專利名稱：一種檢測石蠟標本dna甲基化的方法
技術領域：
本發明涉及醫學生物學檢測技術領域，具體是一種檢測石蠟標本 DNA甲基化的方法。
背景技術：
DNA甲基化異常與腫瘤的發生、發展密切相關。近年來有關DNA 甲基化與腫瘤發生的關系日益受到人們的重視，成為腫瘤分子生物學 研究熱點之一。DNA甲基化的主要研究方法有甲基化特異性PCR。
以往實驗多采用新鮮組織，研究樣本來源有很大的局限性，而石 蠟標本來源豐富，而且可以針對新課題做回顧性分析，彌補了新鮮組 織標本存在的取材不易及保存困難等缺點，為臨床和科研提供了有利 的幫助，因此大大的方便了實驗研究。
傳統的從石蠟標本中制備檢測DNA甲基化的方法，主要過程如
下
1、制備待測DNA:
1) 脫蠟將石蠟標本切片用二甲苯脫蠟2次，再用無水乙醇洗滌 2次，組織千燥后，用基因組DNA抽提試劑盒制備DNA;
2) 細胞裂解加裂解液，在55'C下用蛋白酶K消化12—24小
時；
3) 抽提DNA:用酚氯仿抽提兩次；
4) 沉淀DNA:用無水乙醇沉淀，70%酒精洗滌，涼干備用。2、 DNA亞硫酸氫鈉修飾
1) DNA解鏈將h述制備的DNA變性，成為單鏈DNA，使堿 基充分暴露；
2) DNA亞硫酸氫鈉修飾將上述單鏈DNA與亞硫酸氫鈉反應， 使DNA單鏈上未甲基化的胞嘧啶被修飾成磺化胞嘧啶，脫氨基，該 磺化胞嘧啶變為磺化尿嘧啶；而5'-甲基化胞嘧啶不能被修飾；
3) 脫磺化將修飾后的DNA產物經過透析脫鹽，用氫氧化鈉脫 磺化，使得磺化尿嘧啶變為尿嘧啶，亦即原來沒有甲基化的胞嘧啶堿 基變為尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶不變。
3、 純化
上述修飾的DNA用酒精沉淀、洗滌，用作PCR模板。
4、 PCR擴增和檢測分析將純化的DNA修飾產物溶解于TE，用設計 的待測基因的正、反向甲基化特異性引物和未甲基化特異性引物進行 PCR擴增。將PCR擴增產物與標準品進行凝膠電泳檢測或DNA測序分
析，就可確定該基因的胞嘧啶甲基化程度。如果其中多數基因發生異 常甲基化，則就提示該患者可能得相應的癌癥。
具體步驟主要為
1、 制備待測DNA:按常規方法脫蠟和從組織中抽提DNA。
2、 DNA亞硫酸^l鈉修飾
1)、取1嗎DNA，溶于20nl水中，951C水浴10分鐘；立即放于 冰浴加入2n!10M氫氧化鈉，使DNA變性，成為單鏈DNA;2)、加入亞硫酸氫鈉修飾液230lU (3M亞硫酸氫鈉，lOmM氫醌， PH5.0);置于55'C避光修飾16小時，DNA被修飾，未甲基化的胞 嘧啶被修飾為磺化尿嘧啶。
3. DNA修飾產物的純化
1) 將上述DNA修飾產物在4"C下用雙蒸水透析過夜，去除多余 的亞硫酸氫鈉；
2) 脫磺化加入10MNaOH使其終濃度為0.3M，室溫20分鐘； 再加入等當量的1M鹽酸中和NaOH，磺化尿嘧啶脫磺化后成尿嘧啶;.
3) 沉淀加入四分之一體積的10M醋酸銨和2倍體積乙醇，將 DNA修飾產物置于-20'C沉淀過夜；
4) 洗滌13000rpm離心10分鐘，棄上清，用70%酒精洗滌2
次；干燥10分鐘，得純化的DNA修飾產物，亦即PCR模板。
4. PCR擴增和檢測分析
將純化的DNA修飾產物溶解于20jilTE，用設計的待測基因的正、
反向甲基化特異性引物和未甲基化特異性弓I物進行PCR擴增。 PCR反應體系如下
10xPCR buffer (without MgCl2) 2.5^1
MgCl2 (25mM) 2ji1
dNTP (2.5mM) 2jd
IH向引物(20pM) 0.5jil
反向引物(2(HiM) 0.5^1
H20 16nl 模板
T叫酶(5, 0.5pl
總體積 25jd反應條件如下
94匸3分鐘 94 "€ 20秒, 58*€ 20秒35循環 72。C 15秒一 72*C 5分鐘
檢測分析將PCR擴增產物與標準品進行凝膠電泳檢測或DNA測 序分析，就可判斷該基因的胞嘧啶甲基化程度。
但是上述方法存在如F不足1、由于組織經甲醛固定后DNA的 嘌呤基之間及堿基與組蛋白之間形成了以甲醛為介體的甲基橋，造 成DNA交聯，這種交聯的DNA從石蠟包埋組織中提取時容易隨機降 解；2、由于在酚氯仿等的抽提過程中，經過震蕩，DNA也將發生部 分斷裂，因此從石蠟標本提取的DNA比較短，通常是彌散的一片， 堿基長度從100到2000都有；3、 DNA在亞硫酸氫鈉修飾時會發生脫 嘌呤作用而產生斷裂，這使得石蠟標本的DNA用于甲基化特異性PCR 更為困難此外，這種傳統的方法操作麻煩，耗時長，工作量大，需 要接觸有毒藥物酚氯仿等，自1985年Goelz等首先從10%甲醛固定 石蠟包埋組織中提取出了DNA之后，許多學者對石蠟包埋組織提取 DNA的方法進行了研究，但現有的文獻報道看，這種方法獲得的DNA 模板PCR成功率不高，結果很不穩定，重復性差，制約了石蠟標本的 利用。

發明內容
本發明的S的是提供一種快速方便、結果穩定、重復性好的檢測 石蠟標本DNA基因甲基化的方法。
本發明方法的關鍵在于改變了以往的操作模式，先不將DNA從 標本組織中提取出來，而是將石蠟標本切片先固定在載玻片或過濾柱 上，再依次進行脫蠟、水化、高濃度亞硫酸氫鈉修飾、脫磺化處理， 最后用裂解液和蛋白酶K消化后從細胞中釋放出DNA修飾產物，轉 移到離心管中，用作PCR模板。 主要步驟如卜'
1、 固定石蠟切片將石蠟切片固定于載玻片或過濾柱上；
2、 脫蠟用二甲苯脫蠟，再用酒精將組織細胞水化；
3、 DNA亞硫酸氫鈉修飾直接在載玻片或過濾柱上進行細胞內DNA 的亞硫酸氫鈉修飾；
4、 脫磺化處理修飾后的DNA在細胞內進行脫磺化處理；
5、 裂解和消化細胞加入裂解液和蛋白酶K消化，修飾后的DNA 被釋放；消化產物離心，取上清，置851C10分鐘，使蛋白酶K滅活 后，可直接作為模板進行PCR擴增，或置一20^C保存；
6、 PCR擴增和檢測分析同上述傳統方法。
本發明方法由T先將石蠟切片固定于載玻片或過濾柱上，再進行 脫蠟、脫磺化等操作，最后通過細胞裂解，消化將修飾后的DNA釋 放出來；整個修飾過程DNA沒有從切片中抽提出來，DNA修飾、脫磺化等操作均在細胞內進行，不僅節省了時間，而且避免了因酚氯仿
抽提過程中DNA的反復沉淀、溶解轉移而造成的DNA損失和斷裂， 還有利于環境保護。


圖l:為實施例1檢測乙狀結腸癌(030081D)、胃角腺癌III級 (0300卯B)、胃竇腺癌(030083C)、卵巢癌(030082C)石蠟標本 GSTP1基因的PCR產物電泳圖譜。
圖2:為實施例2檢測乙狀結腸癌(030081D)、胃角腺癌in級 (030090B)、胃竇腺癌(030083C)、卵巢癌(030082C)石蠟標本 p16基因的PCR產物電泳圖譜。
具體實施例方式
現結合實施例對本發明作詳細描述。但本實施例僅用于說明本發 明而不用于限制本發明的保護范圍。 主要儀器及試劑來源
Eppendorf Model 5415R, Centriftiges低溫微高速離心機，英國 TECHNE公司產品；TC-512梯度PCR儀，英國Techne公司產品； FR-200A全自動紫外與可見分析裝置，上海復日科技有限公司公司產 品；亞硫酸氫鈉購自國藥集團，鹽酸胍購自國藥集團，氫醌購自上海 生工生物工程技術服務有限公司。實施例1.檢測結腸癌、胃癌、肝痛、卵巢癌石蠟標本中GSTP1基 因的甲基化實驗
據文獻報道，結腸癌、胃癌、肝癌、卵巢癌患者的GSTP1基因往 往處于甲基化狀態(Nakayama M， Bennett CJ, Hicks JL, et al. Hypermethylation of the human glutathione S-transferase-k gene (GSTPl) CpG island is present in a subset of proliferative inflammatory atrophy lesions but not in normal or hyperplastic epithelium of the prostate: a detailed study using laser-capture microdissection.Am J Pathol 2003;163:923 —33)。
乙狀結腸癌C030081D)、胃角腺癌III級(0300卯B)、胃竇腺癌 (0300830、卵巢癌(030082C)石蠟標本取自東方肝膽醫院病理科， 各標本實驗方法相同。 操作步驟如下
一、 脫蠟
石蠟標本切片，厚度為5Mm;將切片置于過濾柱中，加入500u 1二甲苯脫蠟10分鐘；離心，棄二甲苯；再次加入二甲苯脫蠟一次；
二、 標本水化
依次用無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇對組織細胞加 以水化，每次加500wl，置室溫3-5分鐘；離心，棄廢液；
三、 DNA亞琉酸氫鈉修飾
1 、加300 u 1變性液(30%乙醇，5%甘油，200mMNaCl， lOOmMNaOH) 使細胞內的DNA變性，室溫20分鐘；離心棄廢液；2、 加亞硫酸氫鈉修飾液750wl (5M亞硫酸氫鈉，10mM對苯酚)； 置55C水浴鍋避光修飾過夜，離心，棄修飾液；
3、 用蒸餾水洗滌2次，每次500ul，置室溫3-5分鐘，離心，棄廢 液；
四、 脫磺化
1、 加200u 1脫磺化液(200mMNaOH， 100mMNaCl， 5%甘油、30%
乙醇)，室溫20分鐘；離心，棄廢液；
2、 用蒸餾水洗滌2次，每次加500ul， 601C孵育10分鐘，離心，棄 廢液；
五、 細胞的裂解及DNA溶解
1 、加200 u 1裂解液(2.5% tween-20， 50mM Tris, lmMEDTA， PH8.0) 和10ug蛋白酶K， 55t:消化5小時；
2、將消化好的的樣品置離心管離心，取上清，即為修飾好的DNA 溶液，將其置f 85"C10分鐘，使蛋白酶K滅活。取2ylDNA溶液 做模板用于PCR擴增(25ul體系)，其余分裝保存于一801C。
六、 PCR擴增
根據GSTP1基因設計并合成甲基化特異性引物和未甲基化特異 性引物，包括iE向引物和反向引物(由上海博彩生物科技有限公司合 成)
甲基化正向引物《MF): TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC 甲基化反向引物(MR): GCCCCAATACTAAATCACGACG 擴增片段長度101 bp未甲基化正向引物(UF) : GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT 未甲基化反向引物(UR): CCACCCCAATACTAAATCACAACA 擴增片段長度101 bp
1、 PCR分為為2管進行， 一管用甲基化特異性引物，另一管用未甲 基化特異性引物擴增(正向引物用Pl表示，反向引物用P2表示)。 PCR反應體系如下
10x PCR buffer (without MgCl2)
MgCb (25mM)
dNTP(2.5mM)
P1(GSTP1， 20uM)
P2(GSTP1， 20uM)H2。
模板
Taq酶
總體積
2.5 "1
2ul
2ul
0.5 ul
0.5 ul
15ul
2ul
0.5"
25lil
其中，甲基化修飾和未修飾的DNA分別用甲基化引物和未甲基
化引物擴增。 2、反應條件如下 94X: 3分鐘
94*€ 20秒,
58X: 20秒
72°C 15秒」
72"C 5分鐘
35循環七、電泳檢測S
取8nlPCR擴增產物進行凝膠電泳，電泳結果見圖1。其中Marker 大小為100、 250、 500、 750、 1000、 1500bp。 M為甲基化引物擴增 產物；U為未甲基化引物擴增產物。1、 2、 3、 4樣品依次為乙狀結 腸癌(030081D)、胃角腺癌III級(0300卯B)、胃竇腺癌(030083C)、 卵巢癌(030082C)。
從圖1可見，樣品l、 2、 3、 4號既有用未甲基化引物擴增出DNA 片段(101bp)，又有用甲基化^異性引物擴增出特異條帶，表明l、 2、 3、 4號樣品的GSTP1基閔均有相當一部分被甲基化。
實施例2.檢測結腸癌、胃癌、肝痛、卵巢癌石蟮標本中pl6基因甲 基化實驗
乙狀結腸癌(030081D)、胃角腺癌III級(030090B)、胃竇腺癌 (030083C)、卵巢癌(030082C)標本來源同實施例1。 操作步驟如下.，
一、 脫蠟
1、 石蠟標本切片固定于載玻片切片厚度為5um，每張載玻片上撈 兩張切片；68匸烤片1小時；
2、 將載玻片置:p玻片架上，浸入—甲苯脫蠟2次，每次10分鐘。
二、 標本水化s將載玻片依次浸入無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇， 每次10分鐘，最后浸入蒸餾水清洗2次，每次10分鐘。
三、 DNA亞硫酸氫鈉修飾
將載玻片浸入0.2M NaOH 20分鐘，再浸入亞硫酸氫鈉修飾液 (5M亞硫酸氫鈉，10mM氫醌)置于55X:水浴鍋避光修飾過夜；最 后浸入蒸餾水清洗2次，每次10分鐘。
四、 脫磺化
將載玻片浸入脫磺化液(100mMNaCl， 200mMNaOH，30。/。乙醇， 5%甘油)20分鐘；再浸入蒸餾水室溫孵育2次，每次10分鐘。
五、 裂解
將載玻片置于濕盒，在組織片上加50 ul裂解液，(2.5% Tween-20， 50mM TriS， lmM EDTA， lO"g蛋白酶K)， 55。C消化5 小時；取出載玻片，將裂解液轉移入200ul離心管，用蒸餾水補足 50ul，置85'C變性10分鐘，即可用作PCR模板，或置-20t:保存備 用。
六、 PCR擴增
根據p16基因設計并合成甲基化特異性引物和未甲基化特異性 引物，包括正向引物和反向引物(由上海博彩生物科技有限公司合 成)
甲基化正向引物(MF): TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC 甲基化反向引物(MR): GACCCCGAACCGCGACCGTAA 擴增片段長度150bp未甲基化正向弓I物(U F)TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT 未甲基化反向引物(UR): CAACCCCAAACCACAACCATAA 擴增片段長度151bp
PCR反應體系及條件同實施例1。
七、電泳檢測
取8pl PCR擴增產物進行凝膠電泳，電泳結果見圖2。其中Marker 大小為100、 250、 500、 750、 1000、 1500bp。 M為甲基化引物擴增 產物；U為未甲基化引物擴增產物。1、 2、 3、 4樣品依次為乙狀結 腸癌C030081D)、胃角腺癌III級(030090B)、胃竇腺癌(030083C)、 卵巢癌(030082C)。從圖2可見，樣品l、 2、 3、 4用未甲基化引物 均擴增出DNA片段(151bp)，而甲基化特異性引物僅從2、 3號樣 品中擴增出很弱的條帶(151bp)，說明2、 3號樣品DNA的p16基 因有少量被甲基化，1、 4號樣品DNA的pl6基因則未甲基化。
上述實施例說明用本發明方法可以穩定檢測石蠟標本中DNA 甲基化，從而解決現有技術不能穩定檢測石蠟標本甲基化PCR的難
權利要求
1. 一種檢測石蠟標本DNA基因甲基化的方法，包括如下步驟石蠟切片脫蠟、細胞裂解、DNA亞硫酸氫鈉修飾、脫磺化、修飾后的DNA純化、PCR擴增和檢測分析，其特征在于先將石蠟標本切片固定在載玻片或過濾柱上，直接依次進行脫蠟、酒精水化、亞硫酸氫鈉修飾、脫磺化處理，再用裂解液和蛋白酶K消化后從細胞中釋放出DNA修飾產物，純化后用作PCR模板。
2、 按權利要求1所述的檢測石蠟標本DNA基因甲基化的方法，其 特征在于步驟如F:1) 、固定石蠟切片將石蠟切片固定于載玻片或置于過濾柱上；2) 、脫蠟用二甲苯脫蠟，再用酒精水化；3) 、 DNA亞硫酸氫鈉修飾直接在載玻片或過濾柱用高濃度亞硫酸 氫鈉修飾液進行亞硫酸氫鈉修飾；.4) 、脫磺化處理修飾后的DNA用脫磺化液在細胞內進行脫磺化處 理；5) 、裂解和消化細胞加入裂解液和蛋白酶K在55X:消化；6) 、滅活蛋白酶K:消化后的產物在85'C保溫10分鐘，使蛋白酶K 滅活后，產物即可作為模板進行PCR擴增；7) 、 PCR擴增和檢測分析。
3、 按權利要求2所述的檢測石蠟標本DNA基因甲基化的方法，其 特征在于所說的高濃度亞硫酸氫鈉修飾液含5M亞硫酸氫鈉， 10mM對苯酚；所說的裂解液為:2.5°/。 tween-20， 50mM Tris， lmM EDTA， PH8.0。
全文摘要
本發明涉及一種檢測石蠟標本DNA甲基化的方法，包括如下步驟石蠟切片脫蠟、細胞裂解、DNA亞硫酸氫鈉修飾、脫磺化、修飾后的DNA純化、PCR擴增和檢測分析，整個修飾過程DNA沒有從切片中抽提出來，DNA修飾、脫磺化等操作均在細胞內進行，不僅節省了時間，而且避免了因酚氯仿抽提過程中DNA的反復沉淀、溶解轉移而造成的DNA損失和斷裂，還有利于環境保護。
文檔編號C12Q1/68GK101285097SQ20081003845
公開日2008年10月15日 申請日期2008年6月3日 優先權日2008年6月3日
發明者衛立辛, 吳孟超, 張春東, 越 程, 蔣國成, 郭獻靈 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學