一種大腸癌篩查試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種大腸癌篩查試劑盒，它包括檢測本發明18種基因中任意一個或者任意多個基因的表達水平的相關試劑。本發明還公開了18種基因在制備大腸癌篩查試劑中的用途。本發明還公開了18中基因的檢測方法、檢測試劑盒，以及大腸癌的篩查方法。本發明試劑盒可以準確檢測待檢樣本是否患大腸癌，臨床應用前景良好。
【專利說明】一種大腸癌篩查試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種大腸癌篩查試劑盒。
【背景技術】
[0002]大腸癌，是最常見的惡性腫瘤之一，其在美國人腫瘤發病率中排名第五，在中國人腫瘤發病率中排名第四，是歐洲人第三大致死腫瘤疾病。當大腸癌處于早期時，其治愈率較高，大腸癌的早期篩查是成 功治療和患者存活的關鍵，也是公共衛生領域的一大挑戰。
[0003]傳統檢測方法包括大便潛血實驗、乙狀結腸鏡檢查、結腸鏡檢查、雙重對比鋇餐檢查和直腸指檢。這些檢查的患者依從性低，操作復雜。需要尋找患者依從性高，操作簡便的方法。
[0004]尋找外周血中的生物標志物，檢測大腸癌是近年來比較熱門的方法。Han等比較101例大腸癌和110例對照的外周血基因表達譜，構建基于5個基因的預測模型，模型的敏感度和特異度分別為88%和64% (Han M, Liew C T, Zhang H W，et al.Novelblood-based, five-gene biomarker set for the detection of colorectal cancer[J].Clin Cancer Res, 2008，14(2):455-460.)。Marshall 等從 314 例大腸癌和 328 例正常對照研究中發現7個顯著基因，預測模型的敏感度和特異度分別為72%和70% (Marshall K W,Mohr S，Khettabi F E，et al.A blood-based biomarker panel for stratifying currentrisk for colorectal cancer[J].1nt J Cancer，2010，126(5):1177-1186);Rosenthal 等比較314例大腸癌和328例正常對照的外周血基因表達譜，構建了 202個顯著基因的預測模型，模型的敏感度和特異度分別為90%和88% (Rosenthal A, Nuernberg D，Pross M，etal.Detector-C:A blood-based IVD with high sensitivity and specificity for earlydetection of colorectal cancer[J].J Clin 0ncol28:15s，2010(suppl;abstr3580)o 上述檢測方法中，檢測基因數目較少時，敏感度和特異度低，而敏感度和特異度較高時，檢測基因數目過大,成本高。

【發明內容】

[0005]為了解決上述問題，本發明提供了一種新的大腸癌篩查試劑盒。
[0006]一種大腸癌篩查試劑盒，它包括檢測如下18個基因中的任意一個或者多個基因的表達水平的相關試劑:DUSP2，如SEQ ID N0:1所示;NEAT1，如SEQ ID N0:2所示；MYBLl,如 SEQ ID N0:3 或者 4 所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10，如 SEQ ID NO: 7或者 8 所示；GZMB，如 SEQ ID NO:9 所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D，如 SEQ ID NO: 14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示；FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT2OT2，如 SEQ ID NO: 26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者
31所示；NUDT16 JnSEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JnSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示;ITPRIPL2，如 SEQ ID NO:37所示；IL1B，如 SEQ ID N0:38所示;DHRS13，如 SEQ ID N0:39所示；PDZK1IP1，如 SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示。[0007]其中，所述試劑為檢測所述基因轉錄的RNA，特別是mRNA的量的試劑。
[0008]其中，所述試劑為檢測與所述mRNA互補的cDNA的量的試劑。
[0009]其中，所述試劑為檢測與所述cDNA互補的cRNA的量的試劑。
[0010]其中，所述試劑為探針。
[0011]其中，所述試劑為檢測所述基因編碼的多肽的量的試劑。
[0012]其中，所述試劑為抗體、抗體片段或者親和性蛋白。
[0013]本發明還提供了如下18個基因中任意一個或者任意多個基因在制備大腸癌篩查試劑中的用途:DUSP2，如 SEQ ID N0:1 所示;NEAT1 JnSEQ ID N0:2 所示;MYBL1，如 SEQ IDN0:3或者4所示；ITGAM，如SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10 JnSEQ ID NO: 7 或者 8 所示；GZMB，如 SEQ ID NO: 9 所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示；PDE4D，如 SEQ IDN0:14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示;FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT25D2 JBSEQ ID NO: 26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JnSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQID N0:37 所示；IL1B，如 SEQ ID N0:38 所示;DHRS13，如 SEQ ID NO:39 所示；PDZK1IP1，如SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示。
[0014]其中，所述試劑是檢測18個基因中的任意一個或者多個基因的表達水平的相關試劑。
`[0015]其中，所述試劑還包括大腸癌陽性樣品和大腸癌陰性樣品。
[0016]其中，所述試劑為檢測所述基因轉錄的RNA，特別是mRNA的量的試劑。
[0017]其中，所述試劑為檢測與所述mRNA互補的cDNA的量的試劑。
[0018]其中，所述試劑為檢測與所述cDNA互補的cRNA的量的試劑。
[0019]其中，所述試劑為探針。
[0020]其中，所述試劑為檢測所述基因編碼的多肽的量的試劑。
[0021 ] 其中，所述試劑為抗體或者親和性蛋白。
[0022]本發明檢測人體樣本，特別是人血液樣本中基因表達的方法，包括:(I)測定受試者血樣的基因組中任意一個或者任意多個基因轉錄的RNA的水平，所述基因組包括如下基因:DUSP2 JBSEQ ID NO:1 所示;NEAT1 JnSEQ ID NO: 2 所示;MYBL1 JnSEQ ID NO: 3 或者4 所示；ITGAMJn SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10，如 SEQ ID NO: 7 或者 8 所示;GZMB，如SEQ ID N0:9K*;SH2D2AjnSEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D，如 SEQ ID NO: 14,15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示;FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT25D2,如 SEQ ID N0:26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ IDNO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JBSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ IDNO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示；
[0023](2)檢測受試者血樣中的基因表達。
[0024]優選地，所述步驟(1)是測定基因組中任意六個基因轉錄的RNA的水平。所述六個基因為 NEATl、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZKITPI 和 VSIGlO。
[0025]優選地，所述步驟(1)是測定基因組中18個基因轉錄的RNA的水平。
[0026]其中，所述樣本是大腸癌陽性樣本。[0027]其中，所述樣本是大腸癌陰性樣本。
[0028]其中，所述步驟(1)使用至少一個寡核苷酸。
[0029]其中，一個寡核苷酸僅與一個基因轉錄的RNA雜交，和/或可以與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交。
[0030]其中，所述步驟(1)包括如下步驟:
[0031]a、擴增所述基因轉錄的RNA，得擴增產物；
[0032]b、使用至少一個引物檢測步驟a所得擴增產物的量。
[0033]其中，所述步驟(1)包括如下步驟:
[0034]1、用至少一個探針與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交，得雜交產物；
[0035]?、檢測步驟i所得雜交產物的量。
[0036]其中，所述步驟(1)包括擴增所述基因轉錄的RNA的方法。
[0037]其中，所述步驟(1)包括檢測所述基因轉錄的RNA互補的cDNA的量的方法。
[0038]其中，所述步驟(1)至少使用一個探針。
[0039]其中，所述步驟(1)至少使用一個引物。
[0040]本發明寡核苷酸，它僅與一個基因轉錄的RNA雜交，和/或可以與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交，所述屬于一個基因組的基因由如下基因組成:DUSP2，如SEQ ID NO:1所示；NEAT1，如 SEQ ID NO: 2 所示；MYBLl，如 SEQ ID NO: 3 或者 4 所示；ITGAM，如 SEQ IDN0:5或者6所示；P2RY10，如 SEQ ID N0:7或者8所示;GZMB，如 SEQ ID NO:9所示；SH2D2A，如SEQ ID N0:10、ll、12或者 13所示；PDE4D，如SEQ ID NO: 14、15、16、17、18、19、20、21 或者22所示；FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24或者 25 所示;GLT25D2，如 SEQ ID NO: 26所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示;NUDT 16 JnSEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5，如SEQ ID N0:34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37 所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ IDN0:41所示。
[0041]所述的寡核苷酸選自SEQ ID N0.42~77所示的核苷酸序列。
[0042]本發明檢測人體樣本，特別是人血液樣本中基因表達的試劑盒，包括18個基因的18種表達產物的特異配偶體，每個配偶體與每個基因特定配合，所述18個基因如下所示:DUSP2 JBSEQ ID NO:1 所示;NEAT1 JnSEQ ID NO: 2 所示;MYBL1 JnSEQ ID NO: 3 或者 4 所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10，如 SEQ ID NO: 7 或者 8 所示;GZMB，如 SEQID N0:9 所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D JnSEQ ID N0:14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示；FAM198B,如 SEQ ID N0:23、24 或者 25 所示；GLT25D2,如 SEQ ID N0:26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ IDNO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JBSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ IDNO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示。
[0043]其中，所述特異配偶體是寡核苷酸，特別是探針和/或引物。
[0044]其中，所述特異配偶體選自SEQ ID N0.42~77所示的核苷酸序列的集合。
[0045]其中 ，所述特異配偶體包含抗體和/或親和性蛋白。
[0046]本發明通過血液樣本體外篩查人大腸癌患病風險的方法，它包括如下步驟:[0047]a)取血液樣本，檢測如下18個基因中任意一個或者任意多個基因的表達產物的量:DUSP2 JBSEQ ID NO:1 所示;NEAT1 JnSEQ ID NO: 2 所示;MYBL1 JnSEQ ID NO: 3 或者
4所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示;P2RY10,如 SEQ ID NO: 7 或者 8 所示;GZMB，如SEQ ID N0:9K*;SH2D2AjnSEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D，如 SEQ ID NO: 14,
15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示;FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT25D2,如 SEQ ID N0:26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ IDNO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JBSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ IDNO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示；
[0048]b)將步驟a)所得表達產物的量與大腸癌陽性樣品以及大腸癌陰性樣品的表達產物的量進行對比，所述大腸癌陽性樣品來自確診的大腸癌患者，所述大腸癌陰性樣品來自已證實的非大腸癌個體；
[0049]c)根據步驟b)的分析結果作出判斷:
[0050]如果步驟a)所得表達產物的量與大腸癌陽性樣品的表達產物的量相近或相同，則診斷為大腸癌患者；
[0051]如果步驟a)所得表達產物的量與大腸癌陰性樣品的表達產物的量相近或相同，則診斷為非大腸癌患者。
[0052]優選地，所述步驟a)是檢測18個基因中任意6個基因的表達產物的量。所述6個基因為 NEATl、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZKITPI 和 VSIGlO。
[0053]優選地，所述步驟a)是檢測18個基因中每個基因的表達產物的量。
[0054]其中，所述步驟a)中，檢測至少一個基因的表達產物的量是將所述基因的表達產物與該表達產物的特異配偶體接觸。
[0055]其中，步驟a)中，檢測基因的表達產物的量，所述基因的核酸序列選自SEQ IDNO:1~41所示序列集合。
[0056]其中，步驟a)所述表達產物包括至少一個RNA轉錄物或者一個多肽。
[0057]其中，所述表達產物包括至少一個mRNA。
[0058]其中，所述RNA轉錄物通過雜交、擴增或者測序的方法來檢測和定量。
[0059]其中，所述RNA轉錄物在預設條件下與至少一個探針和/或至少一個引物接觸，在預設條件下，所述探針和/或引物可以與RNA轉錄物雜交。
[0060]其中，與所述RNA轉錄物的cDNA在預設條件下與至少一個探針和/或至少一個引物接觸，在預設條件下，所述探針和/或引物可以與cDNA雜交。
[0061]其中，所述多肽的檢測是通過將多肽與至少一個特異配體接觸來檢測的，特別是與抗體或者親和性蛋白接觸。
[0062]其中，所述多肽與至少兩個特異配體接觸，特別是與兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白接觸。`
[0063]本發明通過血液樣本體外篩查人大腸癌患病風險的試劑盒，包括18個基因中任意一個或者任意多個基因表達產物的特異配偶體，每個配偶體與每個基因特定配合，所述18個基因如下所示:DUSP2，如SEQ ID N0:1 所示;NEAT1，如SEQ ID N0:2所示;MYBL1 JnSEQID N0:3或者4所示；ITGAM，如SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10 JnSEQ ID NO: 7 或者 8 所示；GZMB，如 SEQ ID NO: 9所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13所示;PDE4D，如 SEQID N0:14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示；FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT25D2 JBSEQ ID N0:26所示;CD36，如SEQ ID NO:27、28、29、30或者31 所示；NUDT16,如 SEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JnSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQID N0:37 所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZK1IP1，如SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示；
[0064]所述特異配偶體與基因的表達產物特異結合；
[0065]所述18個基因的核酸序列選自SEQ ID NO: 1~41所示序列的集合。
[0066]優選地，所述試劑盒包括18個基因中任意六個基因的表達產物的特異配偶體。所述六個基因為 NEATl、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZKITPI 和 VSIGlO。
[0067]優選地，包括18個基因中每個基因的表達產物的特異配偶體。
[0068]其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針。
[0069]其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和至少一個引物。
[0070]其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和兩個引物。
[0071]其中，所述特異配偶體包括至少一個特異配體，特別是抗體或者親和蛋白。
[0072]其中，所述特異配偶體包括至少兩個特異配體，特別是兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白。
[0073]本發明核酸序列如SEQ ID NO: 1~41所示的18個基因的表達產物的特異配偶體在制備體外篩查大腸癌患病風險的試劑中的用途，所述特異配偶體與18個基因的表達產物特異結合。
[0074]優選地，所述特異配偶體是18個基因中任意6個基因的表達產物的特異配偶體。所述六個基因為 NEATl、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZKITPI 和 VSIGlO。
[0075]優選地，所述特異配偶體是18個基因中每個基因的表達產物的特異配偶體。其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針。
[0076]其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和至少一個引物。
[0077]其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和兩個引物。
[0078]其中，所述特異配偶體包括至少一個特異配體，特別是抗體或者親和蛋白。
[0079]其中，所述特異配偶體包括至少兩個特異配體，特別是兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白。
[0080]本發明基因表達水平的檢測可以通過檢測RNA轉錄物來實現。
[0081 ] 術語“RNA轉錄物”是指總RNA，即編碼或者非編碼RNA，包括直接來自于外周血樣本中，也包括間接來自于細胞裂解后的血液樣本中的RNA。細胞裂解的方法可以采用申請號:W099/05338的專利申請公開的磁性和機械裂解方法，或者采用申請號:W099/53340的專利申請公開的磁裂解方法，或者采用申請號:W099/15321的專利申請公開的機械裂解方法，當然，也可以采用本領域公知的方法，如，熱裂解、高滲透壓裂解或者使用胍鹽等裂解液的化學裂解方法。細胞裂解后，還需要將核酸從裂解步驟產生的其他細胞組成物中分離出來，通常來講，離心即可純化核酸。總RNA包含tRNA，mRNA和rRNA，其中，mRNA包括目標基因轉錄的mRNA，也包括來自于其他非目標基因的mRNA。
[0082]本發明中，RNA轉錄物可以通過雜交、擴增或者測序的方法來檢測和量化。比如，將RNA轉錄物與探針或者引物雜交。[0083]術語“雜交是指在適當條件下，兩個核酸片段通過穩定且特異的氫鍵結合，形成雙螺旋復合物的過程。所述氫鍵存在于互補的腺嘌呤A和胸腺嘧啶T (或者尿嘧啶U)之間，簡稱A-T鍵，或者存在于互補的鳥嘌呤G和胞嘧啶C之間，簡稱G-C鍵。
[0084]兩段核酸片段的雜交可能是完全的(即形成完全互補的核苷酸片段或者序列)，雜交過程中形成雙螺旋復合物僅包含A-T鍵和G-C鍵；也可能是局部的(即形成充分互補的核苷酸片段或者序列)，雜交過程中形成雙螺旋復合物包含A-T鍵和G-C鍵，使得其可以形成雙螺旋結構，也包含未綁定到雙螺旋復合物上的堿基。
[0085]兩段核酸片段的雜交程度取決于雜交的反應條件，特別是嚴格程度。所述嚴格程度是指兩個核酸片段的堿基組成函數，也指兩個核酸片段的錯配程度。嚴格程度取決于反應條件，比如，雜交溶液中，離子的濃度和種類，變性劑的性質和濃度，和/或雜交溫度。這些條件是常規條件，本領域技術人員能確定合適的條件。通常來講，根據待雜交核酸片段的長度，雜交溫度在2(T70°C之間，優選在35~65°C之間，生理鹽水的濃度在0.5~IM之間。
[0086]術語“擴增引物”，是指包含5~100個核苷酸的核酸片段，優選地，包含能起始酶促反應(比如，酶促擴增反應)的15~30個核苷酸。
[0087]術語“酶促擴增反應”是指通過在至少一種酶的作用下產生核酸片段多拷貝的過程。所述擴增反應是本領域公知常識，且在如下技術中被提及:美國專利N0.4，683，195、美國專利N0.4，683，202和美國專利N0.4，800，159中描述的PCR(多聚酶鏈式反應)，申請號為:EP0201184的專利申請中公開的LCR(連接酶鏈式反應)，申請號為:W090/01069的專利申請中公開的RCR (修復鏈式反應)，申請號為:W090/06995的專利申請中記載的3SR (自主序列復制)，申請號為:W091/02818的專利申請中記載的NASBA(依賴核酸序列的擴增技術)，美國專利N0.5，399，491中記載的TMA (轉錄介導的擴增)。
[0088]當酶促擴增反應為PCR時，擴增一個目標基因至少需要2個目標基因特異性的引物，保證擴增產物與目標基因特異性一致。如，擴增產物可以為目標基因mRNA逆轉錄制備的互補DNA (cDNA),或者，與該cDNA互補RNA (cRNA)。當酶促擴增反應是反轉錄酶介導的PCR,即為 RT-PCR。
[0089]術語“雜交探針”是指包括至少5個核苷酸的核酸序列，比如，包含5~100個核苷酸，其能在指定條件下與目標基因的表達產物或者該表達產物的擴增產物雜交形成復合物。在本發明中，所述目標基因的表達產物包含目標基因mRNA，所述目標表達產物的擴增產物包括與目標產物mRNA互補DNA cDNA或者與cDNA互補的cRNA。雜交探針上還包括用于檢測的標志物。
[0090]術語“檢測”是指計數方式等直接檢測法和使用標志物方式等間接檢測方法。目前，有很多用于核酸檢測的方法(比如，Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, no45 (4),p.453-458or Keller G.H.et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections5and6, p.173-249 記載的方法)。
[0091]術語“標志物”是指可以產生能被檢測的信號的示蹤劑。示蹤劑列表:包括產生能被偵測到的信號的酶，比如，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，β -半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸或者脫氫酶，通過比色法，熒光或發光法檢測；發色團，如熒光，發光，染料化合物；電子密度基團，通過電子顯微鏡或憑借其導電性等電學性能、由安培法、伏安法或者阻抗測量的方法檢測；基團，通過光學方法，比如，衍射，表面等離子體共振，或接觸角變化，或原子力光譜隧道效應等物理方法檢測；放射性分子，比如32P，35S或者125I。
[0092]上述雜交探針是一種檢測探針。檢測探針被標志物標記的探針，如，Tyagi &Kramer (Nature biotech, 1996, 14:303-308)所述,檢測探針具體是指“分子信標”檢測探針。“分子信標”具有莖-環形結構，包括一個熒光基團和一個淬滅基團，當“分子信標”特異的環序列與其互補的目標基因的結合將會導致莖展開，并在適當的波長的激發過程中發射熒光。檢測探針具體還包括“報告探針”，如NanoString?’s技術所示，其包括一個“顏色編碼的條形碼”。
[0093]檢測探針包括熒光團和淬滅劑，如，6-羧基-熒光素或者6-羧基-X-羅丹明，3’末端有淬滅劑:4_ 二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯。
[0094]為了檢測雜交反應，需要對目標序列進行標記，可以是直接標記，具體是在目標序列內部加入標志物，也可以是間接標記，即使用檢測探針。具體是在雜交之前，實施包括標記和/或剪切目標序列的步驟，比如，在酶促擴增反應中使用被標記了的脫氧核糖核三磷酸。咪唑或者氯化錳可以達到剪切的作用。目標序列也可以在擴增步驟之后再標記，比如，通過申請號:W091/19812的專利申請文件中記載的三明治雜交技術雜交一個檢測探針。另外一種優選的方法是申請號:FR2780059的專利申請文件中記載的標記核酸序列的方法。
[0095]上述雜交探針也是一種“捕獲”探針。“捕獲”探針可以通過任何適合的方法，直接地或者間接地固定在固體基質上，比如，通過共價鍵結合或者吸附。所述固體基質，可以是合成材料，也可以是化學修飾或者非化學修飾的天然材料，具體可以是多糖，如，基于纖維素的材料、葡聚糖、共聚物和聚合物，基于纖維素的材料包含紙、纖維素衍生物，纖維素衍生物包括醋酸纖維素、硝酸纖維素；可以是苯乙烯型單、棉等天然纖維或者等合成纖維；可以是無機材料，如，二氧化硅、石英、玻璃或者陶瓷；還可以是乳膠、磁性粒子、金屬衍生工具、凝膠等。固體基質可以是微量滴定板，可以是申請號:W0-A-94/12670的專利申請文件中的固定膜，也可以是顆粒。針對每個目標基因，也可以在基質上固定不同捕獲探針，具體地，一個能夠固定大量探針的基因芯 片作為基質即可以實現。“基因芯片”是指很微小但固定了許多捕獲探針的固體基質，捕獲探針固定在預定位置上。
[0096]基因芯片，或者說DNA芯片的概念可以追溯到20世紀90年代初。它基于多學科技術，結合了微電子技術，核酸化學，圖像分析和信息技術。它的工作原理是分子生物的基礎:雜交現象，即，兩個DNA或者RNA序列的互補配對。基因芯片的方法基于固定在固體基質上的捕獲探針，直接或者間接熒光素標記的目標核酸片段的樣本可以與該探針相互作用。捕獲探針特異的固定在基質或者芯片上，每個雜交均可以給出一條與目標基因相關的特定信息。特定信息的集合使得計量一個或者多個目標基因的表達水平成為可能。為了分析目標基因的表達水平，需要準備包含大量探針的基質，這些探針與所有或者部分轉錄為mRNA的目標基因相關。其中，“低密度基質”是指包含的探針低于50個的基質，“中等密度基質”是指包含的探針數量為50-10000的基質，“高密度基質”是指包含超過10000個探針的基質。
[0097]目標基因的cRNA或者cDNA與特定的捕獲探針雜交后,清洗芯片或者基質,被標記的cDNA或者cRNA與捕獲探針的復合物可以通過綁定了熒光標簽的高親和力配體顯示出來。并通過信息技術作出分析熒光，得出結果。進行分子診斷時，不得不提Affymetrix公司制備的 DNA 芯片(("Accessing Genetic Information with High-Density DNAarrays", M.Chee et al., Science, 1996, 274, 610-614.^Light-generated ligonucleotidearrays for rapid DNA sequence analysis", A.Caviani Pease et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1994，91，5022-5026)，在該技術中，捕獲探針往往很小，含有25個左右的核苷酸。其他一些生物芯片分別在如下文獻中公開:G.Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, N0.1
6,p.40-44;F.Ginot, Human Mutation, 1997, N0.10, p.1-10;J.Cheng et al, Molecular diagnosis,1996, N0.1(3), p.183-200;T.Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, N0.22 (15), p.2915-2921J.Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998，N0.16，p.541-546,或者在美國專利N0.4，981，783、美國專利N0.5，700，637、美國專利N0.5，445，934、美國專利N0.5，744，305和美國專利N0.5，807，522中。固體基質的主要特征是保守捕獲探針與目標核酸片段的雜交，但產生的背景噪音卻很小。
[0098]捕獲探針固定在基質上的方式主要有二種:
[0099]1、將預先合成的探針布放于玻片載體上。通過微量、縮微或噴墨裝置，這種探針可以被直接附著到芯片上。這個技術允許附著的探針具有一系列大小不等的堿基，從幾個堿基(5~10個)，到較大尺寸的60個堿基(印刷)，再到幾百個堿基(微印刷)。
[0100]所述印刷與打印機的方式相似，是基于小球體流體以4000轉/s的速度推進。所述微印刷包括將含有幾十到幾百個堿基的長探針附著到玻璃載片表面上。這些探針通常來自于數據庫，是擴增和純化的產物。DNA可以處在小于4cm2大小的面積范圍內，制備得到微陣列芯片，微陣列可以攜帶大約I萬個識別區域的斑點。使用直徑為0.5^1mm的尼龍膜，攜帶擴增的產物(通常是PCR擴增的)，稱為巨陣列，其最大密度為25斑點/cm2。許多實驗室采用該技術。本發明中，微印刷技術是包含生物芯片的，如申請號:W0-A-00/71750或者FR00/14896的專利申請文件所示，一定體積的樣品可以沉積在微量滴定板的底部，或者依照如申請號:FR 00/14691的專利申請文件，一定數目的其他液滴能夠沉積在微量滴定板或者裴氏培養皿底部。
[0101]2、第二種在基質和芯片上附著芯片方法是原位雜交。這種技術在芯片表面直接產生短探針。該技術基于原位寡核苷酸合成(詳見申請號:W089/10977和申請號:W090/03382的專利申請文件)和寡核苷酸合成程序。它包括一個移動的反應室，在該反應室中，寡核苷酸衍生反應可以沿著玻璃表面進行。
[0102]3、第三種技術叫做光刻，即Affymetrix公司開發的專門用于基因芯片的程序。它也是一種原位雜交技術，來自于微處理器技術。具體地，芯片表面被附著物活化，附著物是能夠被光活化的不穩定化學基團。這些基團一旦被活化就可以與寡核苷酸序列的3’末端反應。通過在芯片表面用預定形狀掩膜掩蓋的方式可以選擇性的活化和激活芯片區域，在該掩蓋區域，可以結合四種核苷酸一個或者其他。不同掩膜的成功使用使得保護/反應可以交替循環，因而可以在大小約幾十平方微米的斑點產生寡核苷酸探針。該方式可以在幾平方厘米的表面區域產生成百上千的斑點。光刻的優點:可以通過4倍N循環產生N-mers的芯片。
[0103]擴增檢測目標基因的表達水平包括如下步驟:(I)提取全血的總RNA(包括tRNAs、rRNAs和mRNAs),逆轉錄得到所述mRNAs的cDNA。逆轉錄反應是通過逆轉錄酶實現的，比如，來自于禽骨髓母細胞瘤病毒AMV或者來自于莫洛尼鼠白血病病毒MMLV逆轉錄酶。若希望僅僅得到mRNAs的cDNA，應當在僅有胸腺嘧啶時逆轉錄，胸腺嘧啶與含有polyA的mRNA序列雜交形成polyA-polyT復合物,該復合物作為逆轉錄的起始點，即可得到目標基因特定的cDNAs和非目標基因特定的cDNAs。(2)將目標基因的引物與步驟(1)得到的cDNAs混合。引物會與目標基因cDNAs雜交，特異性的擴來自于目標基因的cDNAs，非目標基因cDNAs則不會擴增，從而得到得到大量目標基因特異的cDNAs。依照本發明的目的，目標基因特異的cDNAs與源自目標基因來源的mRNAs的cDNA。本步驟可以通過通過PCR擴增更或者其他上述定義的擴增方式來實現。若用PCR進行擴增，可以使用多對引物多重PCR同時擴增多個目標基因。(3)檢測或者定量步驟(2)得到的目標基因cDNAs來測定目標基因的表達水平。可以根據獲得的特定目標基因cDNAs電泳距離，按照它們的分子量大小來檢測。電泳檢測時，遷移的凝膠和介質包括溴化乙錠，經過一段時間的遷移后，在紫外光下檢測電泳條帶，即可直接確定目標基因特異性的cDNAs的表達，目標基因特異性的cDNAs的表達量越高，電泳條帶就越亮。電泳技術是本領域的公知常識。還可以用表達量的范圍來確定，考慮到各個步驟中酶效率的多樣性，目標基因的表達可以通“管家”基因來校正，“管家”基因在正常人中也有表達。通過確定目標基因和管家基因的比值來檢測，即目標基因特異性的cDNAs的表達量與管家基因特異性的cDNAs的表達量的比值，實驗間的多樣性就可以得到校正。本領域技術人員所知曉的該技術記載在如下出版物:Bustin SA, J Mol Endocrinol，2002，29:23-39;Giulietti A Methods, 2001，25:386-401。
[0104]雜交檢測目標基因表達的步驟如下:(I)同上述方法步驟(I )，提取全血的總RNA，逆轉錄得到所述mRNAs的cDNAs,該mRNAs包括目標基因的mRNAs,也包括非目標基因的mRNAs。(2)將cDNAs與固定了目標基因特異性的捕獲探針的基質混合，目標基因特異性的捕獲探針將與目標基因特異性的cDNAs發生雜交反應，而與非目標基因特異性的cDNAs不發生雜交反應。雜交反應可以在包括前述提到的所有材料的固體基質上進行。在本發明優選實施例中，基質是前述定義的低、中或者高密度基質。在雜交反應之前，可以先用前述方法對目標基因特異性的cDNAs進行擴增，以提高雜交的可能性。在雜交反應之前還可以先對目標基因特異性的cDNAs按照前述方法進行標記和/或剪切，如，在擴增反應中使用被標記的脫氧核苷三磷酸。剪切可以使用咪唑和氯化錳。目標基因特異性的cDNAs也可以在擴增步驟完成后再標記，比如，通過W0-A-91/19812描述的三明治雜交技術雜交一個標記的探針。另一個優選的標記和/或剪切核酸的方法如申請號:W099/65926，W001/44507, W001/44506, W002/090584或者W002/090319的專利申請文件所示。(3)檢測雜交反應的結果。檢測是通過將基質與帶有標簽的檢測探針混合后，檢測標簽發出的信號實現的，所述基質上帶有目標基因特異性的捕獲探針，該探針可以與目標基因特異性的cDNAs雜交。若之前已經對目標基因特異性的cDNAs進行標記，則直接檢測即可。
[0105]雜交檢測目標基因表達還可以使用如下方法:(1)同上述方法步驟(I )，提取全血的總RNA，逆轉錄得到該生物材料mRNAs的cDNAs。使用T7聚合酶，在啟動子的作用下，使cDNA的互補RNA發生聚合，得到以DNA為模版的互補RNA (cRNA)。得到包含目標基因特異性cRNAs與非目標基因特異性的cRNAs的混合物。(2)將cRNAs與固定了目標基因特異性的捕獲探針的基質混合，目標基因特異性的捕獲探針將與目標基因特異性的cRNAs發生雜交反應，而與非目標基因特異性的cRNAs不發生雜交反應。通過在基質上同時固定不同的捕獲探針(一個探針與一個目標基因對應)，可以同時檢測不同目標基因的表達水平。在雜交反應之前也可以先對目標基因特異性的cRNAs按照前述方法進行標記和/或剪切。(3)檢測雜交反應的結果。檢測是通過將基質與帶有標簽的檢測探針混合后，檢測標簽發出的信號實現的，所述基質上帶有目標基因特異性的捕獲探針，該探針可以與目標基因特異性的cRNAs雜交。若之前已經對目標基因特異性的cRNAs進行標記，則直接檢測即可。當基質上有大量探針時，cRNA的優勢尤其明顯。
[0106]本發明基因表達水平的檢測可以通過檢測多肽來實現。具體是將多肽與至少一種特定配體相結合。前述試劑為檢測所述基因編碼的多肽的量的試劑。
[0107]優選地，所述試劑為抗體或者親和性蛋白。
[0108]在本發明優選實施例中，是將表達的多肽與至少兩個特定配體結合。本發明特定配體可以是抗體或者名叫“NanofitinTM”的親和蛋白。
[0109]所述“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體和重組抗體，它們的制備方法是本領域公知常識。
[0110]本發明提供的試劑盒可以準確檢測待檢樣本患大腸癌的可能性，并且操作簡單，僅需血液檢查，患者依從性高，為臨床大腸癌的篩查提供了一種新的選擇，具有良好的工業應用前景。
[0111]顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0112]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發 明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0113]圖1 6個基因同時檢測的ROC曲線。
[0114]圖2測試集樣本的18個基因標志物的檢測結果。
[0115]圖3 18個基因同時檢測的ROC曲線。
【具體實施方式】
[0116]實施例1樣本采集
[0117]經過知情同意，外周血樣本來自于187例經過臨床病理診斷確診的大腸癌患者(CRC)和173例結腸鏡檢查陰性對照組患者(CNC)，采集于2006~2010年間。
[0118]CRC招募于中國復旦大學上海癌癥中心結直腸外科，均按照國際抗癌聯盟(UICC)建議的TNM分期系統進行分期。患者均未接受術前化療或者放療。患有遺傳性結直腸癌或炎癥性腸道疾病(Corhn病或潰瘍性結腸炎)的患者被排除在本發明之外。CNCs招募于上海社區醫院，通過結腸鏡檢查，沒有任何大腸癌或者息肉的癥狀。檢測樣本的人口特征和臨床特征如表1所示:
[0119]表1檢測樣本的特征
【權利要求】
1.一種大腸癌篩查試劑盒，其特征在于:它包括檢測如下18個基因中的任意一個或者多個基因的表達水平的相關試劑:DUSP2，如SEQ ID NO:1所示；NEATl，如SEQ ID NO: 2所示；MYBLl，如 SEQ ID NO: 3 或者 4 所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10，如SEQ ID NO: 7 或者 8 所示；GZMB，如 SEQ ID NO:9 所示；SH2D2A，如 SEQ ID N0:10、ll、12 或者 13 所示;PDE4D JBSEQ ID NO: 14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示;FAM198B，如 SEQID N0:23、24 或者 25所示;GLT25D2，如 SEQ ID N0:26所示;CD36，如 SEQ ID N0:27、28、29、30或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ ID NO:32 或者 33 所示；FKBP5，如 SEQ ID NO:34、35 或者36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO:37 所示；IL1B，如 SEQ ID NO:38 所示;DHRS13 JnSEQ IDNO:39 所示；PDZK1IP1，如 SEQ ID NO:40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO:41 所示； 還包括大腸癌陽性樣品和大腸癌陰性樣品。
2.根據權利要求1所述的篩查試劑盒，其特征在于:所述試劑為檢測所述基因轉錄的RNA，特別是mRNA的量的試劑。
3.根據權利要求2所述的篩查試劑盒，其特征在于:所述試劑為檢測與所述mRNA互補的cDNA的量的試劑。
4.根據權利要求3所述的篩查試劑盒，其特征在于:所述試劑為檢測與所述cDNA互補的cRNA的量的試劑。
5.根據權利要求2~4任意一項所述的篩查試劑盒，其特征在于:所述試劑為探針。
6.根據權利要求1所述的篩查試劑盒，其特征在于:所述試劑為檢測所述基因編碼的多肽的量的試劑。
7.根據權利要求6所`述的篩查試劑盒，其特征在于:所述試劑為抗體、抗體片段或者親和性蛋白。
8.如下18個基因中任意一個或者任意多個基因在制備大腸癌篩查試劑中的用途:DUSP2，如 SEQ ID ΝΟ:1 所示;NEAT1，如 SEQ ID NO:2 所示;MYBL1，如 SEQ ID NO:3 或者 4所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示;P2RY10,如 SEQ ID NO: 7 或者 8 所示;GZMB，如 SEQID NO:9 所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D JnSEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示；FAM198B,如 SEQ ID NO:23、24 或者 25 所示；GLT25D2,如 SEQ ID NO:26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ IDNO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JBSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ IDNO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示。
9.根據權利要求8所述的用途，其特征在于:所述試劑是檢測18個基因中的任意一個或者多個基因的表達水平的相關試劑。
10.根據權利要求8所述的用途，其特征在于:所述試劑包括大腸癌陽性樣品和大腸癌陰性樣品。
11.根據權利要求8所述的用途，其特征在于:所述試劑為檢測所述基因轉錄的RNA，特別是mRNA的量的試劑。
12.根據權利要求11所述的用途，其特征在于:所述試劑為檢測與所述mRNA互補的cDNA的量的試劑。
13.根據權利要求12所述的用途，其特征在于:所述試劑為檢測與所述cDNA互補的cRNA的量的試劑。
14.根據權利要求11~13任意一項所述用途，其特征在于:所述試劑為探針。
15.根據權利要求8所述的用途，其特征在于:所述試劑為檢測所述基因編碼的多肽的量的試劑。
16.根據權利要求15所述的用途，其特征在于:所述試劑為抗體或者親和性蛋白。
17.一種檢測人體樣本,特別是人血液樣本中基因表達的方法,包括:(1)測定受試者血樣的基因組中任意一個或者任意多個基因轉錄的RNA的水平，所述基因組包括如下基因:DUSP2 JBSEQ ID NO:1 所示;NEAT1 JnSEQ ID NO: 2 所示;MYBL1 JnSEQ ID NO: 3 或者4 所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示;P2RY10,如 SEQ ID NO: 7 或者 8 所示;GZMB，如SEQ ID N0:9K*;SH2D2AjnSEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D，如 SEQ ID NO: 14,15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示;FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT25D2,如 SEQ ID NO:26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ IDNO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JBSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ IDNO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示； (2)檢測受試者血樣中的基因表達。
18.根據權利要求17所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)是測定基因組中任意六個基因轉錄的RNA的水平。
19.根據權利要求18所述的方法，其特征在于:所述六個基因為NEAT1、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZK1TP1 和 VSIGlO。
20.根據權利要求17所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)是測定基因組中18個基因轉錄的RNA的水平。
21.根據權利要求17所述的方法，其特征在于:所述樣本是大腸癌陽性樣本。
22.根據權利要求17所述的方法，其特征在于:所述樣本是大腸癌陰性樣本。
23.根據權利要求17所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)使用至少一個寡核苷酸。
24.根據權利要求23所述的方法，其特征在于:其中，一個寡核苷酸僅與一個基因轉錄的RNA雜交，和/或可以與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交。
25.根據權利要求24所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)包括如下步驟: a、擴增所述基因轉錄的RNA，得擴增產物； b、使用至少一個引物檢測步驟a所得擴增產物的量。
26.根據權利要求25所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)包括如下步驟: i、用至少一個探針與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交，得雜交產物； ii、檢測步驟i所得雜交產物的量。
27.根據權利要求17所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)包括擴增所述基因轉錄的RNA的方法。
28.根據權利要求17所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)包括檢測所述基因轉錄的RNA互補的cDNA的量的方法。
29.根據權利要求17所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)至少使用一個探針。
30.根據權利要求17所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)至少使用一個引物。
31.一種寡核苷酸，它僅與一個基因轉錄的RNA雜交，和/或可以與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交，所述屬于一個基因組的基因由如下基因組成:DUSP2，如SEQ ID NO:1所示;NEAT1，如 SEQ ID NO: 2 所示;MYBL1，如 SEQ ID NO: 3 或者 4 所示；ITGAMjn SEQ IDN0:5 或者6所示；P2RY10，如 SEQ ID N0:7 或者8所示;GZMB，如 SEQ ID NO:9所示；SH2D2A，如SEQ ID N0:10、ll、12或者 13所示;PDE4D，如SEQ ID NO: 14、15、16、17、18、19、20、21 或者22 所示；FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24或者 25所示;GLT25D2，如 SEQ ID NO: 26所示；CD36，如 SEQ ID N0:27、28、29、30 或者 31 所示;NUDT16 JnSEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5，如SEQ ID N0:34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37 所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ IDN0:41所示。
32.根據權利要求31所述的寡核苷酸，其特征在于:其選自SEQID N0.42~77所示的核苷酸序列。
33.一種檢測人體樣本，特別是人血液樣本中基因表達的試劑盒，其特征在于:包括18個基因的18種表達產物的特異配偶體，每個配偶體與每個基因特定配合，所述18個基因如下所示:DUSP2，如 SEQ ID ΝΟ:1 所示;NEAT1 JnSEQ ID NO: 2 所示；MYBLl，如 SEQ ID NO: 3或者4所示；ITGAM，如SEQ ID NO:5或者6所示；P2RY10，如SEQ ID NO:7或者8所示；GZMB，如 SEQ ID NO: 9 所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D，如 SEQ IDN0:14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示;FAM198B，如 SEQ ID NO:23、24 或者 25 所示；GLT2OT2 JBSEQ ID NO: 26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JnSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQID NO:37 所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZK1IP1，如SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示。
34.根據權利要求33所述的試劑盒，其特征在于:所述特異配偶體是寡核苷酸，特別是探針和/或引物。
35.根據權利要求34所述的試劑盒，其特征在于:所述特異配偶體選自SEQIDN0.42~77所示的核苷酸序列的集合。
36.根據權利要求33所述的試劑盒，其特征在于:所述特異配偶體包含抗體和/或親和性蛋白。
37.通過血液樣本體外篩查人大腸癌患病風險的方法，其特征在于:它包括如下步驟: a)取血液樣本，檢測如下18個基因中任意一個或者任意多個基因的表達產物的量:DUSP2，如 SEQ ID ΝΟ:1 所示;NEAT1，如 SEQ ID NO:2 所示;MYBL1，如 SEQ ID NO:3 或者 4所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示;P2RY10,如 SEQ ID NO: 7 或者 8 所示;GZMB，如 SEQID NO:9 所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D JnSEQ ID NO:14、15、.16、17、18、19、20、21 或者 22 所示；FAM198B,如 SEQ ID NO:23、24 或者 25 所示；GLT25D2,如 SEQ ID NO:26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ IDNO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JBSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ IDNO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示； b)將步驟a)所得表達產物的量與大腸癌陽性樣品以及大腸癌陰性樣品的表達產物的量進行對比，所述大腸癌陽性樣品來自確診的大腸癌患者，所述大腸癌陰性樣品來自已證實的非大腸癌個體； C)根據步驟b)的分析結果作出判斷: 如果步驟a)所得表達產物的量與大腸癌陽性樣品的表達產物的量相近或相同，則診斷為大腸癌患者； 如果步驟a)所得表達產物的量與大腸癌陰性樣品的表達產物的量相近或相同，則診斷為非大腸癌患者。
38.根據權利要求37所述的方法，其特征在于:所述步驟a)是檢測18個基因中任意6個基因的表達產物的量。
39.根據權利要求38所述的方法，其特征在于:所述6個基因為NEATl、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZK1TP1 和 VSIGlO。
40.根據權利要求37所述的方法，其特征在于:所述步驟a)是檢測18個基因中每個基因的表達產物的量。
41.根據權利要求37所述的方法，其特征在于:所述步驟a)中，檢測至少一個基因的表達產物的量是將所述基因的表達產物與該表達產物的特異配偶體接觸。
42.根據權利要求37或者42所述的方法，其特征在于:步驟a)中，檢測基因的表達產物的量，所述基因的核酸序列選自SEQ ID NO:1~41所示序列集合。
43.根據權利要求37所述的方法，其特征在于:步驟a)所述表達產物包括至少一個RNA轉錄物或者一個多肽。
44.根據權利要求37所述的方法，其特征在于:所述表達產物包括至少一個mRNA。
45.根據權利要求43所述的方法，其特征在于:所述RNA轉錄物通過雜交、擴增或者測序的方法來檢測和定量。
46.根據權利要求42所述的方法，其特征在于:所述RNA轉錄物在預設條件下與至少一個探針和/或至少一個引物接觸，在預設條件下，所述探針和/或引物可以與RNA轉錄物雜父。
47.根據權利要求46所述的方法，其特征在于:與所述RNA轉錄物的cDNA在預設條件下與至少一個探針和/或至少一個引物接觸，在預設條件下，所述探針和/或引物可以與cDNA雜交。
48.根據權利要求43所述的方法，其特征在于:所述多肽的檢測是通過將多肽與至少一個特異配體接觸來檢測的，特別是與抗體或者親和性蛋白接觸。
49.根據權利要求48所述的方法，其特征在于:所述多肽與至少兩個特異配體接觸，特別是與兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白接觸。
50.一種通過血液樣本體外篩查人大腸癌患病風險的試劑盒，其特征在于:包括18個基因中任意一個或者任意多個基因的表達產物的特異配偶體，每個配偶體與每個基因特定配合，所述18個基因如下所示:DUSP2 JBSEQ ID NO:1所示;NEAT1 JnSEQ ID NO: 2所示;MYBLl，如 SEQ ID NO: 3 或者 4 所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示;P2RY10 JnSEQ IDNO:7或者8所示；GZMB，如 SEQ ID NO:9所示；SH2D2A，如SEQ ID NO: 10、11、12或者 13所示;PDE4D，如 SEQ ID NO: 14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示；FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、·24 或者 25 所示；GLT2OT2，如 SEQ ID NO: 26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者.31 所示;NUDT16，如 SEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5，如 SEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示;ITPRIPL2，如 SEQ ID NO:37所示；IL1B，如 SEQ ID N0:38所示;DHRS13，如 SEQ ID N0:39所示；PDZK1IP1，如 SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示； 所述特異配偶體與基因的表達產物特異結合； 所述18個基因的核酸序列選自SEQ ID N0:l~41所示序列的集合。
51.根據權利要求50所述的試劑盒，其特征在于:包括18個基因中任意六個基因的表達產物的特異配偶體。
52.根據權利要求51所述的試劑盒，其特征在于:所述六個基因為NEAT1、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZK1TP1 和 VSIGlO。
53.根據權利要求50所述的試劑盒，其特征在于:包括18個基因中每個基因的表達產物的特異配偶體。
54.根據權利要求50所述的試劑盒，其特征在于:所述特異配偶體包括至少一個雜交探針。
55.根據權利要求54所述的試劑盒，其特征在于:所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和至少一個引物。
56.根據權利要求55所述的試劑盒，其特征在于:所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和兩個引物。
57.根據權利要求50所述的試劑盒，其特征在于:所述特異配偶體包括至少一個特異配體，特別是抗體或者親和蛋白。
58.根據權利要求57所述的試劑盒，其特征在于:所述特異配偶體包括至少兩個特異配體，特別是兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白。
59.核酸序列如SEQID NO: 1-41所示的18個基因中任意一個或者任意多個基因的表達產物的特異配偶體在制備體外篩查大腸癌患病風險的試劑中的用途。
60.根據權利要求59所述的用途，其特征在于:所述特異配偶體是18個基因中任意6個基因的表達產物的特異配偶體。
61.根據權利要求60所述的用途，其特征在于:所述六個基因為NEAT1、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZK1TP1 和 VSIGlO。
62.根據權利要求59所述的用途，其特征在于:所述特異配偶體是18個基因中每個基因的表達產物的特異配偶體。
63.根據權利要求59所述的用途，其特征在于:所述特異配偶體包括至少一個雜交探針。
64.根據權利要求63所述的用途，其特征在于:所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和至少一個引物。
65.根據權利要求64所述的用途，其特征在于:所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和兩個引物。
66.根據權利要求59所述的用途，其特征在于:所述特異配偶體包括至少一個特異配體，特別是抗體或者親和蛋白。
67.根據權利要求66所述的用途，其特征在于:所述特異配偶體包括至少兩個特異配體，特別是兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白。
【文檔編號】C12N15/11GK103667437SQ201210361023
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月25日 優先權日:2012年9月25日
【發明者】葉迅, 孟夏, 徐清華, 劉芳, 吳非 申請人:生物梅里埃股份公司