專利名稱：：甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的分子標(biāo)記及制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于油菜育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及創(chuàng)造一種甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的分子標(biāo)記及制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自交不親和性是甘藍(lán)型油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的一種重要途徑。與甘藍(lán)型油菜當(dāng)前雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑一細(xì)胞質(zhì)雄性不育相比，自交不親和雜種具有選育周期短、恢復(fù)系多、無不良胞質(zhì)效應(yīng)、制種產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，近年來成為國(guó)內(nèi)外育種學(xué)家研究的熱點(diǎn)之一。自交不親和材料自交不能結(jié)實(shí)，目前缺乏大量繁殖自交不親和系的方法，因此限制了自交不親和雜種的生產(chǎn)和應(yīng)用。當(dāng)前，繁殖自交不親和系的方法主要有剝蕾授粉法、噴施鹽水法、電助授粉法、熱助授粉法、C02處理法等，但是這些方法費(fèi)工費(fèi)時(shí)成本高，效果不好。自交不親和保持系與自交不親和系雜交得到的Fi植株表現(xiàn)為自交不親和，可以繁殖自交不親和系。目前已篩選到雙低(低芥酸、低硫苷)的甘藍(lán)型油菜自交不親和系保持系，可以基本上解決甘藍(lán)型油菜自交不親和系難以大量繁殖的問題，但從經(jīng)濟(jì)性狀和生育期等方面考慮，這些保持系還不能直接用于雜種生產(chǎn)，需要進(jìn)行改良。甘藍(lán)型油菜自交不親和性的遺傳機(jī)制十分復(fù)雜，環(huán)境和外界因素影響較大，表現(xiàn)不穩(wěn)定。親和指數(shù)法是當(dāng)前鑒定親和性的常用方法，具有簡(jiǎn)單、方便、可大量操作等特點(diǎn)，但是容易受到環(huán)境條件影響，存在許多缺點(diǎn)。分子標(biāo)記輔助選擇是一種高效的育種方法，它可在任何生長(zhǎng)期進(jìn)行，不受環(huán)境條件影響，具有快速、經(jīng)濟(jì)，效率高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。在甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系改良過程中利用分子標(biāo)記技術(shù)與回交育種相結(jié)合，不但可以借助分子標(biāo)記對(duì)自交不親和基因型進(jìn)行直接而快速地選擇，以排除環(huán)境和外界因素的影響，同時(shí)對(duì)保持系背景進(jìn)行選擇，加快遺傳背景恢復(fù)速度，縮短育種年限。Zhang等(Zhang等，MolecularBreeding,DevelopmentofSCARmarkerslinkedtoself-incompatibilityinBraw'ca:wa戸sL.,2008，21:305-315)利用同源序列法發(fā)展了甘藍(lán)型油菜自交不親和系和甘藍(lán)型油菜自交不親和恢復(fù)系的SCAR分子標(biāo)記。迄今為止尚未見甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的分子標(biāo)記及制備方法與應(yīng)用的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于發(fā)展一種適用于甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的分子標(biāo)記，為甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的改良提供一種簡(jiǎn)單、快速和有效的方法。本發(fā)明的目的還包含利用本發(fā)明的分子標(biāo)記組裝一種鑒別甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的試劑盒。本發(fā)明是通過以下方案實(shí)現(xiàn)申請(qǐng)人通過試驗(yàn)獲得一種適用于甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。制備適用于甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR分子標(biāo)記的方法,按照以下步驟:利用報(bào)道的引物SPlla擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300和甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系04P63夕卜52基因組DNA，得到兩個(gè)DNA擴(kuò)增片段，然后對(duì)所述的DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，其中從S-1300中擴(kuò)增得到如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，從04P63夕卜52中擴(kuò)增得到如SEQIDNO:l所示的核苷酸序歹ll,在SEQIDNO:l的第174-175位，第287-295位堿基處分別有2bp禾H9bp的缺失突變；根據(jù)SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列差異設(shè)計(jì)引物SPllb，PCR擴(kuò)增，得到甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。在上述方法中，所用引物的核苷酸序列如下所示(1)SPlla:正向引物5'-CATAAGTCATGAGATATGCTAC-3'，反向引物5'-CCGTCGTATATTGCATAGAGTA-3'。(2)SPllb:正向引物5'-CAGAAGTCATGAGATATGCTAC-3'，反向引物5'-ATTAGTAACATTCGGTCCG-3'。一種適用于甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒含有以下組分1PCRBuffer;MgCl21.35慮；dNTPs0.08mM;TaqDNA聚合酶l線DNAlOOng;正反向引物各0.45ddH20補(bǔ)充至終體積20所述引物的核苷酸序列如下正向引物5'-CAGAAGTCATGAGATATGCTAC-3';反向引物5'-TAACATTCGGTCCGAAGTG-3'。更詳細(xì)的技術(shù)方案參見《具體實(shí)施方式》。本發(fā)明的積極效果本發(fā)明成功得到甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR分子標(biāo)記，運(yùn)用該標(biāo)記進(jìn)行甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的輔助選擇可以克服傳統(tǒng)育種中依靠表型進(jìn)行選擇的缺點(diǎn)，減少育種工作量，縮短育種年限，加快了改良甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的步伐。圖l:利用報(bào)道的引物SPlla和SRKa在甘藍(lán)型油菜品種S-1300和04P63外-52以及F,的基因組DNA中的擴(kuò)增結(jié)果。圖中P,代表S-1300;P2代表04P63外-52;F,代表S-1300x04P63外-52;M代表DNAmarker(片段大小依次為3000，2000，1000,750，500，250和濯bp)。圖2:利用報(bào)道的引物SPlla在S-1300和04P63外-52基因組中的擴(kuò)增的DNA片段序列比對(duì)，圖中三角形表示序列的第174-175bp和第287-295bp位堿基的缺失突變；設(shè)計(jì)的引物位置(即弓l物SPllb的反向引物的反向互補(bǔ)序列)參見下劃線處。圖3:本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物SPllb在甘藍(lán)型油菜品種S-1300和04P63外-52以及F,的基因組DNA中的擴(kuò)增結(jié)果。圖中Pi代表S-1300;P2代表04P63外-52;F!代表S-1300x04P63外-52;M代表DNAmarker(片段大小依次為3000，2000，1000，750，500，250和100bp)。圖4:本發(fā)明獲得的多重PCR標(biāo)記分析甘藍(lán)型油菜(S-1300x04P63外-52)F2群體的結(jié)果。圖中Pi代表S-1300;P2代表04P63外-52;F,代表S-1300x04P63外-52;5和14代表純合自交不親和單株；3，4，6，7，10和12代表純合自交親和單株；1，2，8，9，11和13代表雜合自交不親和單株；箭頭所示分子量大小。圖5:是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例l1、生產(chǎn)甘藍(lán)型油菜自交不親和雜種F！以甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300(見文獻(xiàn)馬朝芝等，甘藍(lán)型油菜雙低自交不親和系的選育，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，17(3):211-213)為母本，以甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系04P63外-52(該品系于2007年9月20日保藏在湖北省武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(英文簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:P200704，該品種的分類命名為5ra^/ca"a/n^)為父本進(jìn)行雜交，得到F!種子。2、篩選甘藍(lán)型油菜自交不親和分離群體將上述步驟得到的F,種子在自然條件下播種，得到甘藍(lán)型油菜自交不親和Fi植株。在Fj植株上剝蕾自交得到(S-1300x04P63外-52)F2種子，同時(shí)取Fj直株的花粉分別與上述步驟所述的甘藍(lán)型油菜的父母本回交，獲得兩份Bd種子。將獲得的3份種子(其中包括兩份Bd種子和1份F2種子)，在自然條件下種植，得到三個(gè)分離群體。共獲得(S-1300x04P63外-52)F2群體436個(gè)單株，(S-1300x04P63外-52)xS-1300群體116個(gè)單株，(S-1300x04P63外-52)x04P63外-52分132個(gè)單株。3、提取甘藍(lán)型油菜基因組DNA從上述步驟獲得的三個(gè)分離群體以及雙親(即上述步驟所述的甘藍(lán)型油菜自交不親和的父母本)的鮮嫩葉片中提取基因組DNA，具體制備方法參照李佳等(李佳等，一種有效提取油菜葉片總DNA的方法，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，13(5):521-523)報(bào)道的方法進(jìn)行，用0.8n/。的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)(型號(hào)PharmaciaBiotech,GeneQuantII)檢測(cè)DNA濃度。4、甘藍(lán)型油菜自交不親和表型的鑒定調(diào)査上述步驟中得到的三個(gè)甘藍(lán)型油菜分離群體的自交不親和表型，具體方法如下當(dāng)甘藍(lán)型油菜植株的主枝上有3~5朵花開放時(shí)，摘除主枝上已開放的花朵和花序中心的小蕾以限制主枝無限生長(zhǎng)，然后用硫酸鈉紙袋套住主枝和23個(gè)側(cè)枝，每隔一天把紙袋向上抽提，在抽提的過程中用手輕拍紙袋進(jìn)行人工輔助授粉。大約10天后，依結(jié)籽情況對(duì)甘藍(lán)型油菜植株的自交不親和性做出初步判斷。對(duì)初步判斷為自交不親和的單株要盡可能多的在側(cè)枝上進(jìn)行剝蕾自交以繁殖種子。油菜成熟收獲后，脫粒、考察套袋自交結(jié)實(shí)情況，按照公式計(jì)算親和指數(shù)親和指數(shù)=籽粒數(shù)/花朵數(shù)。參見李春艷等(李春艷等，甘藍(lán)型油菜自交不親和臨保性及其連鎖AFLP標(biāo)記，作物學(xué)報(bào)，2007，33(9):1452-1457)禾卩Zhang等(Zhang等，DevelopmentofSCARmarkerslinkedtoself-incompatibilityin5ra肌,ca"a/wsL，MolecularBreeding,2008，21:305-315)對(duì)甘藍(lán)型油菜親和指數(shù)的分類標(biāo)準(zhǔn)，以指數(shù)2為標(biāo)準(zhǔn)，凡親和指數(shù)<2的單株定為自交不親和，親和指數(shù)^的單株定為自交親和。調(diào)査的3個(gè)甘藍(lán)型油菜分離群體中自交不親和的表型分離結(jié)果見表1。對(duì)甘藍(lán)型油菜自交不親和的表型分離數(shù)據(jù)進(jìn)行適合性(x2)測(cè)驗(yàn)，測(cè)驗(yàn)方法參見南京農(nóng)業(yè)大學(xué)主編，田間試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)方法，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1985，第二版。其結(jié)果是，(S-1300x04P63外-52)F2群體共獲得436個(gè)單株，包括331個(gè)自交不親和單株和105個(gè)自交親和單株，自交不親和與自交親和的比值符合3:1的分離比例。(S-1300x04P63夕卜-52)xS-1300群體中，全部116個(gè)單株的親和指數(shù)都小于2，表現(xiàn)為自交不親和。(S-1300x04P63外-52)x04P63外-52群體有132個(gè)單株，包括63個(gè)自交不親和單株和69個(gè)自交親和單株，自交不親和與自交親和的比值符合l:l的分離比例。這些數(shù)據(jù)說明甘藍(lán)型油菜自交不親和的表型分離受單個(gè)遺傳位點(diǎn)控制，自交不親和性對(duì)自交親和性為顯性。為了便于本發(fā)明的描述，將甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300中控制自交不親和表型的顯性遺傳位點(diǎn)命名為A，基因型為AA。甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系04P63外-52控制自交不親和表型的隱性遺傳位點(diǎn)命名為a，基因型為aa。F,植株具有雜合位點(diǎn)，基因型為Aa，表現(xiàn)為自交不親和。根據(jù)該命名，分離群體中純合自交不親和單株基因型為AA，雜合自交不親和單株基因型為Aa，純合親和單株基因型為aa。表1是本發(fā)明中3個(gè)甘藍(lán)型自交不親和油菜分離群體的自交不親和的表型分離結(jié)果。表1本發(fā)明中3個(gè)甘藍(lán)型自交不親和油菜分離群體的自交不親和的表型分離分離群體總株數(shù)自交不親和自交親和期望比值P值(S-1300x04P63夕卜52)F24363311053:10.150.50-0.75(S-1300x04P63外-52)xS-13001161160h001(S-1300x04P63夕卜52)xQ4P63外-5213263691:10.190.50-0.755、利用報(bào)道的引物SPlla和SRKa擴(kuò)增分析雙親和F,的基因組DNA禾U用Zhang等(Zhang等，DevelopmentofSCARmarkerslinkedtoself-incompatibilityinBra柳'cana/wsL，MolecularBreeding,2008，21:305-315)發(fā)展的引物SPlla和SRKa(引物序列見表2)來擴(kuò)增分析甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300、甘藍(lán)型油菜自交不親保持系04P63夕卜-52和Fj的基因組DNA。PCR反應(yīng)體系如下lxPCRbuffer,1.35mMMgCl2，0.08mMdNTPs，l.OUTaqDNA聚合酶(四者均購自MBIFermentas，L池uania公司)，100ngDNA，正、反向引物各0.45^M，ddH20補(bǔ)充至終體積20^。熱循環(huán)參數(shù)為94。C3min;94°C30sec，復(fù)性溫度45。Csec，72°C60see,38個(gè)循環(huán)；72。C10min，l個(gè)循環(huán)；4。C保存，反應(yīng)是在PTC-225PCR儀上完成。三個(gè)材料均進(jìn)行兩次重復(fù)。擴(kuò)增產(chǎn)物在水平電泳槽上1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用lxTAE緩沖液(0.04MTris國(guó)acetate，0.001MEDTA，pH8.0)，電壓3V/cm，電泳1.5h左右。電泳完畢，凝膠成像系統(tǒng)(UVP)拍照保存。本發(fā)明中引物SPlla在雙親和Fi的基因組DNA中擴(kuò)增產(chǎn)物均為430bp左右的單一亮帶，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段長(zhǎng)度無差異(見圖l)。引物SRKa在S-1300和Ft的基因組DNA中擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA片段即1058bp,但在04P63外-52的基因組DNA中無擴(kuò)增產(chǎn)物。表2本發(fā)明中使用的引物DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>6、回收、克隆、測(cè)序引物SPlla在雙親中擴(kuò)增的DNA片段回收上述步驟中獲得的引物SPlla在甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300、甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系04P63外-52中擴(kuò)增的DNA片段。操作程序按UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(購自上海生物工程公司)說明書提供的方法用刀片從1.2%的瓊脂糖膠上挖出擴(kuò)增的DNA片段，放入1.5ml的離心管，加入BingBufferII，置于50-60'C水浴中加熱10min，每隔2min混勻一次；將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移至套在收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，室溫放置2min，8,000rpm離心1min;倒掉收集管中的廢液，加入500WashSolution,8,000rpm室溫離心lmin，此步驟重復(fù)一次；倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，12,000rpm離心15sec;將UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml的離心管中，在柱子膜中央加30^ElutionBuffer,室溫放置2min;12,000rpm離心1min，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20'C備用。取上述回收的目標(biāo)DNA片段2pi作模板，用引物SPlla按照上述步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1.2%的瓊脂糖膠檢測(cè)擴(kuò)增的DNA片段。如果擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度與上述步驟中擴(kuò)增的結(jié)果不相同，需要重新擴(kuò)增回收；如果擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度與上述步驟中擴(kuò)增的結(jié)果相同，說明回收得到的DNA片段即是目標(biāo)DNA片段，可用于下一步的T-A克隆。將回收的目標(biāo)DNA片段連接在pMDT-18載體上(該載體購自TaKaRa公司，大連寶生物公司代理)。操作程序按該試劑盒說明書提供的方法試劑在使用前先短暫離心將其收集在管底部；在0.5ml的離心管中進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)體系為DNA2.0nl，pMDT-18載體0.5Hl和SolutionI2.5^。用移液管來回吸幾次混勻，置4。C冰箱進(jìn)行過夜連接反應(yīng)；準(zhǔn)備LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基(含100mg/ml氨芐青霉素，24mg/ml的異丙基-硫代p-D-半乳糖苷和20mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-半乳糖苷)；從-7(TC冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞放在冰上待它慢慢解凍(大約5min);離心收集連接反應(yīng)液，取2pl反應(yīng)液加入到一個(gè)己經(jīng)滅菌的1.5ml離心管(放在冰上預(yù)冷)；用手指輕彈裝有感受態(tài)細(xì)胞的管底以混勻，取50nl感受態(tài)細(xì)胞加入裝有2[il連接反應(yīng)液的1.5ml離心管，用手指輕彈混勻，放在冰上20min;在42°C水浴中熱激90sec(勿搖動(dòng))，然后在冰上放置2min;加500pl的LB液體培養(yǎng)基后在37°C振蕩培養(yǎng)1.5h(150rmp/min);吸取振蕩培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化液100pl涂在無菌的LB固體培養(yǎng)基上，在37'C放置16-24h;進(jìn)行藍(lán)、白斑篩選，挑選12個(gè)陽性克隆進(jìn)行編號(hào)，并在無菌的液體LB培養(yǎng)基(含50ug/ml的氨芐青霉素)振蕩培養(yǎng)16-24h;取振蕩培養(yǎng)后的菌液2pl作PCR模板，用Ml3作引物(正向引物5'-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3';反向引物5'-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3')擴(kuò)增，PCR反應(yīng)如上述步驟所述。擴(kuò)增結(jié)果在1.2%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)。如果所得的DNA片段比目標(biāo)DNA片段大200bp左右，說明轉(zhuǎn)化成功，選3份轉(zhuǎn)化成功的菌液各吸取300nl送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。剩余200pl渾濁菌液加200pl50%無菌的甘油在1.5ml無菌的離心管中于-70T編號(hào)保存。本發(fā)明中，弓l物SPlla在S-1300和04P63外-52中的擴(kuò)增片段各3次重復(fù)測(cè)序，序列結(jié)果一致。引物SPlla在S-1300中的擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)435bp，與Zhang等(Zhang等，DevelopmentofSCARmarkerslinkedtoself-incompatibilityin5ros57'cawapwsL,MolecularBreeding,2008，21:305-315)克隆的該片段核苷酸序列完全相同，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。引物SPlla在04P63外-52中的擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度為424bp，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。7、制備甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的SCAR標(biāo)記對(duì)上述步驟得到的引物SPlla在S-1300和04P63外-52中的DNA片段用報(bào)道的ClustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，除部分單堿基差異外，04P63外-52中的DNA片段在第174-175bp位堿基有一個(gè)2bp的缺失突變，缺失堿基是TA，在第287-295bp位堿基有一個(gè)9bp的缺失突變，缺失堿基為AAGTTGAGG(見圖2)。根據(jù)引物SPlla在04P63夕卜52中擴(kuò)增DNA片段的核苷酸序列(如序列表SEQIDNO:1所示)，禾U用報(bào)道的Primer3軟件(http:〃redb.croplab.org/modules/redbtools/primer3.php)，在序列SEQIDNO:1中的第277-305bp之間的位置設(shè)計(jì)一條反向引物。設(shè)計(jì)時(shí)要求引物長(zhǎng)度為1722bp,復(fù)性溫度5562。C，GC含量為4050%。篩選得到一條目標(biāo)引物(序列見表2中SPllb的反向引物，位置見圖2中下劃線所示)，引物長(zhǎng)度為19bp，復(fù)性溫度為60'C，GC含量為45W。將該引物與SPlla的正向引物相結(jié)合，并將其命名為SPllb,預(yù)期在甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系04P63外-52的基因組DNA中擴(kuò)增出303bp的片段，而在甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300的基因組DNA中無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明利用上述步驟設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系同上所述，復(fù)性溫度6(TC。擴(kuò)增結(jié)果在1.2%的瓊脂糖膠上檢測(cè)。該引物在甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系04P63外-52和F！的基因組DNA中擴(kuò)出303bp的目標(biāo)片段，而在甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300的基因組DNA中無任何擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖3)，因此該擴(kuò)增片段可作為甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR分子標(biāo)記。8、甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證利用上述步驟得到的甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的SCAR標(biāo)記分析本發(fā)明中的三個(gè)分離群體(見表3)。在(S-1300x04P63外-52)F2群體中，所有105個(gè)自交親和單株和219個(gè)自交不親和單株出現(xiàn)與04P63外-52—樣的303bp的DNA片段，112個(gè)自交不親和單株與自交不親和系S-1300—樣無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。在(S-1300x04P63外-52)xS-1300群體中，54個(gè)自交不親和單株出現(xiàn)與04P63外-52—樣的DNA片段，而62個(gè)單株無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。在(S-1300x04P63夕卜52)x()4P63外-52群體中，所有單株都出現(xiàn)04P63外-52—樣的擴(kuò)增片段，包括63個(gè)自交不親和單株和69個(gè)自交親和單株。這些數(shù)據(jù)說明該標(biāo)記是與甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系共分離的，本發(fā)明對(duì)該標(biāo)記又做了更進(jìn)一步的驗(yàn)證。表3本發(fā)明的顯性SCAR標(biāo)記在三個(gè)甘藍(lán)型油菜自交不親和分離群體中的分析分離群體總株數(shù)自交不親和單株自交親和單株-++(S-1300x04P63外-52)F2436112219105(S-1300x04P63外-52)xS-130011662540(S-1300x04P63外-52)xQ4P63外-5213206369說明表3中的"+"表示具有與04P63外-52—樣的擴(kuò)增片段的單株。將上述步驟中獲得的甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR標(biāo)記SPllb與甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300的顯性SCAR標(biāo)記SRKa結(jié)合，來發(fā)展同時(shí)區(qū)分三種基因型的多重PCR標(biāo)記。具體操作如下在同一PCR反應(yīng)體系中，以100ngDNA為模板，lxPCRbuffer，1.35mmol/LMgCl2，0.08mmol/LdNTPs，1.0UTaqDNA聚合酶(四者均購自MBIFermentas，Lithuania公司)，SCAR引物SPllb正反向引物各0.30pmol/L，SCAR引物SRKa的正反向引物各0.45pmol/L，ddH20補(bǔ)充至終體積20nl。熱循環(huán)參數(shù)為94°C3min;94°C30s，59°Clmin，72°C90s，35個(gè)循環(huán)；72°C10min，1個(gè)循環(huán)；4。C保存。該多重PCR標(biāo)記能夠同時(shí)區(qū)分三種基因型純合自交不親和基因型(AA)，雜合自交不親和基因型(Aa)以及純合自交親和基因型(aa)，本發(fā)明的效果見圖4所示。用該多重PCR標(biāo)記分析三個(gè)分離群體中各個(gè)單株的基因型，并驗(yàn)證與上述步驟中調(diào)查的自交不親和表型是否吻合。根據(jù)多重PCR擴(kuò)增結(jié)果，凡是出現(xiàn)與母本S-1300—樣的單一帶型的單株，判定其基因型為AA，表現(xiàn)型為自交不親和；凡是出現(xiàn)與04P63外-52—樣的單一帶型的單株，判定其基因型為aa，表現(xiàn)型為自交親和；凡是出現(xiàn)與F1—樣的兩條帶型的單株，判定其有基因型為Aa，表現(xiàn)型為自交不親和。結(jié)果發(fā)現(xiàn)根據(jù)多重PCR結(jié)果推測(cè)的基因型和調(diào)査的自交不親和表現(xiàn)型完全吻合，說明本發(fā)明獲得了用于輔助選擇甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR分子標(biāo)記。表4本發(fā)明中三個(gè)甘藍(lán)型油菜自交不親和分離群體中的基因型和基因頻率基因型頻率基因頻率分離群體個(gè)數(shù)AAAaaaAa(S-畫x04P63夕卜52)F24360.260.500.240.510.49(S-1300x04P63外-52)xS-13001160.530.4700.770.23(S-1300x04P63外-52)x04P63外-5213200.480.520.240.76SEQUENCELISTING〈110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的分子標(biāo)記及制備方法與應(yīng)用〈130〉〈141〉2008-03-28<歸3〈170〉Patentlnversion3.1<210>1〈211〉424〈212〉腿〈213〉甘藍(lán)型油菜(Brassica卿us)〈220〉<221〉gene〈222〉(1)..(424)<223>〈220〉<221>primer—bind〈222〉(1)..(22)〈223〉〈220>〈221>primer—bind〈222〉(403)(424)〈223〉<220>〈221>mutation〈222〉(287)..(295)〈223>〈220〉<221>mutation〈222>(174)..(175)〈223>〈400>1cagaagtcatgagatatgctacttctatattttttttttt犯caaagatacactacttgt60gtttcatatttttgactttgacatctgttcaaggta3actatatc犯t犯cttttcccct120cttattgacgatttaggatttttcttacccaattgcaattcataattttttttattt犯a180gC3Ct3g3tgtgggagctaggaactgccctgaaggcatcgccaaatcg犯tgatgtcata240gg犯cstgcttaaataccaagagcsg卿ctgtcaaaaacacttcggaccgaatgttact300aattgcctttgttatccttttagcacgcataatcgtgtgaggattacttgctactgttgc360aaagttaaatcataattgatca^cg3犯C8tccagatacgattactctatgcaatatacg4203Cgg424〈210〉2〈211〉435〈212>廳〈213>甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)〈220〉<221〉gene<222>(1)..(435)<223>〈220〉<221〉'primer_bind<222>(414)..(435)〈223〉<220〉<221〉primer—bind<222>(1)..(22)<223>〈400>2cagaeigtca/tgagatatgctacttctatatatacatttttaacaaatatacactacttat60gtttcatatttttgattttgacatatgttcaaggtaaactatatcaataactttccccct120tttatggacgcttt鄉(xiāng)atttttcttacctaattgcaattcataattttttgttaatttaaagcact卿tgtgggagcttggaaatgccctgaaggcatcgtctatccgagtcctatctca_ggaaggtgcattasttccagg3gcax;3gagtgtaaaasscactstgaagttgagggacagaatgttactaattgccgttgtgatacttatagcatgcaaaatcctgcgaggattacttgctactgttgcaaagttaaatcataattgatcaacgaaacatccagagacggttactctatgcaatatacgacgg<210〉3303DNA甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)<211>〈212〉〈213〉<220〉〈221〉〈222〉〈223〉<220>〈221〉〈222〉<223>〈220〉〈221><222><223>〈400〉primer—bind(l)..(22)(l)..(303)primer—bind(285)..(303)3cagaagtcatgagatatgctgtttcatatttttgactttgcttattgacgatttaggattgcact卿tgtgggagctagggaacatgcttaaataccaa33tEicttctatatttttttttttaacaaagatacactacttgtacatctgttcaaggtaaactatatcaataacttttccccttttcttacccaattgcaattcataattttttttatttaaagaactgccctgaaggcatcgccaaatcgaatgatgtcatagagcagagactgtcaaaaacacttcggaccgaatgttact1802403003604204356012018024030030權(quán)利要求1、一種適用于甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO3所示。2、用于擴(kuò)增權(quán)利要求l所述分子標(biāo)記的特異引物SPllb，它的核苷酸序列如下-正向引物5'-CAGAAGTCATGAGATATGCTAC-3';反向引物5'-TAACATTCGGTCCGAAGTG-3'。3、一種甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系顯性SCAR分子標(biāo)記的制備方法，按照以下步驟利用報(bào)道的引物SPlla擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300和甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系04P63外-52基因組DNA，得到兩個(gè)DNA擴(kuò)增片段，然后對(duì)所述的DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，其中從S-1300中擴(kuò)增得到如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，從04P63夕卜52中擴(kuò)增得到如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，在SEQIDNO:1的第174-175位，第287-295位堿基處分別有2bp和9bp的缺失突變；根據(jù)SEQIDNO:l禾口SEQIDNO:2所示的核苷酸序列差異設(shè)計(jì)引物SPUb，PCR擴(kuò)增，得到甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。4、一種適用于甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系檢測(cè)的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有以下組分1PCRBuffer;MgCl21.35mM;dNTPs0.08mM;TaqDNA聚合酶1.0U;DNAlOOng;正反向引物各0.45pM;ddH20補(bǔ)充至終體積20nl;所述引物的核苷酸序列如下正向引物5'-CAGAAGTCATGAGATATGCTAC-3';反向引物5'-TAACATTCGGTCCGAAGTG-3'。5、權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系輔助選擇中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于油菜育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR分子標(biāo)記。其特征是，利用報(bào)道的引物SP11a擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300和甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系04P63外-52的基因組DNA，分別得到一個(gè)擴(kuò)增的DNA片段，然后對(duì)所擴(kuò)增的兩個(gè)DNA片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，根據(jù)序列的差異設(shè)計(jì)引物SP11b，PCR擴(kuò)增，得到甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系的顯性SCAR分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO3所示。本發(fā)明還公開了制備所述分子標(biāo)記的方法及應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N15/11GK101250524SQ20081004723公開日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年4月7日優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日發(fā)明者維唐,唐家友,張幸果,馬朝芝,高長(zhǎng)斌申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)