專利名稱：一種Taqman水解探針以及定量檢測MGMT甲基化程度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種Taqman水解探針和一種檢測MGMT甲基化程度的方法。
背景技術(shù)：
人類MGMT基因定位于染色體10q26，全長大約1701Λ，由5個外顯子以及4個內(nèi)含子構(gòu)成。MGMT蛋白在不需要任何輔助因子或其它蛋白質(zhì)的條件下，可以催化DNA分子中的鳥嘌呤O6位上的烷基轉(zhuǎn)移到MGMT本身第145位的半胱氨酸殘基上，鳥嘌呤得以復(fù)原，DNA 的結(jié)構(gòu)和功能得以恢復(fù)，從而保護(hù)細(xì)胞免受烷化劑的損傷。含甲基和氯乙基抗癌藥物的細(xì)胞毒作用主要是有賴于它與DNA之間形成烷基，引起鏈內(nèi)交聯(lián)的能力。而MGMT可將烷基從烷基化的DNA鏈中移除，致烷化劑治療無效。所以MGMT在正常組織中可消除烷化劑對細(xì)胞的致癌作用；在腫瘤細(xì)胞中卻能消除烷化類藥物的細(xì)胞毒作用。腫瘤細(xì)胞對含甲基和氯乙基的抗癌藥物耐藥常與高水平的DNA修復(fù)蛋白MGMT有關(guān)，O6烷基鳥嘌呤修復(fù)程度依賴于細(xì)胞內(nèi)MGMT的原始水平和新MGMT蛋白合成的程度，因此檢測MGMT啟動子區(qū)域的甲基化程度就有著重要的意義。目前檢測MGMT啟動子區(qū)域甲基化的方法主要有1、甲基化敏感性內(nèi)切酶；2、亞硫酸氫鹽的修飾；3、特異性識別甲基化修飾DNA的抗體或蛋白；4、質(zhì)譜或色譜等精密檢測手段。由于受到儀器等條件的制約，應(yīng)用比較廣泛的是前三種方法。甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶方法是經(jīng)典的甲基化分析方法，主要根據(jù)一些限制性內(nèi)切酶不能切開甲基化的DNA 序列。這是一種經(jīng)典的甲基化研究方法，其優(yōu)點(diǎn)是相對簡單，成本低廉，甲基化位點(diǎn)明確， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果易解釋；缺點(diǎn)是a、由于CG不僅僅限于CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；b、只有檢測與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時，該檢測方法的結(jié)果才有意義； c、相對而言，Southern方法較復(fù)雜，且需要樣本的量大；d、存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題；d、不適用于混合樣本。亞硫酸氫鹽的修飾法是目前應(yīng)用最廣泛的CpG島甲基化檢測方法。NaHS03可將非甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，后者經(jīng)PCR擴(kuò)增變成T而產(chǎn)生T =A配對， 但甲基化的C則能抵抗NaHS03的修飾，這樣DNA包含的甲基化信息就可轉(zhuǎn)化為DNA序列的差異。由此發(fā)展了多種CpG島甲基化檢測方法，如BSP測序、PCR(COBRA、MSP、Methelight 等)、芯片雜交技術(shù)(microarray)，此類方法適應(yīng)于檢測已知基因中一個或多個CpG島的幾個CpG位點(diǎn)的甲基化，屬位點(diǎn)特異性DNA甲基化檢測技術(shù)。其中MSP方法是目前應(yīng)用最廣泛的CpG島甲基化檢測方法，可檢出比例為千分之一的甲基化片段?？煽康腗SP，關(guān)鍵在于引物，其引物設(shè)計(jì)需兩個已知的、包含多個完全甲基化或非甲基化CpG位點(diǎn)的區(qū)域，但具有上述區(qū)域的CpG島并不多，限制了 MSP的使用。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述背景技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明針對人類MGMT基因啟動子區(qū)154 172DNA序列，提供了一種Taqman熒光水解探針，還提供了一種利用該Taqman水解探針定量
3檢測MGMT甲基化程度的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下該Taqman熒光水解探針的基本序列為GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列與基 因組DNA序列互補(bǔ)區(qū)向上游延伸不超過5nt，下游延伸不超過5nt。ー種利用上述Taqman熒光水解探針定量檢測MGMT甲基化程度的方法，包括以下 步驟(1)制備PCR反應(yīng)模板用亞硫酸氫鹽對樣品基因組DNA進(jìn)行甲基化轉(zhuǎn)化處理；(2)配置反應(yīng)體系向一支PCR反應(yīng)管中依次加入下列組份10 X PCR 緩沖液 2ul ；四種dNTP (三磷酸脫氧核苷酸)混合物各200umol/L ；甲基化上游引物 10 IOOpmol;甲基化下游引物 10 IOOpmol;亞硫酸鹽處理后模板DNA 25 50ng;熱啟動DNA聚合酶2.5u;加雙蒸水至20ul;向另ー支反應(yīng)管中依次加入下列組份10 X PCR 緩沖液 2ul ；四種dNTP (三磷酸脫氧核苷酸)混合物各200umol/L ；非甲基化上游引物 10 IOOpmol;非甲基化下游引物 10 IOOpmol;亞硫酸鹽處理后模板DNA 25 50ng;熱啟動DNA聚合酶2. 5u ；加雙蒸水至20ul ；(3)將反應(yīng)體系置于熒光PCR反應(yīng)儀中，按照以下程序進(jìn)行反應(yīng)；PCR反應(yīng)程序95 "C IOmin ；
權(quán)利要求
1.一種Taqman熒光水解探針，其特征在于該Taqman熒光水解探針的基本序列為 GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列與基因組DNA序列互補(bǔ)區(qū)向上游延伸不超過5nt，下游延伸不超過5nt。
2.一種利用如權(quán)利要求1所述的Taqman熒光水解探針定量檢測MGMT甲基化程度的方法，包括以下步驟(1)制備PCR反應(yīng)模板用亞硫酸氫鹽對樣品基因組DNA進(jìn)行甲基化轉(zhuǎn)化處理；(2)配置反應(yīng)體系向一支PCR反應(yīng)管中依次加入下列組份 10 X PCR 緩沖液 2ul ；四種dNTP (三磷酸脫氧核苷酸)混合物各200umol/L ；甲基化上游引物 10 IOOpmol ；甲基化下游引物 10 IOOpmol ；亞硫酸鹽處理后模板DNA 25 50ng ；熱啟動DNA聚合酶2. 5u;加雙蒸水至20ul ；向另一支PCR反應(yīng)管中依次加入下列組份 10 X PCR 緩沖液 2ul ；四種dNTP (三磷酸脫氧核苷酸)混合物各200umol/L ；非甲基化上游引物 10 IOOpmol ；非甲基化下游引物 10 IOOpmol ；亞硫酸鹽處理后模板DNA 25 50ng ；熱啟動DNA聚合酶2. 5u;加雙蒸水至20ul ；(3)將反應(yīng)體系置于熒光PCR反應(yīng)儀中，按照以下程序進(jìn)行反應(yīng)； PCR反應(yīng)程序·95 0C IOmin ；·95 0C45sec;>·57 0C45sec；> 40 cycle·72 0C30secr·72 0C 2min ；(4)通過熒光PCR儀配套軟件獲取分別對應(yīng)于兩支PCR反應(yīng)管的甲基化反應(yīng)的Ct值和非甲基化反應(yīng)的Ct值；(5)按照以下計(jì)算式甲基化百分含量=100/[1+2 (CtCG-CTTG) ] % 計(jì)算得到MGMT甲基化程度。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種Taqman熒光水解探針以及利用該Taqman水解探針定量檢測MGMT甲基化程度的方法。該Taqman熒光水解探針的基本序列為GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列與基因組DNA序列互補(bǔ)區(qū)向上游延伸不超過5nt，下游延伸不超過5nt。本發(fā)明雙重保證了PCR的特異性；可定量計(jì)算出混合樣本中甲基化DNA模板的百分含量；具備實(shí)時定量PCR的所有優(yōu)勢，如快速，靈敏，無污染等。應(yīng)用本發(fā)明的檢測結(jié)果可對腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤的化療用藥提供臨床指導(dǎo)，具有高特異性，高靈敏度和準(zhǔn)確定量等優(yōu)勢。
文檔編號C12N15/11GK102424857SQ201110455660
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者劉端, 周慧敏, 戴鵬高, 王浩, 陳超 申請人:陜西北美基因股份有限公司