專利名稱：一種白細胞介素-2重組逆轉錄病毒包裝細胞的制備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程、細胞工程領域，更具體地，本發明提供了一種白細胞 介素-2重組逆轉錄病毒的包裝細胞的建立方法。
背景技術：
原發性胃癌為我國高發的惡性腫瘤。在胃癌治療歷史上，手術切除是主要手
段，但術后常復發。胃癌晚期(ni期)患者，常缺乏有效的延長病人生命的治療方 法。若這些胃癌患者經一些有效的輔助治療措施使胃癌腫瘤縮小后，再行切除， 有可能使胃癌治療有一個突破。
90年代新興的腫瘤基因治療己成為腫瘤生物治療的重要措施之一，并被譽 為繼手術、化療和放療之后的另一種具有潛在前途的治療方法。近年來腫瘤基因
治療的研究無論從深度上還是廣度上都取得了很大進展。在獲得美國重組DNA 咨詢委員會(RAC)、 NIH專家委員會和FDA批準的基因治療臨床試驗方案中，以 腫瘤為最多，充分顯示基因治療在腫瘤研究中的迫切性。目前所開展的腫瘤基因 治療中，以腫瘤免疫基因治療的研究為最多。腫瘤細胞靶向的細胞因子基因治療 是以主動免疫治療為基礎，即將細胞因子基因轉導入腫瘤細胞中，以制備出免疫 原性更強的新型瘤苗，并由于細胞因子的持續分泌，從而激發機體產生抗腫瘤免 疫反應，達到治療腫瘤的目的。研究表明，細胞因子基因治療不僅在一定程度上 克服了以往臨床直接應用細胞因子需反復多次且副作用明顯的缺點，而且也取得 了直接應用所不具有的療效。
白細胞介素-2是由活化T細胞所分泌的一種細胞因子，具有刺激多種免疫 效應細胞活化的作用，包括T細胞、B細胞、NK細胞和巨噬細胞等。在腫瘤免疫 中起到重要作用。十多年前已開始將重組白細胞介素-2應用于臨床惡性腫瘤病 人。這種白細胞介素-2的系統性應用在黑色素瘤及其它一些腫瘤病人中取得一 定的效果，報道有效率為15~20%。這種療法主要是基于白細胞介素-2可使T細 胞活化，從而有助于殺傷腫瘤細胞。然而由于白細胞介素-2在血液中的半衰期較短，而反復多次大劑量的應用又產生嚴重的毒副作用，因而限制了白細胞介素 -2的臨床應用。
1990年，兩個研究小組分別報道了應用基因工程技術，將白細胞介素-2基因 轉導至腫瘤細胞。動物實驗結果表明，可分泌白細胞介素-2的腫瘤細胞喪失了致 瘤性。進一步觀察發現，體內接種白細胞介素-2基因轉導的腫瘤細胞后可抵抗后 續野生型腫瘤的攻擊。這些數據表明(l)基因修飾的腫瘤細胞自身可與T細胞 相互作用，(2)腫瘤細胞分泌的白細胞介素-2可替代輔助T細胞的作用，來激活 腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞[11]。類似的研究結果在多種腫瘤模型中相繼得到 證實，包括腸癌(CT26)、纖維肉瘤(CMS5)、肥大細胞瘤(P815)、黑色素瘤(M-3)1 等。
我們在動物腫瘤模型研究中也發現，白細胞介素-2基因修飾的小鼠腫瘤細胞 Hn及MM45T丄i均顯著降低其致瘤性，并能有效保護后續野生型腫瘤的攻擊。
與此同時，在全世界范圍內，應用白細胞介素-2基因工程瘤苗的臨床試驗不 斷獲得批準，在細胞因子基因修飾腫瘤細胞的臨床試驗方案中，以白細胞介素-2 基因應用最多。目前己有23個相關治療方案獲得批準，涉及到的腫瘤類型包括 黑色素瘤、腎癌、腸癌、前列腺癌、頭頸部腫瘤及肺癌等。
在所應用的基因轉移系統中，逆轉錄病毒載體系統應用最早，對其研究也很 深入。該系統最大的優點是可以前病毒形式穩定整合至宿主基因組中，從而使目 的基因的長期穩定表達成為可能。盡管這種整合形式有可能導致宿主基因組的插 入突變(insertion mutation),但采用安全的ex vivo治療方案，可使插入突變對機 體帶來的潛在危險降至最低。此外，作為第二代復制缺陷型逆轉錄病毒載體系統， LXSN系統更為安全，產生有復制能力的野生型病毒的可能性很小。該載體系統 也是被美國FDA獲得批準可應用于臨床試驗的載體之一。自1990年應用逆轉錄 病毒載體于臨床基因治療以來，尚無發現該病毒的毒副反應報道。
本發明提供了一種白細胞介素-2重組逆轉錄病毒的包裝細胞的建立方法，為 癌癥的治療提供了一種新的治療途徑。

發明內容
本發明提供了一種白細胞介素-2重組逆轉錄病毒的包裝細胞的建立方法。包括mRNA的抽提及cDNA的合成、PCR擴增IL-2基因、IL-2 cDNA的克隆、 含IL-2重組逆轉錄病毒載體的組建、以及白細胞介素-2重組逆轉錄病毒包裝細 胞制備。
在本發明的第一方面，提供了一種含信號肽的白細胞介素-2 cDNA的缺陷型 逆轉錄病毒載體LXSN的制備方法。
在本發明的第二方面，提供了一種含IL-2重組逆轉錄病毒載體的包裝細胞 PA317組建方法。


無。
具體實施例方式
第一步含信號肽的白細胞介素-2 cDNA的制備。
1. PHA剌激的人外周血細胞人外周血用淋巴細胞分離液分離出單 個核細胞，共約lxl(^細胞，經植物血凝素(PHA)10pg/ml剌激30小時， 使細胞因子基因表達，以備抽提mRNA。
2. mRNA的抽提及cDNA的合成
(1) mRNA的抽提離心收集細胞，懸浮于1.5mlRNA抽提緩沖液， 用注射器反復抽打勻漿細胞，然后再補加3ml抽提緩沖液，充分混合，離 心1000 cpm5分鐘，收集上清。取Oligo (dT)-Cellulose Spun Column,混 合內容物，350g離心兩分鐘，棄去柱內液體，取4ml上清上柱，混勻，棄 去液體。然后用高鹽緩沖液洗三遍，低鹽緩沖液洗二遍，最后用經65°C預 熱的洗脫緩沖液洗脫三次，每次用0.25ml，收集洗脫液，然后乙醇沉淀 poly(A)十RNA(mRNA)。
(2) cDNA的合成將mRNA溶于20|al ddH20中，65°C10分鐘，置于 冰上備用。在第一條鏈反應混合液內加入lmlDTT和熱變性的RNA， 37 'C保溫1小時，再將此反應液加入第二條鏈反應混合液中，12°C和22°C 各保溫1小時，最后加1^1 Klenow酶，37°C 30分鐘，65°C10分鐘后再用酚和氯仿抽提，經Sephacryl S-300柱純化后-2(TC保存。
2. PCR擴增IL-2基因取制備好的PBLcDNA10nl，加入5'和3'擴 增引物各lnl( 30pmo1)、 10X反應緩沖液5pl、 dNTP4pl、加水至50|al， 94°C 5分鐘變性，力卩Pfu酶1U(2.5U)，進行30個循環反應.(94。C 45"、 55tM5"、 72"C1'20")。反應結束后，將反應產物用等體積苯酚/氯仿抽提一 次，乙醇沉淀。
3. IL-2cDNA的克隆為了鑒定PCR產物的準確性，須先將產物克 隆入pUC 18或pBluescriptDNA ， 經DNA序列測定確認為IL-2 cDNA無 誤后再將這一片段回收，并與表達載體重組。故將PCR產物溶于TE，用 適當的限制性內切酶水解后，與用同樣酶水解過的載體DNA重組，轉化 TG1后涂于LB/AP平板，37'C培養過夜。
4. 質粒DNA小量抽提將一個單菌落接入含AP(50pg/ml)的3ml LB 中，37i:培養過夜。將菌液轉移至1.5ml離心管中，5000rpm離心2分鐘， 沉淀菌體。用100nl溶液I懸浮菌體，再加20(Hil溶液I1，溫和顛倒混勻， 置于冰上，待溶液澄清后，加入溶液m，充分混勻。15000rpm 10 分鐘離心，收集上清，用等體積苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，加2.5倍乙 醇混勻，沉淀。離心15000rpm 10分鐘，將沉淀用70%乙醇洗一次，水 泵抽干，最后溶于20plTE，用200嗎/ml RNase處理1小時，-20卩存放。
5. 質粒DNA的大量抽提
(1) 接種培養將一個單菌落接種于3mlLB(含AP)中培養至對數晚期 (OD600"0.6)，取500nl接種入50ml含抗菌素的LB中，同樣培養至對數 晚期，再取15ml接種入含相應抗菌素的1.5LLB中，培養過夜。
(2) 質粒抽提將1.5L培養物離心5500rpml0分鐘，收集菌體。用吸 水紙將離心管壁上殘余液體擦干。將菌體懸浮于30ml溶液I中，置室溫中 IO分鐘。加液體Il60ml，混合均勻后置冰上10分鐘。加溶液ni45ml，置 冰浴10分鐘后，15000rpm離心IO分鐘。紗布過濾后取上清，加等體積異 丙醇沉淀，15000rpm離心10分鐘，用70%乙醇洗一次，真空干燥。將沉 淀溶于20mlTE，加入等體積5M LiCl沉淀大分子RNA，在水浴中放置 IO分鐘，4。C15,000rpm離心10分鐘，取上清，用等體積異丙醇沉淀。離心，干燥，溶于5mlTE，加入RNase至200pg/ml， 37°C 30分鐘。加等體 積13%PEG(8000)/1.6M NaCl沉淀DNA，冰浴放30分鐘。離心沉淀，干 燥后用TE5ml溶解，用苯酚、苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇各抽提一 次。最后加1/10體積3MNaAc及2倍乙醇沉淀。.2(rC保存。用時再 離心沉淀，溶于TE。
(3) CsCl超離心純化DNA: 如上述堿法抽提的DNA，經LiCl純 化后，用于CsCl超速離心，按lg/ml的用量，加入固體CsCl， 3(TC溶解。 每10mlDNA加入0.8ml溴乙錠溶液(10mg/ml)， CsC溶液的最終密度是 1.55g/ml，折射率1.3860，溴化乙錠濃度約為704pg /ml。室溫8000rpm 5 分鐘，浮在溶液上的是溴化乙錠和蛋白質形成的復合物。將浮渣下的清亮 溶液用注射器吸入用于超離心的離心管中，用輕石蠟油補滿其余部分，并 封口。 45000轉/分離心24 48小時(20。C)。離心完畢，在普通光照下可 見兩條DNA區帶，下部區帶由閉環質粒DNA組成，用針頭插入此帶， 吸出至1.5ml管中，用等體積的經水飽和的正丁醇反復抽提,直至粉紅色從 水相和有機相中消失。將水相加3倍TE稀釋，加2.5倍無水乙醇沉淀。離 心后用70%乙醇洗一次，抽干后溶于TE， -2(TC保存。
6. 限制性內切酶反應根據不同的限制性內切酶選擇相匹配的緩沖 液。 一般取0.5 l|xg DNA，限制性內切酶 5U，反應體積20pl， 37°C 保溫1 2小時，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠0.5 l叫/ml)鑒定 酶切結果。
7. 凍融法回收酶切片段在紫外燈下將DNA片段從瓊脂糖凝膠中切 下來，加入10(HxlTE，在干冰乙醇內凍結后置37°C15分鐘，反復三次， 15000rpm離心10分鐘后吸出上清，加入1/10體積NaAc和2倍體積乙醇 沉淀，離心收集，沉淀經水泵抽干后，溶于TE，即可進行連接反應。
8. DNA連接將等克分子數的待連接DNA混合，加入5XT4連接酶 緩沖液4pl，加水至20nl，加入T4DNA連接酶2U， 12'C連接過夜，即可 用于轉化。
9. 重組DNA的轉化
(l)感受態細胞制備將培養過夜的受體菌25(Hil接種于50nlLB中，37°C1.5 3小時至對數中期，菌液置冰浴IO分鐘，5000rpm離心5分鐘， 沉淀菌體用1/2體積經預冷的100mM MgCI2懸浮，冰浴20分鐘，4°C 5000rpm離心5分鐘，將菌體懸浮于1/15 1/10體積的100mM CaCl2中， 冰浴中放60分鐘，即可用于轉化。
(2)重組DNA的轉化將連接過夜的DNA加入100^1感受態細胞， 混勻，冰浴中放置40分鐘，間或輕輕混勻，42'C2分鐘，涂布于含抗菌素 的LB平板上，37°C培養過夜。 10.雙鏈DNA測序
(1) 雙鏈變性樣品DNA約1.5-2(ag，溶于8jal ddH20，加2M NaOH 2pl， 置室溫IO分鐘，力[]3pl 3M NaAc中和，再加7nlddH20后，力卩60|iil乙醇 沉淀，離心15000rpm 10分鐘，抽干后溶于10^1 ddH20。
(2) 退火反應l(HU變性模板，加2pl引物，2lal退火緩沖液，65°C， 5分鐘，緩慢冷卻至室溫。
(3) 延伸反應將退火后的反應液加入lnlddH20標記混合物3^1、 T7聚合酶2pl(3U)、和0.5^1同位素(a-"P)標記的dATP，室溫反應5分鐘。
(4) 終止反應取上述反應液4.5^1至預先分裝好的4管分別標記有 G、 A、 T、 C的終止混合物中(各2.5pl)，混勻，37°C 5分鐘，加5|nl終止 液。在電泳上樣前樣品置75 8(TC2分鐘變性。
第二步含IL-2重組逆轉錄病毒載體的組建。
將pLXSN用EcoR I和BamH I酶切，與經同樣酶切的IL-2相連接，重組載 體經酶切鑒定后含有正確的插入片段，命名為L(IL-2)SN。
第三步產生含白細胞介素-2重組逆轉錄病毒的包裝細胞的建立
逆轉錄病毒載體是一種很有效的基因轉移系統。復制缺陷型逆轉錄病毒載體 經包裝細胞包裝，可產生出高滴度的病毒顆粒，并能高效感染靶細胞，通過整合 至宿主細胞基因組而獲得長期穩定表達。本研究采用安全性較高的第二代包裝細 胞PA317對含IL-2基因的缺陷型逆轉錄病毒載體L(IL-2)SN進行包裝，產生出 具有高滴度且不具有復制能力的重組逆轉錄病毒。1. 磷酸鈣-DNA共沉淀法
轉染前一天，將lx106 PA317細胞從培養瓶分至6cm培養皿中，轉染前先將 32|al CaCl2(2M)與220nl質粒DNA (IO嗎)充分混勻，再加250^1 2xHBS，滴加 同時輕柔搖動，置室溫30min，以形成細小均勻的沉淀顆粒。然后將上述溶液加 到含有細胞的培養皿，于37C°， 5%C02靜置20min。再加無血清DMEM培養液， 培養3天后更換培養液。繼續培養3天后用0. 5mg/mlG418進行篩選。約14天時 可見抗G418的細胞克隆形成，挑選單個克隆進行擴增。
2. 病毒滴度測定
病毒滴度測定以NIN313/TK—為指示靶細胞。lx105耙細胞培養1天后，加入 經過稀釋的含病毒上清液，并加入Polybrene (8ng/ml)。 37°C， 5%(]02培養3天 后，更換培養液，并加入G418 (0.5mg/ml)進行篩選。10 14天后可見抗G418 細胞克隆形成，Giemsa染色后，計算克隆數確定病毒滴度。
3. 病毒上清的保存
選擇病毒滴度大于lx104 CFU/ml的PA317克隆進行擴增培養，收集24小時 新鮮上清，于-70C。凍存備用。
4. 野生型病毒檢測
4. 1 NIH3T3細胞擴增培養
將NIH3T3細胞以lxlOV孔接種入6孔板中，用DMEM培養液(含10%新生小牛 血清)在37。 C， 5%(]02中培養24小時。去除6孔板中培養液后，每孔加入0. 5ml 待檢樣品及1. 5ml DMEM培養液，并加入終濃度為8嗎/ml的Polybrene，繼續 37° C， 5%0)2培養，擴增傳代1 3周。作為陽性對照，在6孔板中，每孔加入 0.5mlv)/AM培養上清，其余同上。在第一周末及第三周末分別收集NIH3T3細胞 24小時培養上清，過濾后用于標記拯救試驗；同時消化部分培養細胞，用于聚 合酶鏈反應(PCR)。 4. 2 S+L—分析
將PG4或MiCL,細胞株以105個/孔接種于6孔板中，加2.5ml培養液，過夜 后每孔加入20|ag/ml的DEAE Dextran; 30min后去除Dextran，各孔加入0. 5ml 上清，其中陽性對照為Mo—MuLV病毒上清，以1:10， 1:102， 1:103， 1:104稀釋， 另兩孔為陰性對照及PA317細胞上清，37° C溫育2h后去樣品另加2. 5ml新鮮培養液，培養1 2周后觀察結果。 4. 3聚合酶鏈反應(PCR)
用常規酚、氯仿法抽提細胞基因組DNA，以空白NIH3T3細胞的基因組DNA 為陰性模板，以v(/AM上清培養的NIH3T3細胞基因組DNA為陽性模板。建立常規 的PCR體系25)nl (模板DNA lpg、 L25mM dNTP 2^1、 10xBuffer 2.5^1、 e"K基 因引物2pl、 Taq酶2pl)，進行40次循環擴增反應(94° C:45" ， 64° C:45")， 最后72° C延長5分種。PCR產物在2免瓊脂糖凝膠電泳上觀察結果，陽性模板擴 增產物長度應為375bp。
PCR靈敏度檢測將陽性模板DNA按1:10、 1:102、 1:103、 1:104、 1:105、 1:106 稀釋，并同時加入陰性模板DNA，使每pl溶液中DNA總量為l嗎，而陽性模板 DNA依次為1:10一1、 l:l(T2、 1:1(T3、 1:1(T4、 1:10—5、 l:10、g，從上述溶液中各取 2plDNA作為模板進行PCR擴增。此實驗將能從106個細胞中檢測出1個帶有朋y 基因的陽性細胞，靈敏度為1(T6。 4.4標記拯救試驗
將lxl06Musdunni細胞接種于10cm培養皿中，置37° C， 5%(:02中培養24小 時。去除培養皿中培養液后，每孔加入2ml NIH3T3細胞培養上清(前述)及3ml DMEM培養液，并加入終濃度為8嗎/ml的Polybrene，置37° C， 5%0)2培養2周。 為設立陽性對照，去除培養皿中培養液后，加入2mlii/AM培養上清培養的NIH3T3 細胞培養上清，其余同上。收集前述Musdurmi細胞培養上清，過濾后取lml加 入到在6孔板中培養的NIH3T3細胞，置37° C， 5%0)2中培養24小時，用含 G418(0.6ng/ml)的培養液篩選培養8 10天。在標記拯救試驗中，如待測上清中 存在有復制能力的逆轉錄病毒，則可將Musdunni中的缺陷型逆轉錄病毒包裝出 來，收集上清感染NIH3T3細胞，缺陷型逆轉錄病毒可整合到宿主基因組中，使 NIH3T3細胞帶有Nec/基因，因此能在含G418的培養液中生長并形成克隆者為陽 性；不能生長者為陰性。
實施例1
NIH3T3細胞擴增培養 將NIH3T3細胞以lxl(f/孔接種入6孔板中，用DMEM培養液(含10%新生小牛 血清)在37° C， 5%C02中培養24小時。去除6孔板中培養液后，每孔加入0. 5ml待檢樣品及1.5ml DMEM培養液，并加入終濃度為8|ig/ml的Polybrene，繼續 37° C， 5%(]02培養，擴增傳代1 3周。作為陽性對照，在6孔板中，每孔加入 0.5mlvj/AM培養上清，其余同上。在第一周末及第三周末分別收集NIH3T3細胞 24小時培養上清，過濾后用于標記拯救試驗；同時消化部分培養細胞，用于聚 合酶鏈反應(PCR)。
實施例2
標記拯救
將lxl06Musdunni細胞接種于10cm培養皿中，置37° C， 5%032中培養24小 時。去除培養皿中培養液后，每孔加入2ml NIH3T3細胞培養上清(前述)及3ml DMEM培養液,并加入終濃度為8pg/ml的Polybrene，置37° C, 5%0)2培養2周。 為設立陽性對照，去除培養皿中培養液后，加入2mli)/細培養上清培養的NIH3T3 細胞培養上清，其余同上。收集前述Musdurmi細胞培養上清，過濾后取lml加 入到在6孔板中培養的NIH3T3細胞，置37° C， 5%0)2中培養24小時，用含 G418(0.6pg/ml)的培養液篩選培養8、0天。在標記拯救試驗中，如待測上清中 存在有復制能力的逆轉錄病毒，則可將Musdurmi中的缺陷型逆轉錄病毒包裝出 來，收集上清感染NIH3T3細胞，缺陷型逆轉錄病毒可整合到宿主基因組中，使 NIH3T3細胞帶有NeoB基因，因此能在含G418的培養液中生長并形成克隆者為陽 性；不能生長者為陰性。
權利要求
1.重組逆轉錄病毒的包裝細胞的建立方法，其特征在于，該反轉錄病毒載體為缺陷型逆轉錄病毒載體LXSN。
2. 如權利要求l所述，其特征在于，缺陷型逆轉錄病毒載體LXSN含有白細胞 介素-2 cDNA。
3. 如權利要求2所述，其特征在于，白細胞介素-2cDNA含有信號肽。
4. 如權利要求3所述，其特征在于，含有信號肽的白細胞介素-2 cDNA由如下 步驟得到.-從人外周血分離得到單核細胞，經植物血凝素(PHA)刺激36小時后抽提總 mRNA。在體外合成cDNA，并以此為模板，使用含相應內切酶位點的白細胞介 素-2上下游引物，以PCR技術擴增出含信號肽的IL-2 cDNA。
5. 如權利要求l所述，其特征在于，所用包裝細胞是第二代包裝細胞PA317。
全文摘要
本發明提供了白細胞介素-2重組逆轉錄病毒的包裝細胞的建立方法。采用安全性較高的第二代包裝細胞PA317對含IL-2基因的缺陷型逆轉錄病毒載體L(IL-2)SN進行包裝，產生出具有高滴度且不具有復制能力的重組逆轉錄病毒。
文檔編號C12N15/26GK101555467SQ20081003569
公開日2009年10月14日 申請日期2008年4月7日 優先權日2008年4月7日
發明者錢關祥, 陳詩書 申請人:上海交通大學醫學院;上海新生源醫藥研究有限公司