專利名稱：大腸癌遺傳檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種檢測個體大腸癌遺傳易感性的試劑盒， 通過同時檢測與大腸癌密切相關的5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、谷胱甘肽硫轉移酶T1基因 (GSTT1)、谷胱甘肽硫轉移酶M1基因(GSTM1)、細胞色素P450 2E1基因(CYP2E1)、錯配修fe基因(hMLHl) 上的單核苷酸多態性位點基因型來評估個體大腸癌遺傳易感性。
背景技術：
大腸癌為結腸癌和直腸癌的總稱，指大腸粘膜上皮在環境或遺傳等多種致癌因素作用下發生的癌變， 是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率較高。當癌細胞繁殖時，光滑的腸壁變得粗糙、腫大及變硬，最后發生 潰瘍。潰瘍區容易出血或發展成一個狹窄區，妨礙排便。如果任由這種情形發展下去，癌細胞會沿著腸壁 擴散，并通過它擴散至鄰近腹部器官，還可能進入血液循環，從而擴散到身體其它部分。
..MTHFR的主要作用是在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有重要生物學功能的5-甲基 四氫葉酸。大腸癌受多種因素影響，其中葉酸水平高低對大腸癌易感性影響較大。當MTHFR基因變異時， 葉酸代謝通路發生改變，并且與葉酸攝入水平協同作用，導致大腸癌易感性也隨之發生變化。MTHFR基 因第5號外顯子上的一個C/T多態位點(C677T)突變，導致蛋白第222個氨基酸由Ala(A)變為Val(V)。 該多態位點的基因型有CC、 CT、 TT，其中CC被確定為風險基因型，與大腸癌的患病風險有關。在葉酸 水平足夠高，能夠滿足機體進行必須的DNA和蛋白質甲基化的基礎上，當攜帶風B僉基因型(CC)時，與 TT基因型相比，MTHFR耐熱性增強，酶活性增強，有利于5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸。 5,10-亞甲基四氫葉酸的量減少不利于dUMP轉變成dTMP,導致DNA合成中可能會摻入堿基U(阻礙DNA 合成)。DNA分子中的U堿基容易被一些酶剪切，從而造成DNA損傷。此時，大腸癌發生風險上升。
GSTM1酶活性的降低或缺火會增強個體對氧化應激產物和致癌物質的敏感性，使機體容易發生氧化 應激損傷和各種癌變。該基因的多態性與酶活性的改變有關，因此也與各種炎癥及癌癥有關，其中包括肺 癌、慢性胰腺炎、頭頸癌、肝癌和大腸癌等。Null/Present是GSTM1常見的多態性，該多態有二種基岡型， +/+、 +/_和-/-，分別代表無等位基因缺失，缺失一個等位基因，缺失兩個等位基因(完全缺失型)，其中完 全缺火型與火腸癌的發病相關。當GSTM1基因發生完全缺失時，人腸上皮細胞內無GSTM1表達，因此 也無GSTM1的解毒活性，造成環境毒素和致癌物質堆積，易發生DNA突變和染色體畸變，患大腸癌的 風險閃此顯著增加。
GSTT1酶活性的降低或缺失會增加個體對氧化應激產物和致癌物質的敏感性，使機體容易發生氧化應 激損傷和各種癌變。該基因的多態性與酶活性的改變有關，岡此也與各種炎癥及癌癥有關，其中包括多發 性硬化(MDS)、再生障礙性貧血、白血病、宮頸癌、乳腺癌等。在結腸和直腸上皮細胞中，GSTT1也是最 重要的解毒酶之一，與GSTM1之間有相互補償作用，所以GSTT1基閃多態性ili'是大腸癌的風險閔素。 基因缺失(Null)是GSTT1常見的多態位點之一，該多態導致GSTT1酶活性顯著下降。該位點有三種基因 艱，+/+、 +/-、 -/-，分別代表無等位基因缺失、缺失一個等位基因，缺失兩個等位基閃(完全缺失型)，其 中完全缺失型與大腸癌的發生有關。當GSTT1基因發生完全缺失時，大腸上皮細胞內無GSTT1表達，因 此也無GSTT1的解毒活性，造成環境毒素和致癌物質積累，易發生DNA突變和染色體畸變，患火腸癌的 風險因此顯著增加。
CYP2E1是細胞色素P450(CYP450)家族的一員，是藥物代謝的核心體系成員之一。CYP2E1基因上的 Rsa f(C-1053T)多態位點，位T CYP2E1基因的啟動于區域，等位基因用cl和c2表示。cl等位基因存在 Rsa I的酶切位點，c2等位基閃時Rsa I酶切位點消失。該基閃位點多態有cl/cl(CC)、 cl/c2(CT)和c2/c2(TT) 三種基因型，其中c2/c2基因型與大腸癌的發生有關。Rsal位點多態會影響基因的轉錄調節，c2鄰位基因 使得CYP2E1轉錄增加，CYP2E1表達也隨之增加，激活更多的致癌物，易導致大腸上皮細胞癌變。因此， 當攜帶風險基因型(c2/c2)時，大腸癌發生風險上升。
hMLHl基閃是錯配修復基閃中的一種，參與DNA復制過程中堿基錯配修復通路，具有錯配識別和指 導隨后的修復過程的作用。hMLH]基因缺陷可導致部分癌基因及抑癌基因突變，,',引發癌癥。目前研究最多的是該基閃在消化道癌癥中的作用，特別是:人腸癌。有研究表明，50-70%的遺傳性非息肉病性結直腸癌 (HNPCC)病人有可鑒別的hMLH 1和hMSH2突變，而近20%的散發性大腸癌存在hMLH 1突變。位于hMLH 1 基閃第12號外顯子上的T1151A多態位點，引起編碼蛋A的第384個氨基酸由Val[V]變為Asp[D]。該多 態位點存在三種基因型TT、 TA禾I1AA,其中AA基因型為風險基因型。當攜帶風險基因型(AA)時， hMLHl蛋白空間構象改變，基岡損傷修復功能受到影響，火腸癌的患病風險增火。

發明內容
基于5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、谷胱甘肽硫轉移酶T1基因(GSTT1)、谷胱甘肽硫轉 移酶M1基因(GSTM1)、細胞色素P450 2E1基因(CYP2E1)、錯配修復基因(hMLHl)上的5個SNP位點多態 性可用來評估個體大腸癌遺傳易感性的基礎上，本發明提供一種檢測個體大腸癌遺傳易感性的試劑盒。
該試劑盒包括
檢測MTHFR基因上C677T SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測GSTT1基因上SNP多態性基因型的電泳檢測引物對； 檢測GSTM1基因上SNP多態性基因型的電泳檢測引物對； 、 檢測CYP2E1基因上Rsa I SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； .檢測hMLHl基因上T1151A SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應緩沖液、去離子水等)； 熒光定量PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應緩沖液、去離子水等)。 本試劑盒中所述的引物對是本領域技術人員能夠輕易完成設計的，并可用常規的合成技術進行合成。 本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是能夠輕易完成設計的，特異性熒光探紳，對可用常規的探針合成 技術進行合成。 " 本發明試劑盒的組分和含量包括
1. 熒光定量PCR反應套裝
10 X熒光定量PCR反應緩沖液3nl，
25mM dNTP混合液0.3 pl，
25mM MgC12溶液1. 8^1，
5units/nl Taq DNA聚合酶0.075^1，
20HM特異性引物對每條引物各0.225^1，
IOMM特異性熒光探針對每條探針各0.25Ul，
去離子水15.975^1。
2. 電泳檢測套裝
10X PCR反應緩沖液2.5nl， 25mM dNTP混合液0. 2^1, 25mM MgCh溶液1.5^1， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.125^1， 20nM電泳檢測引物對每條引物各0. 25^1， 去離子水18. 675^1, 本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。步驟2:電泳檢測分型
使用檢測試劑盒中的電泳檢測套裝，反應的體系為總體積25pl，包含濃度為12. 5ng/nl的DNA模板. 1^1、 IOXPCR反應緩沖液2.5^1， 25mMdNTP混合液0.2^1， 25mMMgC12溶液1.5^1， 5units/nl Taq DNA 聚合酶0.125^1， 20nM電泳檢測引物對每條引物各0.25jil，去離子水18.675^1。
在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為94°C、 12分鐘，進行30個循環的94°C、 30秒，60°C、 30秒， 72°C、 30秒，然后進行72。C、 IO分鐘。
然后利用電泳技術，進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶數量。
步驟3:熒光定量PCR反應
使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，分別進行3次獨立的熒光定量PCR反應，每個反應的體系為 總體積1(^1,包含濃度為20ngAi1的DNA模板2^1、 10 X熒光定量PCR反應緩沖液、0.1^1 25mM dNTP 混合液、0.6^il 25mM MgCh溶液、0. 025nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20-的有義引物和反義引物 各0.225nl、 10pM的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25^1,去離子水5. 325^1。
在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50'C、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進行60個循環的95°C、 30秒， 60'C、 l分鐘。反應結束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟4:基因型分析
根據試劑盒使用說明書標示的基因分型圖示對SNP位點進行基因型分析。
熟悉電泳檢測技術的本領域技術人員能夠通過辨識電泳圖上DNA條帶的位置和數量來確定所檢測的 SNP位點的基因型。
熟悉熒光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據不同序列探針VIC和FAM熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。
實施例2.應用檢測試劑盒進行個體大腸癌遺傳易感性檢測的服務 步驟l: DNA提取
由醫院檢驗科醫師指導被檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮 細胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的GSTT1基因和GSTM1基因上的SNP位點進行PCR. 擴增和電泳檢測，對MTHFR基因上C677T SNP位點、CYP2E1基因上Rsa I SNP位點、hMLHl基因上T1151A SNP 位點進行熒光定量PCR檢測，確定這5個SNP位點的基因型。
步驟3:個體大腸癌遺傳易感性的分析
通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具個體大腸癌遺傳易感性的分析報告單。報告中詳細說明了被 檢測者大腸癌遺傳風險的高低，并由醫師向被檢者詳細說明和解讀個體大腸癌遺傳易感性分析報告單。
權利要求
1.一種檢測個體大腸癌遺傳易感性的試劑盒，其特征在于包括同時檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)上C677T SNP位點、谷胱甘肽硫轉移酶T1基因(GSTT1)上SNP位點、谷胱甘肽硫轉移酶M1基因(GSTM1)上SNP位點、細胞色素P4502E1基因(CYP2E1)上Rsa I SNP位點、錯配修復基因(hMLH1)上T1151A SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1) 熒光定量PCR反應套裝IOX熒光定量PCR反應緩沖液3W，25raMdNTP混合液0. 3W， 25mMMgC12 溶液1.8W， 5unitsM Taq DNA聚合酶0.075W, 20ffl特異性引物對每條引物各0.225W， IOHM特異 性熒光探針對每條探針各0. 25^1，去離子水15. 975W。2) PCR反應套裝:IOXPCR反應緩沖液2. 5W， 25mM dNTP混合液0. 2W， 25mMMgC12溶液1.5^1， 5unitsA4 Taq DNA聚合酶0. 125W， 2(Ml特異性引物對每條引物各0.25W,去離子水18.675W。 本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發明公開了一種檢測大腸癌遺傳風險的試劑盒。該試劑盒包括檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、谷胱甘肽硫轉移酶T1基因(GSTT1)、谷胱甘肽硫轉移酶M1基因(GSTM1)、細胞色素P450 2E1基因(CYP2E1)、錯配修復基因(hMLH1)的單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR常規組件、PCR反應組件等。本發明的試劑盒通過同時檢測與大腸癌遺傳風險密切相關的基因上的多態性位點基因型來評估個體大腸癌遺傳風險。
文檔編號C12Q1/68GK101608224SQ20081003926
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月20日 優先權日2008年6月20日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司