一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統及方法。該載體系統分為三質粒和二質粒載體系統。三質粒系統包括病毒表達載體、原env沉默質粒或合成的雙鏈siRNA、新env表達質粒、原嗜性病毒包裝細胞。二質粒系統包括病毒表達載體、新舊env變換質粒、原嗜性病毒包裝細胞。方法一是將三質粒系統中的三種質粒或二質粒系統中的二種質粒瞬時共轉染至原嗜性病毒包裝細胞內，獲得新嗜性的病毒。方法二是將三質粒系統中的原env沉默質粒與新env表達質粒或二質粒系統中新舊env變換質粒穩(wěn)定轉入原嗜性病毒包裝細胞，獲得新嗜性的病毒。本發(fā)明擴展了包裝細胞的嗜性，使其在基因工程和基因治療的應用性得到極大的增強。
【專利說明】一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統及方法
【技術領域】
[0001]發(fā)明涉及一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統及方法，尤其是能包裝出與包裝細胞原嗜性不同的逆轉錄病毒的包裝載體系統及方法。
【背景技術】
[0002]逆轉錄病毒是一種轉移基因很有效的基因轉移載體，在基因工程或基因治療領域，野生型的逆轉錄病毒由于在宿主細胞能不斷復制，具有毒性。為了阻止其病毒在宿主細胞復制，gag-pol和env (envelope)基因從病毒基因組中被剔除,使得病毒載體不具有復制性，在此病毒載體中可以插入我們想要轉移的目的基因，因此變?yōu)閹в心康幕虻臒o毒性的基因轉移病毒載體(通稱:逆轉錄病毒表達載體或逆轉錄病毒載體)。而gag-pol和env基因通過基因工程的方法被轉移到容易培養(yǎng)的細胞(比如293細胞、NIH-3T3細胞等)中穩(wěn)定表達，當逆轉錄病毒表達載體轉入該穩(wěn)定表達gag-pol和env基因的細胞中后，產生的病毒RNA就可被包裝成具有感染性的帶有目的基因的逆轉錄病毒粒子，因此能穩(wěn)定表達gag-pol和env基因的細胞我們稱之為包裝細胞。包裝細胞中表達的env蛋白能與要進入的宿主細胞膜表面的受體蛋白結合，因此該env蛋白決定了包裝出的逆轉錄病毒能感染什么種類的細胞，即病毒的嗜性(tropism)。根據env的不同，可以分為單嗜性(ecotropic)、多嗜性(amphotropic)、雙嗜性(dualtropic)和泛嗜性(pantropic)的包裝細胞，它們分別表達gap70、4070A、10Al、VSV-G包膜蛋白。單嗜性的包裝細胞包裝出的逆轉錄病毒只能感染小鼠和大鼠細胞，因為包裝出的病毒其包膜蛋白只能與小鼠或大鼠細胞上的受體結合；相似地，由多嗜性(amphotropic)、雙嗜性(dualtropic)和泛嗜性(pantropic)的包裝細胞包裝出的病毒能分別感染表達多嗜性受體Ram-Ι的哺乳動物細胞、能表達Ram-1或GALV受體的哺乳動物細胞、和哺乳動物細胞及非哺乳動物細胞(參考文獻1.Burns, J.C.,Friedmann, Τ., Driever, ff., Burrascano, M.& Yee,J.-K.(1993)Vesicular stomatitisvirus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very hightiter and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:8033 - 8037.)。泛嗜性的病毒是由水泡性口炎病毒(vesicularstomatitis virus, VSV)包膜蛋白(VSV-G)包裝成的病毒，它進入宿主細胞的方式不同于其他嗜性的病毒，不經過與受體結合，而是通過脂質結合通過細胞膜融合而進入宿主細胞(參考文獻 2 Emi, N., Friedmann, T.& Yee, J.-Κ.(1991) Pseudotyped formationof murine leukemia virus with G protein of vesicular stomatitis virus.J.Virol.65:1202 - 1207.)，因此它能進入幾乎所有的哺乳動物和非哺乳動物細胞。
[0003]目前已經建立了多種包裝細胞并可通過商業(yè)途徑獲得，比如基于NIH-3T3細胞的PT67、PA317 等，基于 HEK293 細胞的 B0SC23、Phoenix-E、Plat-E、GP2_293 等，這些包裝細胞在建立時都已穩(wěn)定轉入了特定的包膜蛋白，因此它們`的嗜性都已經決定了。當我們想用這些嗜性決定了的包裝細胞包裝出其他嗜性的病毒時，往往沒有辦法做到。到目前為止，直接用現有已確定了嗜性的包裝細胞來包裝不同嗜性的逆轉錄病毒的方法還未見到。
【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是針對現有技術的不足，提供一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統，可以簡單地拓展或改變現有包裝細胞的嗜性范圍，使包裝出的逆轉錄病毒從原本只能感染某些種類細胞改變?yōu)槟軌蚋腥酒渌N類細胞或能夠感染更大范圍種類的細胞，比如使原本只能包裝出感染鼠源細胞的逆轉錄病毒變?yōu)槟軌虬b出感染包括人源細胞在內的多種種類的細胞的逆轉錄病毒，為以逆轉錄病毒為基因載體的基因工程或基因治療提供新的方法。
[0005]本發(fā)明載體系統分為三質粒載體系統、二質粒載體系統兩種類型。
[0006]所述的三質粒載體系統包括逆轉錄病毒表達載體、原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白沉默載體(簡稱原env沉默質粒)或沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA、新嗜性病毒包膜蛋白表達載體(簡稱新env表達質粒)、原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞。
[0007]所述的二質粒載體系統包括逆轉錄病毒表達載體、新舊病毒包膜蛋白基因變換載體(簡稱新舊env變換質粒)、原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞。
[0008]在三質粒載體系統中:
[0009]所述的逆轉錄病毒表達載體為帶有目的基因的無毒性的逆轉錄病毒載體質粒，具體包含有逆轉錄病毒的5’ LTR和3’ LTR、包裝信號、目的基因序列。
[0010]所述的沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA為靶向原嗜性包裝細胞包膜蛋白基因的雙鏈siRNA，可通過RNA合成儀合成獲得。
[0011]所述的原env沉默質粒為帶有能使原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白表達沉默的表達盒的載體，包含有1個或多個能使原嗜性包膜蛋白表達沉默的表達盒，表達盒包含有啟動沉默包裝細胞病毒原包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA轉錄的啟動子(驅動轉錄shRNA、miRNA可以是Pol II或Pol III啟動子，驅動轉錄siRNA為Pol III啟動子)核苷酸序列、編碼shRNA或siRNA或miRNA的核苷酸序列、終止轉錄信號序列。表達盒能轉錄沉默包裝細胞原包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA。多個表達盒可轉錄出多個針對編碼原包膜蛋白的編碼序列的不同祀點的shRNA或siRNA(對miRNA而言，一個表達盒即可設計達到轉錄多個針對編碼原包膜蛋白的編碼序列的不同靶點的miRNA)，使原包膜蛋白沉默得更加徹底。
[0012]所述的表達盒可以頭頭相對或頭尾相連，也可以中間間隔其他元件分開排列。
[0013]所述的表達shRNA的表達盒包含有轉錄shRNA的啟動子序列、編碼shRNA的核苷酸序列、終止轉錄信號序列。
[0014]所述的表達siRNA的表達盒包含有轉錄雙鏈siRNA的相對的兩個pol III啟動子序列、編碼siRNA的核苷酸序列；其中該兩個pol III啟動子至少在-5到-1位突變?yōu)橄汆堰蔄的脫氧核糖核苷酸，·相互為另一個pol III啟動子提供終止信號poly T。
[0015]所述的表達miRNA的表達盒包含轉錄miRNA的啟動子序列、編碼miRNA的核苷酸序列、終止轉錄信號序列。
[0016]所述的pol II啟動子包括CMV、MSCV、SV40、PGK等啟動子(但不限于這些啟動子)，相對應的終止轉錄信號可為poly A,為pol II提供轉錄終止信號。
[0017]所述的pol III啟動子包括人源性的H1、U6、7SK等啟動子或小鼠源性的U6、H1等啟動子(但不限于這些啟動子)；相對應的轉錄終止信號可為poly T，為Pol III提供轉錄終止信號。
[0018]所述的新env表達質粒為不同于包裝細胞原嗜性的其他嗜性包膜蛋白表達質粒，具體包含有其他嗜性包膜蛋白的表達盒，該表達盒包含POL II啟動子核苷酸序列、編碼其他嗜性包膜蛋白的核苷酸序列、終止信號序列。
[0019]在二質粒載體系統中:
[0020]所述的逆轉錄病毒表達載體為帶有目的基因的無毒性的逆轉錄病毒載體質粒，具體包含有逆轉錄病毒的5’ LTR和3’ LTR、包裝信號、目的基因序列。
[0021]所述的新舊env變換質粒為載有沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的元件和表達新嗜性病毒包膜蛋白的元件的組合載體質粒，其中沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的元件包含1個或多個沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA表達盒，表達新嗜性病毒包膜蛋白的元件為表達新嗜性病毒包膜蛋白的表達盒，表達miRNA的表達盒與表達新嗜性包膜蛋白表達盒共用一個Pol II啟動子與poly A終止信號或分別使用不同的啟動子與終止信號。
[0022]本發(fā)明的另一個目的是利用上述改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統制備不同嗜性的逆轉錄病毒的方法。
[0023]本方法之一是將三質粒載體系統中逆轉錄病毒表達載體質粒、原env沉默質粒或沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA、新env表達質粒瞬時共轉染至原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞內，或者二質粒載體系統中的逆轉錄病毒表達載體質粒、新舊env變換質粒瞬時共轉染至原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞內，各質粒中表達盒在細胞中瞬時表達，得到新嗜性的逆轉錄病毒。
[0024]所述的瞬時表達為轉入的基因物質不整合進原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞的染色體DNA中，只在轉入的細胞中表達，在后代細胞中不一定表達。
[0025]本方法之二是將三質粒載體系統中的原env沉默質粒與新env表達質粒或二質粒載體系統中的新舊env變換質粒轉染至原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞，然后用藥物篩選出穩(wěn)定表達細胞株，獲得穩(wěn)定的新嗜性逆轉錄病毒包裝細胞，然后把逆轉錄病毒表達載體質粒轉染至此新嗜性逆轉錄病毒包裝細胞，得到新嗜性的逆轉錄病毒。
[0026]所述的穩(wěn)定表達為轉入的基因物質整合入原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞的染色體DNA中，在后代細胞中能穩(wěn)定表達。
[0027]本發(fā)明通過沉默包裝細胞的原包膜蛋白基因的表達，利用轉入其他不同嗜性包膜蛋白的基因，可以使包裝細胞包裝出不同嗜性的逆轉錄病毒，擴展了包裝細胞的嗜性，使其在基因工程和基因治療的應用性得到極大的增強。
[0028]本發(fā)明與現有技術相比，所具有的優(yōu)點、特點或積極效果，說明現有技術之缺陷:
[0029]到目前為止，直接改變現有已確定了嗜性的包裝細胞的嗜性的方法還未見到。
[0030]現有技術的缺陷在于無法改變或拓展現有已確定了嗜性的包裝細胞的嗜性范圍，當我們手頭只有某種嗜性的包裝細胞時，便不可能用該包裝細胞包裝出其他嗜性的逆轉錄病毒。
[0031]本發(fā)明與現有技術相比，改變逆轉錄病毒嗜性不用通過使用不同嗜性的包裝細胞，而是可以用手頭已有的確定了嗜性的包裝細胞，只需在包裝環(huán)節(jié)在轉染逆轉錄病毒表達載體質粒時，共轉染原env沉默質粒或合成的沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA和新env表達質粒,或共轉染新舊env變換質粒，即可包裝出不同嗜性的逆轉錄病毒，簡單易行；或者用手頭已有的確定了嗜性的包裝細胞，穩(wěn)定轉入原env沉默質粒和新env表達質粒，或新舊env變換質粒，即可改變或拓展包裝細胞的嗜性范圍，方便實用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1.為實施例1所采用的原env沉默質粒圖，其中各元件如下:
[0033]
【權利要求】
1.一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統，其特征在于分為三質粒載體系統、二質粒載體系統兩種類型；其中三質粒載體系統包括逆轉錄病毒表達載體、原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白沉默載體或沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA、新嗜性病毒包膜蛋白表達載體、原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞；二質粒載體系統包括逆轉錄病毒表達載體、新舊病毒包膜蛋白基因變換載體、原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞。
2.如權利要求1所述的一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統，其特征在于沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA為靶向原嗜性包裝細胞包膜蛋白基因的雙鏈 siRNA。
3.如權利要求1所述的一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統，其特征在于原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白沉默載體為帶有能使原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白表達沉默的表達盒的載體，包含有1個或多個能使原嗜性包膜蛋白表達沉默的表達盒，表達盒包含有啟動沉默包裝細胞病毒原包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA轉錄的啟動子核苷酸序列、編碼shRNA或siRNA或miRNA的核苷酸序列、終止轉錄序列，其中驅動轉錄shRNA、miRNA是Pol II或Pol III啟動子，驅動轉錄siRNA為Pol III啟動子；表達siRNA的表達盒包含有轉錄雙鏈siRNA的相對的兩個Pol III啟動子序列、編碼siRNA的核苷酸序列，該兩個Pol III啟動子至少在-5到-1位突變?yōu)橄汆堰蔄的脫氧核糖核苷酸，相互為另一個PolIII啟動子提供終止信號poly T。
4.如權利要求1所述的一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統，其特征在于所述的新嗜性病毒包膜蛋白表達載體為不同于包裝細胞原嗜性的其他嗜性包膜蛋白表達質粒，包含有其他嗜性包膜蛋白的表達盒，該表達盒包含Pol II啟動子核苷酸序列、編碼其他嗜性包膜蛋白的核苷酸序列、終止信號序列。
5.如權利要求1所述的一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統，其特征在于所述的新舊病毒包膜蛋白基因變換載體為載有沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的元件和表達新嗜性病毒包膜蛋白的`元件的組合載體質粒，其中沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的元件包含1個或多個沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA表達盒，表達新嗜性病毒包膜蛋白的元件為表達新嗜性病毒包膜蛋白的表達盒；其中表達miRNA的表達盒與表達新嗜性包膜蛋白表達盒共用一個Pol II啟動子與poly A終止信號或分別使用不同的啟動子與終止信號。
6.利用如權利要求1所述的一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統制備不同嗜性的逆轉錄病毒的方法，其特征在于該方法包括兩種形式，一種是將三質粒載體系統中逆轉錄病毒表達載體質粒、原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白沉默載體或沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA、新嗜性病毒包膜蛋白表達載體瞬時共轉染至原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞內，或者將二質粒載體系統中逆轉錄病毒表達載體質粒、新舊病毒包膜蛋白基因變換載體瞬時共轉染至原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞內，各質粒中表達盒在細胞中瞬時表達，得到新嗜性的逆轉錄病毒；另一種是首先將三質粒載體系統中的原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白沉默載體與新嗜性病毒包膜蛋白表達載體或二質粒載體系統中的新舊病毒包膜蛋白基因變換載體轉染至原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞，然后用藥物篩選出穩(wěn)定表達細胞株，獲得穩(wěn)定的新嗜性逆轉錄病毒包裝細胞，然后把逆轉錄病毒表達載體質粒轉染至此新嗜性逆轉錄病毒包裝細胞，得到新嗜性的逆轉錄病毒。
7.如權利要求6所述的利用改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統制備不同嗜性的逆轉錄病毒的方法，其特征在于沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA為靶向原嗜性包裝細胞包膜蛋白基因的雙鏈siRNA。
8.如權利要求6所述的利用改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統制備不同嗜性的逆轉錄病毒的方法，其特征在于原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白沉默載體為帶有能使原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白表達沉默的表達盒的載體，包含有1個或多個能使原嗜性包膜蛋白表達沉默的表達盒，表達盒包含有啟動沉默包裝細胞病毒原包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA轉錄的啟動子核苷酸序列、編碼shRNA或siRNA或miRNA的核苷酸序列、終止轉錄序列，其中驅動轉錄shRNA、miRNA是Pol II或Pol III啟動子，驅動轉錄siRNA為Pol III啟動子；表達siRNA的表達盒包含有轉錄雙鏈siRNA的相對的兩個Pol III啟動子序列、編碼siRNA的核苷酸序列，該兩個Pol III啟動子至少在-5到-1位突變?yōu)橄汆堰蔄的脫氧核糖核苷酸，相互為另一個Pol III啟動子提供終止信號poly T。
9.如權利要求6所述的利用改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統制備不同嗜性的逆轉錄病毒的方法，其特征在于所述的新嗜性病毒包膜蛋白表達載體為不同于包裝細胞原嗜性的其他嗜性包膜蛋白表達質粒，包含有其他嗜性包膜蛋白的表達盒，該表達盒包含Pol II啟動子核苷酸序列、編碼其他嗜性包膜蛋白的核苷酸序列、終止信號序列。
10.如權利要求6所述的利用改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統制備不同嗜性的逆轉錄病毒的方法，其特征在于所述的新舊病毒包膜蛋白基因變換載體為載有沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的元件和表達新嗜性病毒包膜蛋白的元件的組合載體質粒，其中沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的元件包含1個或多個沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的ShRNA或SiRNA或miRNA表達盒，表達新嗜性病毒包膜蛋白的元件為表達新嗜性病毒包膜蛋白的表達盒；其中表達miRNA的表達盒與表達新嗜性包膜蛋白表達盒共用一個Pol II啟動子與poly A終止信號或分別使用不同的啟動子與終止信號。
【文檔編號】C12N15/867GK103667350SQ201310681131
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權日:2013年12月12日
【發(fā)明者】王彥刈 申請人:杭州電子科技大學