度為120-130g/L的溶液，然后每升溶液加入930-950g的氯化鈉(NaCI)為致孔劑，充分混勻，得到濃漿液；
(b) 將濃漿液倒入孔徑為0.8 1.0cm圓形金屬模具中，待氯仿溶劑揮發約70-80% 后，從模具中取出成形支架，再置于通風櫥內室溫48-54小時晾干，25'C-35i:溫度下， 1000 1300Pa真空范圍內千燥2小時 3小時除去殘余溶劑；
(c) 將成形支架浸入去離子水中，每隔6-8小時換水1次，48-52小時內換水6-8 次直至將致孔劑濾除干凈，室溫晾干，25'C-35"C溫度下，1000 1300Pa真空范圍內干燥24-48小時制成PHBV多孔三維支架；
(d) 將PHBV多孔三維支架以無水乙醇浸泡l-2h，用波長254nm、 36W的紫外線正反面各照射1.5-2h，無菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，無菌條件下自然晾干；
2) 制備膠原-甲殼糖-硫酸軟骨素-透明質酸修飾液(復合膠原修飾液) 按質量比例為14 16: 2 4: 1: 1制備原料I型膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟
骨素、透明質酸A;在36W紫外燈照射下，用0.1%乙酸攪拌溶解I型膠原然后加入甲殼糖，待甲殼素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入預先溶解好的6-透明質酸和硫酸軟骨素A溶液，繼續攪拌溶解3小時；使膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、
透明質酸A最終濃度分別為7-8mg/ml、 l-2mg/ml、 0.5mg/ml和0.5mg/ml;然后在冰浴條件下加入0.5ml 10XDMEM培養液，用lmol/L的NaOH快速調pH至7.2-7.3; 3)修飾PHBV支架
將2)歩制備的復合膠原修飾液均勻涂布于1)步制備的PHBV多孔三維支架表面，室溫條件下靜置20-30min，以此面為真皮面，在PHBV多孔三維支架的另一面, 用濃度為0. 4。/。的人源IV型膠原蛋白浸泡20-30min，此面為表皮面； 2、制備表皮干細胞
采用兩種途徑獲得表皮干細胞(ESC)，即從人胚胎干細胞定向誘導分化制備ESC 和從人皮膚原代分離培養制備ESC。
1) 從胚胎干細胞定向誘導分化制備表皮干細胞
先制備羊膜片無菌條件下，取足月妊娠剖腹產的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素的PBS沖洗干凈血污，再轉移到DMEM液中；然后在無菌環境下，按6孔培養板或12孔培養板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，再將羊膜上皮面向上鋪布于6孔板或12孔板的孔底；最后加入無白血病抑制因子(LIF)的胚胎干細胞培養液，收集羊膜分泌液備用。
從商業途徑購買人胚胎干細胞(hES)，傳代培養48小時后，以終濃度為0.125% 的胰蛋白酶+O.OP/。EDTA消化液消化后按5 X 104個細胞/cm2密度接種于鋪布有羊膜的6孔或12孔培養板中，用無人LIF的ES細胞培養液培養；每隔l-2天半量換液；經過4天誘導分化培養后，收集粘附在羊膜上皮表面的表皮干細胞(ESC);
2) 從人皮膚原代分離培養制備表皮干細胞
將外科手術環切下的幼兒新鮮包皮用含100 U/mL青霉素、100 ug/mL鏈霉素的 0. 1mol/L的PBS緩沖液徹底清洗2次；然后在無菌條件下去除皮下脂肪和結締組織，將包皮剪切成約2. OmmX3. Omm的皮片；用質量濃度0. 25M的裂解酶(Dispases)分離表
皮和真皮，然后用生理鹽水或D-Hanks液清洗3-5次；
表皮部分用質量濃度0. 25%胰酶+0. 02%EDTA (按1 : 1比例混合)，4'C消化2±0. 5 小時，消化成單細胞懸液，然后接種于鋪布有質量濃度為0. 4y。的IV型膠原包被的培養皿中，置5°/。0)2、 37T:培養箱內快速黏附10-15min后，棄去未粘附細胞。將粘附細胞吹打脫離培養壁，按lX10"個/cm2置于第2步1)制備的鋪布有人羊膜的培養皿上繼續培養，培養基為無LIF的ES完全培養基；或將細胞接種于用5ug/ml絲裂霉素C處理的小鼠3T3成纖維細胞滋養層上繼續培養，所用培養基為全層皮膚專用培養基。
采用上述兩種方法制備的表皮干細胞以鼠抗人角蛋白19 (CK19)單克隆抗體和鼠抗人e 1整合素單克隆抗體為一抗，采用免疫細胞化學方法鑒定細胞呈CK19陽性和
ei整合素陽性。
3、制備原代人成纖維細胞取外科環切手術獲取的包皮組織，以第2歩2)所述方法分離皮膚真皮部分，以0. 125%胰酶消化獲取原代培養人皮膚成纖維細胞，然后放入含l(W新生牛血清高糖DMEM (H-DMEM)培養基培養，每24-36小時半量換液。培養3 4天，待細胞融合約80%時，縣酶消化收集細胞，制備以KSM培養基重懸的成纖維細胞用于全層皮膚制備。
4、全層皮膚專用培養基制備
取第2歩1)收集的人羊膜分泌液，經0.22ym微孔小組膜過濾后，與角質細胞無血清培養基(KSM)與按體積比1. 5~2:8~8.5混合，再添加關鍵促生長因子5X 10—1() M 霍亂毒素、10rig/mL人重組表皮生長因子(EGF)、 5昭/mL胰島素、0.5嗎/mL氫化可的松、30 jug/mL慶大霉素、15ng/mL兩性霉素、30嗎/mL牛垂體提取物、5 y g/ml 轉鐵蛋白、1X10 "o M甲狀腺素T3、 24.3 ug/mL腺嘌呤等活性成分，培養基中鈣終濃度為0.10 mM;
5、全層皮膚制備
將第1步所得的PHBV多孔三維支架置于6孔或12孔培養板上，經復合膠原修飾的真皮面向上，以最小容量100-200 ii 1接種以人KSM培養基懸浮的原代培養人皮膚成纖維細胞，細胞密度為lX105cell/cm2—2X105Cell/Cm2，待4-8小時細胞粘附后，加1.5-2ml足量角質細胞無血清培養基浸沒培養，每36-48小時半量換液，培養 5-7天，完成全層皮膚真皮部分構建；
將P朋V支架反轉，在表皮面接種第2步)或2)制備的人表皮干細胞，接種細胞密度為lX105Cell/Cm2-2X105cell/Cm2，用第4歩制備的全層皮膚專用培養基代替含 10%新生牛血清的H-DMEM培養基，浸沒培養72-96小時后，采用氣-液界面培養，每 48-60小時半量換液，10-14天后完成全層皮膚制備；
6、檢測
同一批以12孔培養板制備的組織工程皮膚中，取其中一塊皮膚固定于以PBS配制的4%多聚甲醛溶液中，常規乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5um—6iim，蘇木素-伊紅(H.E)染色；顯微鏡下觀察人工皮膚的組織結構去除皮膚結構不完整、表皮分層不明顯或缺少分層、角質細胞含量較少，真皮層成纖維細胞含量少、膠原排列紊亂者，即得表皮層含基底層、棘層、顆粒層和角化層等分化結構；真皮層含大量成纖維細胞，與WIBV支架融合性好，膠原纖維有序列排列；表皮真皮分界明顯的組織工程皮膚產品，可用于皮膚毒性檢測試驗。
所述的用質量濃度0. 25。/。裂解酶(Dispases)分離表皮和真皮，是將表皮和真皮在 37'C的溫度下經質量濃度0. 25°/。裂解酶消化3±0. 5小時；或在4。C的溫度下經質量濃度0. 25%裂解酶消化12-18小時。
所述的胚胎干細胞培養液為一種常規方法，其采用80。/。DMEM基礎培養液，然后加入20%胎牛血清，lmML-谷氨酰胺、0.1 mM 3-疏基乙醇，1000U/ml人白血
病抑制因子(LIF)， 100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素。
所述的人胚胎干細胞(ES細胞)為一種來源于的人胚胎內細胞團或原始生殖嵴的全能干細胞，可從商業途徑購買。
所述的小鼠3T3成纖維細胞為一種來源于SWISS小鼠的成纖維細胞株，可從商業途徑購買。
所述的膠原為商品，主要成份為來源于牛肌腱或豬皮或鼠尾的I型膠原粉木。所述的角質細胞無血清培養基KSM (KeratinocyteSer咖-Free Medium )為商業化購自國外公司，如美國BioWhittaker公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或 GIBCO公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium)。
有益效果本發明用表皮千細胞培養組織工程全層皮膚，細胞分裂增殖能力強，皮膚的形態和組織結構完整、功能和活性體外維持時間較長，能滿足亞毒性檢驗領域的需要；人工合成的支架材料標準化程度高、批間差異小；皮膚構建過程中全程采用無血清培養基，明確了組織構建的影響因素，為以后用于毒性試驗減少干擾奠定了基礎。由此制備的組織工程全層皮膚重復性好、穩定性強。通過本發明制備的全層皮膚在解剖和組織結構上更接近于天然皮膚，其應用于毒性檢驗的方式和檢測指標更符合皮膚毒性作用的實際情況，可以代替整體動物，直接應用于化學品、化妝品、藥品、農藥等健康相關產品的皮膚毒性試驗。

圖1為筏式培養毒性檢驗用組織工程全層皮膚的模式圖2 PHBV與表皮干細胞構建組織工程替代皮膚的組織結構圖。HE染色，生物顯微鏡觀察，放大倍數200倍。
具體實施例方式
實施例1 依次包括以下幾個步驟 1、高分子真皮支架的制備與修飾
1) PHBV支架的制備
(a) 將適量的PHBV粉末溶于氯仿中制成濃度為120-130g/L的溶液，然后每升溶液加入940g的氯化鈉(NaCI)為致孔劑，充分混勻，得到濃漿液；
(b) 將濃漿液倒入孔徑為0.8 1.0cm圓形金屬模具中，待約80%氯仿溶劑揮發后，從模具中取出成形支架，再置于通風櫥內室溫48小時晾干，室溫下真空干燥除去殘余溶劑；
(c) 將成形支架浸入去離子水中，每隔6小時換水1次，48小時內換水8次直至將致孔劑濾除干凈，室溫晾干后真空干燥24小時制成PHBV多孔三維支架，制成的支架的孔隙率>90%，孔徑大小為80-200um;
(d) 將支架以無水乙醇浸泡l-2h，用波長254nm、 36W的紫外線正反面各照射 1.5-2h，無菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，無菌條件下自然晾千；
2) 制備復合膠原修飾液(膠原為商品，主要成份為來源于牛肌腱、豬皮或鼠尾的I型膠原粉末)
在35W紫外燈照射下，用0.1%乙酸攪拌溶解鼠尾膠原然后加入脫乙酰甲殼糖，待脫乙酰甲殼素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入預先溶解好的透明質酸A 和6-硫酸軟骨素溶液，繼續攪拌溶解3小時；鼠尾膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、透明質酸A凈重比例為15: 3: 1: 1，四種材料的最終濃度分別為7.5mg/ml、 1.5mg/ml、 0.5mg/ml和0.5mg/ml;然后在冰浴條件下加入0.5ml 10XDMEM培養液，用lmol/L的NaOH溶液快速調pH至7.2;
3) 修飾PHBV支架
將2)步制備的復合膠原修飾液均勻涂布于1)歩制備的支架表面，室溫靜置
20-30min，以此面為真皮面，在支架另一面，用濃度為0. 4。/。的人源IV型膠原蛋白浸泡 20-30min，此面為表皮面。
2、從人胚胎干細胞定向誘導分化制備表皮干細胞
1) 制備羊膜片無菌條件下，取足月妊娠剖腹產的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素的PBS沖洗干凈血污，再轉移到DMEM液中；然后在無菌環境下，按6孔培養板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，再將羊膜上皮面向上鋪布于6孔板的孔底；最后加入無白血病抑制因子(LIF)的胚胎干細胞培養液，收集羊膜分泌液備用，鋪布好的羊膜片3天內可接種細胞；
其中的人胚胎干細胞培養液為一種常規方法，采用80^/。DMEM基礎培養液，然后加入20%胎牛血清，lmML-谷氨酰胺、0.1 mM 3-疏基乙醇，1000U/ml人白血病抑制因子(LIF)， 100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素。人胚胎干細胞(ES細胞)為一種來源于胚胎內細胞團或原始生殖嵴的全能干細胞，從商業途徑購買。
2) 胚胎干細胞定向誘導分化制備表皮干細胞取傳代培養48小時的ES細胞，以終濃度為0.125。/。胰蛋白酶+0.0in/。EDTA消化液消化后按5 X 10^田胞/ml密度接種于己鋪布好羊膜的6孔培養板中，用無LIF的ES細胞培養液培養；每隔1-2天半量換液；經過4天誘導分化培養后，收集粘附在羊膜上皮表面表皮干細胞。
將獲得的表皮干細胞以鼠抗人角蛋白19 (cKi9)單克隆抗體和鼠抗人e 1整合素
單克隆抗體為一抗，采用免疫細胞化學方法鑒定細胞呈CK19陽性和P 1整合素陽性。
3、制備原代成纖維細胞將手術環切下的幼兒新鮮包皮用含青霉素、鏈霉素的 0. 1mol/L的PBS緩沖液徹底清洗；然后在無菌條件下去除皮下組織，將包皮剪切成約1. 0mmX2. Omm的皮片；用質量濃度0. 25%裂解酶(Dispases) 37。C下消化3小時分離表皮和真皮。真皮部分以O. 125%胰酶消化獲取原代培養人皮膚成纖維細胞，放入
含10%新生牛血清高糖DMEM (H-DMEM)培養基培養，每24-36小時半量換液。培養3~4 天，待細胞融合約80%時，縣酶消化收集細胞，制備以KSM培養基重懸的成纖維細胞用于全層皮膚制備。
4、組織工程全層皮膚專用培養基制備
取第2歩1)收集的人羊膜分泌液，經0.22um微孔小組膜過濾后，與角質細胞無血清培養基(KSM)與按體積比1. 5~2:8~8.5混合，再添加關鍵促生長因子5 X l(r1Q M 霍亂毒素、10ng/mL人重組表皮生長因子(EGF)、 5嗎/mL胰島素、0.5嗎/mL氫化可的松、30嗎/mL慶大霉素、15 ng/mL兩性霉素、30叱/mL牛垂體提取物、5 y g/ml 轉鐵蛋白、1X10 —1Q M甲狀腺素T3、 24.3 ug/raL腺嘌呤等活性成分。培養基中鈣終濃度為0.10 mM。
角質細胞無血清培養基(KSM)為商業化購自GIBCO公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium);
5、組織工程全層皮膚制備
將第1歩所得的PHBV多孔三維支架置于12孔培養板上，經復合膠原修飾的真皮面向上，以最小容量100-200n 1接種第3步以DMEM培養基懸浮的原代培養人皮膚成纖維細胞，細胞密度為lX105cell/Crn2，待4小時細胞粘附后，加2ml足量角質細胞無血清培養基浸沒培養，每36-48小時半量換液，培養5-7天，完成組織工程皮膚真皮部分構建；
將PHBV支架反轉，在表皮面接種第2步制備的來源于人胚胎干細胞的人表皮千細胞，接種細胞密度為2X105cell/cm2，用第4步制備的組織工程全層皮膚專用培養基浸沒培養96小時，采用氣-液界面培養，每48-60小時半量換液，10-14天后完成組織工程全層皮膚產品制備；
6、檢測
同一批以12孔培養板制備的組織工程皮膚中，取其中一塊皮膚固定于以PBS配制的4%多聚甲醛溶液中，常規乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5um—6um，蘇木素-伊紅(H.E)染色；顯微鏡下觀察人工皮膚的組織結構去除皮膚結構不完整、表皮分層不明顯或缺少分層、角質細胞含量較少，真皮層成纖維細胞含量少、膠原排列紊亂者，即得表皮層含基底層、棘層、顆粒層和角化層等分化結構；真皮層含大量成纖維細胞，與PHBV支架融合性好，膠原纖維有序列排列；表皮真皮分界明顯的組織工程皮膚產品，可用于皮膚毒性檢測試驗。
所得的人工皮膚產品用于皮膚刺激性檢測將化妝品、化學品等固體或液體受試物直接放置于人工皮膚表面，液體用量為10yl，固體用量為(10士2)mg并涂布均勻，作用(15±1)分鐘后，以無菌PBS沖洗去除受試物再孵育(42±1)小時。從12孔細胞培養板中取下組織工程替代皮膚，部分組織固定于多聚甲醛，冊染色觀察組織病理學形態結構；部分組織采用MTT法分析細胞活性，或用酶聯免疫吸附法(ELISA) 檢測比-2等毒性效應指標。
所述的MTT法為一種檢驗細胞活性的常規方法，所述的ELISA檢測法為一種檢測細胞因子的常規方法。實施例2
1、高分子真皮支架的制備與修飾
1) PHBV支架的制備:
(a) 將適量的PHBV粉末溶于氯仿中制成濃度為130g/L的溶液，然后每升溶液加入930g的氯化鈉(NaCI)為致孔劑，充分混勻，得到濃漿液；
(b) 將濃漿液倒入直徑為1.0cm圓形金屬模具中0.15-0.2ml，待溶劑揮發后，從模具中取出成形支架，置于通風櫥內室溫54小時晾干，真空干燥除去殘余溶劑；
(c) 將成形支架浸入去離子水中，每隔7小時換水1次，49小時內換水7次直
至將致孔劑濾除干凈，室溫晾干后真空干燥24小時制成PHBV多孔三維支架；
(d)將PHBV多孔三維支架以無水乙醇浸泡2h，用波長254 nm、 36W的紫外線正反面各照射2h，無菌PBS漂洗4次，每次20min，無菌條件下自然晾干；
2) 制備復合膠原修飾液
在紫外燈照射下，用0.1%乙酸攪拌溶解鼠尾膠原然后加入脫乙酰甲殼糖，待脫乙酰甲殼素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入預先溶解好的透明質酸A和6 硫酸軟骨素溶液，繼續攪拌溶解3小時；鼠尾膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、透明質酸A凈重比例為14: 4: 1: 1，最終濃度分別為7mg/ml、 2mg/ml、 0.5mg/ml 和0.5mg/ml;然后在冰浴條件下加入0.5ml 10XDMEM培養液混勻用lmol/L的NaOH 快速調pH至7.3;
3) 修飾PHBV支架
將2)歩制備的復合膠原修飾液均勻涂布于1)歩制備的支架表面，室溫靜置 30min，以此面為真皮面，在支架另一面，用濃度為0.4M的人源IV型膠原蛋白浸泡 30min，此面為表皮面。
2、人皮膚原代分離制備表皮干細胞
1) 制備羊膜片無菌條件下，取足月妊娠剖腹產的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜，用含雙抗的PBS沖洗干凈血污，再轉移到DMEM液中；然后在無菌環境下，按12 孔培養板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，再將羊膜上皮面向上鋪布于 12孔板的孔底；最后加入角質細胞無血清培養基(SFM)，收集羊膜分泌液備用，鋪布好的羊膜片3天內可接種細胞；
2) 人皮膚原代分離制備表皮干細胞將手術環切下的幼兒新鮮包皮用含青霉素、鏈霉素的0.1mol/L的PBS緩沖液徹底清洗；然后在無菌條件下去除皮下組織，將包皮剪切成約2. 0mraX2. 5咖的皮片；用質量濃度0. 25%裂解酶(Dispases) 4。C消化過夜 (12小時)分離表皮和真皮，生理鹽水清洗3次。表皮部分用質量濃度0.25%胰酶 +0.01%EDTA (按l:l比例混合)，4'C消化2小時，消化成單細胞懸液，然后接種于鋪布有質量濃度為0.4y。的IV型膠原包被的培養皿中，置5% C02 、 37'C培養箱內快速黏附15min后，棄去未粘附細胞，將粘附細胞吹打脫離培養壁，按lXl(^個/cr/置于第2歩1)制備的鋪布有人羊膜的培養皿上繼續培養，所用培養基為角質細胞無血清培養基。將獲得的表皮干細胞以鼠抗人角蛋白19 (CK19)單克隆抗體和鼠抗人ei 整合素單克隆抗體為一抗，采用免疫細胞化學方法鑒定細胞呈CK19陽性和P 1整合素陽性。
角質細胞無血清培養基(KSM)為商業化購自GIBCO公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium);
3、制備原代人成纖維細胞取第2步2)分離的皮膚真皮部分以0.125%胰酶消化經獲取原代培養人皮膚成纖維細胞，然后放入含10。/。新生牛血清高糖DMEM(H-DMEM) 培養基培養，每24-36小時半量換液；培養3 4天，待細胞融合約80%時，縣酶消化收集細胞，制備以KSM培養基重懸的成纖維細胞用于全層皮膚制備。
4、組織工程全層皮膚專用培養基制備
取第2步1)收集的人羊膜分泌液，經0.22nm微孔小組膜過濾后，與角質細胞無血清培養基(KSM)與按體積比1. 5~2:8 8.5混合，再添加關鍵促生長因子5X 10—1QM 霍亂毒素、10ng/mL人重組表皮生長因子(EGF)、 5pg/mL胰島素、0.5嗎/mL氫化可的松、30嗎/mL慶大霉素、15 ng/mL兩性霉素、30嗎/mL牛垂體提取物、5 w g/ml 轉鐵蛋白、1X10 —1Q M甲狀腺素T3、 24.3 ug/mL腺嘌呤等活性成分。培養基中鈣終濃度為0.10 mM。
5、組織工程全層皮膚制備
將第1歩所得的PHBV多孔三維支架置于12孔培養板上，經復合膠原修飾的真
皮面向上，以最小容量100-200 u 1接種第3培養基懸浮的原代培養人皮膚成纖維細胞，細胞密度為lX105cell/cm2，待4小時細胞粘附后，加2ml足量角質細胞無血清培養基浸沒培養，每48小時半量換液，培養5天，完成組織工程皮膚真皮部分構建;
將PHBV支架反轉，在表皮面接種第2步制備的來源于人皮膚組織和原代人表皮干細胞，接種細胞密度為2X10^ell/cm2，用第4步制備的組織工程全層皮膚專用培養基浸沒培養80小時，然后采用氣-液界面培養，每48小時半量換液，12天后完成人組織工程皮膚產品制備；
6、檢測
同實施例1。
實施例3
1、高分子真皮支架的制備與修飾
1) PHBV支架的制備
(a) 將適量的PHBV粉末溶于氯仿中制成濃度為130g/L的溶液，然后每升溶液加入940g的氯化鈉(NaCI)為致孔劑，充分混勻，得到濃漿液；
(b) 將濃漿液倒入直徑為1.0^11圓形金屬模具中0.15-0.21111,待溶劑揮發后，從模具中取出成形支架，置于通風櫥內室溫54小時晾干，真空干燥除去殘余溶劑；
(c) 將成形支架浸入去離子水中，每隔8小時換水1次，56小時內換水7次直至將致孔劑濾除干凈，室溫晾干后真空干燥24小時制成PHBV多孔三維支架；
(d) 將PHBV多孔三維支架以無水乙醇浸泡2h，用波長254 nm、 36W的紫外線正反面各照射2h，無菌PBS漂洗4次，每次20min，無菌條件下自然晾干；
2) 制備復合膠原修飾液
在紫外燈照射下，用0.1%乙酸攪拌溶解鼠尾膠原然后加入脫乙酰甲殼糖，待脫乙酰甲殼素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入預先溶解好的透明質酸A和6
硫酸軟骨素溶液，繼續攪拌溶解3小時；鼠尾膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、透明質酸A凈重比例為16: 2: 1: 1，最終濃度分別為8mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml 和0.5mg/ml;然后在冰浴條件下加入0.5ml 10XDMEM培養液，用lmoil/L的NaOH 快速調pH至7.3;
3)修飾PHBV支架
將2)步制備的復合膠原修飾液均勻涂布于1)步制備的支架表面，室溫靜置 30min，以此面為真皮面，在支架另一面，用濃度為0.4y。的人源IV型膠原蛋白浸泡 30min,此面為表皮面。
2、人皮膚原代分離制備表皮干細胞
1) 制備羊膜片無菌條件下，取足月妊娠剖腹產的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜，用含雙抗的PBS沖洗干凈血污，再轉移到DMEM液中；然后在無菌環境下，按12 孔培養板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，再將羊膜上皮面向上鋪布于 12孔板的孔底；最后加入角質細胞無血清培養基(SFM)，收集羊膜分泌液備用，鋪布好的羊膜片3天內可接種細胞；
2) 人皮膚原代分離制備表皮干細胞將手術環切下的幼兒新鮮包皮用含青霉素、
鏈霉素的O. 1mol/L的PBS緩沖液徹底清洗；然后在無菌條件下去除皮下組織，將包皮剪切成約1. 5mmX2. 5mm的皮片；用質量濃度0. 25%裂解酶(Dispases) 4。C消化過夜 (12小時)分離表皮和真皮，生理鹽水清洗3次。表皮部分用質量濃度0.25%胰酶 +0.01%EDTA (按l:l比例混合)，4'C消化2小時，消化成單細胞懸液，然后接種于包被IV膠原的培養皿中，置5%0)2 、 37'C培養箱內快速黏附15min后，棄去未粘附細胞，將粘附細胞吹打脫離培養壁，接種于用5iig/inl絲裂霉素C處理的小鼠3T3成細胞滋養層上。所用培養基為角質細胞無血清培養基。將獲得的表皮干細胞以鼠抗人角蛋白19(CK19)單克隆抗體和鼠抗人fU整合素單克隆抗體為一抗，采用免疫細胞
化學方法鑒定細胞呈CK19陽性和0 1整合素陽性。
角質細胞無血清培養基(KSM)為商業化購自美國BioWhittaker公司的 KBM(Keratinocyte Basal Medium)。
3、制備原代人成纖維細胞取第2步2)分離的皮膚真皮部分以0. 125%胰酶消化經獲取原代培養人皮膚成纖維細胞，然后放入含10%新生牛血清高糖DMEM(H-DMEM) 培養基培養，每24-36小時半量換液；培養3 4天，待細胞融合約80%時，縣酶消化收集細胞，制備以KSM培養基重懸的成纖維細胞用于全層皮膚制備。
4、組織工程全層皮膚專用培養基制備
取第2歩1)收集的人羊膜分泌液，經0.22um微孔小組膜過濾后，與角質細胞無血清培養基(KSM)與按體積比1. 5~2:8~8.5混合，再添加關鍵促生長因子5X 10_1Q M 霍亂毒素、10ng/mL人重組表皮生長因子(EGF)、 5嗎/mL胰島素、0.5嗎/mL氫化可的松、30嗎/mL慶大霉素、15ng/mL兩性霉素、30嗎/mL牛垂體提取物、5 y g/ml轉鐵蛋白、1X10^M甲狀腺素T3、 24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分。培養基中鈣終濃度為0.10 mM。
5、組織工程全層皮膚制備
將第1歩所得的PHBV多孔三維支架置于12孔培養板上，經復合膠原修飾的真皮面向上，以最小容量100-200y 1接種第3培養基懸浮的原代培養人皮膚成纖維細胞，細胞密度為lX105cell/Cm2，待4小時細胞粘附后，加2ml角質細胞無血清培養基浸沒培養，每48小時半量換液，培養5天，完成組織工程皮膚真皮部分構建；
將RiBV支架反轉，在表皮面接種第2步制備的來源于人皮膚組織和原代人表皮干細胞，接種細胞密度為2X10Scell/cffl2，用第4步制備的組織工程全層皮膚專用培養基浸沒培養96小時，采用氣-液界面培養，每48小時半量換液，12天后完成人組織工程皮膚產品制備；6、檢測同實施例1。
權利要求
1、一種采用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法，依次包括以下的步驟I、高分子真皮支架的制備與修飾1)PHBV支架制備(a)將3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物PHBV溶于氯仿中制成濃度為120-130g/L的溶液，然后每升溶液加入930-950g的氯化鈉為致孔劑，充分混勻，得到濃漿液；(b)將濃漿液倒入孔徑為0.8～1.0cm圓形金屬模具中，待氯仿溶劑揮發約70-80％后，從模具中取出成形支架，再置于通風櫥內室溫48-54小時晾干，25℃-35℃溫度下，1000～1300Pa真空范圍內干燥2小時～3小時除去殘余溶劑；(c)將成形支架浸入去離子水中，每隔6-8小時換水1次，48-52小時內換水6-8次直至將致孔劑濾除干凈，室溫晾干，25℃-35℃溫度下，1000～1300Pa真空范圍內干燥24-48小時制成PHBV多孔三維支架；(d)將PHBV多孔三維支架以無水乙醇浸泡1-2h，用波長254nm、36W的紫外線正反面各照射1.5-2h，無菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，無菌條件下自然晾干；2)制備膠原-甲殼糖-硫酸軟骨素-透明質酸修飾液按質量比例為14～16∶2～4∶1∶1制備原料I型膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、透明質酸A；在36W紫外燈照射下，用0.1％乙酸攪拌溶解I型膠原然后加入甲殼糖，待甲殼素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入預先溶解好的6-透明質酸和硫酸軟骨素A溶液，繼續攪拌溶解3小時；使膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、透明質酸A最終濃度分別為7-8mg/ml、1-2mg/ml、0.5mg/ml和0.5mg/ml；然后在冰浴條件下加入0.5ml 10×DMEM培養液，用1mol/L的NaOH快速調pH至7.2-7.3；3)修飾PHBV支架將2)步制備的復合膠原修飾液均勻涂布于1)步制備的PHBV多孔三維支架表面，室溫條件下靜置20-30min，以此面為真皮面，在PHBV多孔三維支架的另一面，用濃度為0.4％的人源IV型膠原蛋白浸泡20-30min，此面為表皮面；II、制備表皮干細胞采用兩種途徑獲得表皮干細胞(ESC)1)從胚胎干細胞定向誘導分化制備表皮干細胞先制備羊膜片無菌條件下，取足月妊娠剖腹產的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素的PBS沖洗干凈血污，再轉移到DMEM液中；然后在無菌環境下，按6孔培養板或12孔培養板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，再將羊膜上皮面向上鋪布于6孔板或12孔板的孔底；最后加入無白血病抑制因子LIF的胚胎干細胞培養液，收集羊膜分泌液備用；從商業途徑購買人胚胎干細胞hES，傳代培養48小時后，以終濃度為0.125％的胰蛋白酶+0.01％EDTA消化液消化后按5×104個細胞/cm2密度接種于鋪布有羊膜的6孔或12孔培養板中，用無人LIF的ES細胞培養液培養；每隔1-2天半量換液；經過4天誘導分化培養后，收集粘附在羊膜上皮表面的表皮干細胞ESC；2)從人皮膚原代分離培養制備表皮干細胞將外科手術環切下的幼兒新鮮包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL鏈霉素的0.1mol/L的PBS緩沖液徹底清洗2次；然后在無菌條件下去除皮下脂肪和結締組織，將包皮剪切成約2.0mm×3.0mm的皮片；用質量濃度0.25％的裂解酶Dispases分離表皮和真皮，然后用生理鹽水或D-Hanks液清洗3-5次；表皮部分用質量濃度0.25％胰酶+0.02％EDTA按1∶1比例混合，4℃消化2±0.5小時，消化成單細胞懸液，然后接種于鋪布有質量濃度為0.4％的IV型膠原包被的培養皿中，置5％CO2、37℃培養箱內快速黏附10-15min后，棄去未粘附細胞；將粘附細胞吹打脫離培養壁，按1×104個/cm2置于第2步1)制備的鋪布有人羊膜的培養皿上繼續培養，培養基為無LIF的ES完全培養基；或將細胞接種于用5μg/ml絲裂霉素C處理的小鼠3T3成纖維細胞滋養層上繼續培養，所用培養基為全層皮膚專用培養基；將上述兩種方法之一制備的表皮干細胞以鼠抗人角蛋白19 CK19單克隆抗體和鼠抗人β1整合素單克隆抗體為一抗，采用免疫細胞化學方法鑒定細胞呈CK19陽性和β1整合素陽性；III、制備原代人成纖維細胞取外科環切手術獲取的包皮組織，以第2步2)所述方法分離皮膚真皮部分，以0.125％胰酶消化獲取原代培養人皮膚成纖維細胞，然后放入含10％新生牛血清高糖DMEM培養基培養，每24-36小時半量換液，培養3～4天，待細胞融合約80％時，縣酶消化收集細胞，制備以KSM培養基重懸的成纖維細胞用于全層皮膚制備；IV、全層皮膚專用培養基制備取第2步1)收集的人羊膜分泌液，經0.22μm微孔小組膜過濾后，與角質細胞無血清培養基KSM與按體積比1.5～2∶8～8.5混合，再添加關鍵促生長因子5×10-10M霍亂毒素、10ng/mL人重組表皮生長因子EGF、5μg/mL胰島素、0.5μg/mL氫化可的松、30μg/mL慶大霉素、15ng/mL兩性霉素、30μg/mL牛垂體提取物、5μg/ml轉鐵蛋白、1×10-10M甲狀腺素T3、24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分，培養基中鈣終濃度為0.10mM；V、全層皮膚制備將第1步所得的PHBV多孔三維支架置于6孔或12孔培養板上，經復合膠原修飾的真皮面向上，以最小容量100-200μl接種以人KSM培養基懸浮的原代培養人皮膚成纖維細胞，細胞密度為1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，待4-8小時細胞粘附后，加1.5-2ml足量角質細胞無血清培養基浸沒培養，每36-48小時半量換液，培養5-7天，完成全層皮膚真皮部分構建；將PHBV支架反轉，在表皮面接種第2步1)或2)制備的人表皮干細胞，接種細胞密度為1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，用第4步制備的全層皮膚專用培養基代替含10％新生牛血清的H-DMEM培養基，浸沒培養72-96小時后，采用氣-液界面培養，每48-60小時半量換液，10-14天后完成全層皮膚制備；VI、檢測同一批以12孔培養板制備的組織工程皮肷中，取其中一塊皮膚固定于以PBS配制的4％多聚甲醛溶液中，常規乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5μm-6μm，蘇木素-伊紅H.E染色；顯微鏡下觀察人工皮膚的組織結構去除皮膚結構不完整、表皮分層不明顯或缺少分層、角質細胞含量較少，真皮層成纖維細胞含量少、膠原排列紊亂者，即得表皮層含基底層、棘層、顆粒層和角化層等分化結構；真皮層含大量成纖維細胞，與PHBV支架融合性好，膠原纖維有序列排列；表皮真皮分界明顯的組織工程皮膚產品，可用于皮膚毒性檢測試驗。
2、根據權利要求1所述的采用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法，其特征在于所述的用質量濃度0. 25%裂解酶Dispases分離表皮和真皮，是將表皮和真皮在37 。C的溫度下經質量濃度0. 25%裂解酶消化3±0. 5小時；或是將表皮和真皮在4'C的溫度下經質量濃度0. 25%裂解酶消化12-18小時。
3、根據權利要求2所述的采用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法，其特征在于所述的胚胎干細胞培養液為采用80% DMEM基礎培養液，然后加入20%胎牛血清、lmML-谷氨酰胺、0.1 mM e-疏基乙醇、1000U/ml白血病抑制因子LIF 100U/ml青霉素及100ug/ml鏈霉素。
4、根據權利要求3所述的采用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法，其特征在于所述的胚胎干細胞ES為一種來源于的胚胎內細胞團或原始生殖嵴的全能干細胞。
5、根據權利要求4所述的采用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法，其特征在于所述的小鼠3T3成纖維細胞為一種來源于SWISS小鼠的成纖維細胞株，可從商業途徑購買。
6、根據權利要求5所述的采用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法，其特征在于所述的膠原為商品，主要成份為來源于牛肌腱或豬皮或鼠尾的I型膠原粉末。
7、根據權利要求6所述的采用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法，其特征在于所述的角質細胞無血清培養基SFM-KC可采用KBM或DK-SFM。
全文摘要
一種采用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法1.高分子真皮支架制備與修飾，2.從胚胎干細胞和皮膚組織制備表皮干細胞，3.制備原代人成纖維細胞，4.制備全層皮膚專用培養基，5.構建全層皮膚。本全層皮膚利用表皮干細胞分化增殖能力強的特點，構建的皮膚形態、組織結構和功能活性能滿足亞慢性毒性檢驗的需要；人工合成的支架材料標準化程度高、批間差異小；皮膚構建全程采用無血清培養基，減少了影響組織構建的因素，為以后用于毒性試驗奠定了基礎。通過本發明制備的全層皮膚更接近于天然皮膚，其應用于毒性檢驗的方式和檢測指標更符合實際情況，可以代替整體動物，直接應用于化學品、化妝品、藥品等健康相關產品的皮膚毒性試驗。
文檔編號C12N5/08GK101352586SQ20081003038
公開日2009年1月28日申請日期2008年8月26日優先權日2008年8月26日
發明者紅焦, 瑤秦, 程樹軍, 黃亞東申請人:程樹軍;廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心

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