專利名稱：：與豬生長速度相關分子標記克隆及應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于豬的分子標記輔助選擇
技術領域：
，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇的與生長速度相關的分子標記的克隆及應用，該分子標記與C0戶5/基因有關，利用本發明克隆的分子標記對豬生長速度相關的性狀進行關聯分析。
背景技術：
：20世紀80年代以來，分子標記研究取得飛速發展，形成了以分子標記為核心的分子標記輔助選擇和滲入等分子育種技術，這些技術與常規育種方法相結合，大大提高了豬的育種效率。能夠應用于分子標記輔助選擇的基因或標記必須對目標性狀具有較大的遺傳貢獻，即主效基因或標記，因此尋找這些主效基因和與之連鎖的分子標記成為分子標記輔助選擇的前提和基礎，也是當前和今后一段時間豬分子生物學領域的研究重點和急需解決的問題。目前已有多個與生長性狀和胴體性狀緊密連鎖的功能基因分子標記被發現并申請專利1)Lin等檢測到熱應激蛋白70.2(Zu;p7a2)5'側翼區域的多態能提高豬的生產性能，該基因已被申請專利(專利號為US，US2003104392-A1);2)Rothschild等發現C4Sr基因的作用并在豬生長和肉質性狀改良中進行標記輔助選擇應用(專利號US，WO2003060151-A2);3)Rothschild等檢測了與肌肉生長和肉質性狀相關的C/Qlf，5tW4a/p/w，")i/a/pAa三個基因的變異，為育種提供了分子標記(專利號US，WO2004081194-A2);4)Rothschild等發現豬黑皮質素-4受體(ATC^)基因與生長速度、脂肪含量和飼料消耗相關(專利號US，WO200175161-A2);5)Rothschild等還揭示了i/JWG^可用作動物生長、脂肪量、肉質和飼料消耗比的遺傳標記(專利號CN,03806119.8);6)Greger等發現基因與生長和繁殖性狀相關(專利號US，WO200069882);7)Hiendleder等建立了與生長、繁殖和胴體性狀相關的/iVK4和/AWA4基因多態的檢測方法(專利號DE,DE10121225-A1);8)Gerbens等發現/W545尸基因的多態與生產性能(體重、肌內脂肪)相關(專利號EP，W09735878-A);9)Kojima等發現;7丄五Pi基因的多態能提高豬的遺傳性狀和肉的產量(專利號US，WO2005017204-A2);10)李奎等公開了一種豬生產性狀相關蛋白及其編碼基因及其應用(專利號CN，200610066856.4);11)李奎等發現了基因的變異與生長速度和免疫性狀之間的相關(專利號CN，200410096857.4)。豬經濟性狀的遺傳基礎十分復雜，雖然國際上動物遺傳育種領域的科學家和研究人員己經開展了大量的研究工作，但功能基因的鑒定及能用于育種實踐的分子標記還十分有限；同時在國際上正在開展基因產權爭奪戰，一些重要基因已經被國外同行申請了專利，為了使我國寶貴的基因資源手得到保護，需要加快功能基因鑒定和分子標記的研究速度。本實驗室處于上述的研究目的開展豬經濟性狀候選基因的分離、定位、SNP篩査與檢測及與性狀的關聯分析工作。本專利中目的基因的研究進展CO戶57(coatomerproteincomplex^subunitbeta1)基因編碼外被體蛋白復合體亞基。目前己有小鼠和大鼠C0尸5/基因組織結構、表達和功能研究報道。人CO尸5/基因定位在11p15，編碼953個氨基酸。小鼠CO/W基因位于7號染色體53.3cM,，cDNA全長為3173bp，編碼953個氨基酸。人，小鼠，大鼠CO尸5/基因都編碼953個氨基酸，且序列高度保守。CO/^7基因在小鼠的心、肝、脾、肺、腎中都有表達。目前對該基因的研究主要表現在1994年，人們發現C0尸5/基因是維持酵母細胞活力所必需的，它的突變可導致其運輸某些蛋白質到內質網的能力發生缺陷(Letourneur等，Coatomerisessentialforretrievalofdilysine-taggedproteinstotheendoplasmicreticulum.Cell1994，79:1199-1207)。2000年，人們揭示CO尸丑7基因可能是ruby-eye-2(ru2)的候選基因，而ru2是人Hermansky-PudlakSyndrome(HPS)小鼠模型之一(Wei等，cDNAsequenceandmappingofthemousecopbgeneencodingthebetasubunitoftheCOPIcoatomercomplex.SomatCellMolGenet,1999，25:177-183)。Opioidreceptor(KOR)mRNA的轉運需要CO尸5/基因的參與，并且CO尸貝基因促進胞體和軸突翻譯/formRNA(Jing等，Copb1-facilitatedaxonaltransportandtranslationofkappaopioid-receptormRNA.ProcNatlAcadSciUSA,2007，104:13810-13815)。通過以上資料我們可以得出C0尸5/基因在蛋白質轉運中發揮重要作用。但是其功能研究還不是很透徹，而且目前國內外對豬CO/，57基因的研究還是空白。尋找基因中的變異位點，通過與性狀間的關聯分析發現基因與性狀間的關系是研究基因功能的一個重要手段，也是進行標記輔助選擇的基礎。為此開展了豬COi^J基因的克隆、定位和SNP檢測及與性狀關聯分析。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術缺陷，克隆一種作為豬標記輔助選擇的與生長速度相關的分子標記，并將該分子標記作為豬的標記輔助選擇的應用。本發明通過以下技術方案實現申請人從豬CO尸5J基因片段中克隆得到一種作為豬標記輔助選擇的與生長速度相關的分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。在SEQIDNO:1所示序列的第744位堿基處有一個C744-T744的堿基突變，導致RsaI-RFLP多態性。其中用于檢測SEQIDNO:1所示序列的第744位堿基處有一個C744-T744的堿基突變的引物對的DNA序列如下所示正向5，-GGGCTTACTGGACTCCAACAT-3'，反向5'-TGGTCTTGATACATGTGTGAAACA陽3'。制備上述分子標記的方法，按照以下步驟從豬血液基因組中提取DNA，用人COPB1基因cDNA為信息探針,作同源序列篩選，獲得同源性80%以上的表達序列標簽(EST);然后拼接豬EST-重疊群，設計引物擴增中間未知片段，PCR產物純化，克隆，測序，獲得如序列表SEQIDNO:l所述的DNA序列.申請人將上述克隆的分子標記成功地應用于與豬生長速度相關性狀標記輔助選擇的關聯分析上，從而完成了本發明。序列表SEQIDNO:1是本發明克隆的豬COPB1基因的DNA片段；圖1:是本發明CO/>5/基因制備的流程圖2:是本發明中豬C0尸5/基因用于克隆的DNA片段。所用的引物序列用下劃線標注；圖3:是本發明中豬CO尸5/基因用于定位的DNA片段。所用的引物序列用下劃線標注；圖4:是本發明中豬COP5/基因用于定位的DNA片段。所用的引物序列用下劃線標注；圖5:是本發明中豬C0P5/基因用于PCR-RFLP檢測的DNA片段。所用的引物序列用下劃線標注；圖6:是本發明中豬CO尸5/基因&al-RFLP的三種基因型(CCCTTT)電泳結果。圖中M:DNA分子量標準(100bpladder)。具體實施例方式實施例1、C0P5/基因的克隆1、引物設計用人CO/，W基因cDNA(GenBank收錄號NMJ)16451)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數據庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為80%以上的ESTs(片段長度大于100bp),將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ(http:〃www.ncbi.nlm.nih.goWWeb/Search/index.htral)查詢相應序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序構建豬EST-重疊群。根據EST拼接序列設計一對引物P卜CF和P1-CR，序列如下CQm:P-CF-GCACTTTCTGGTTATTGTGGCT-3'P-CR5'-TGGTCTTGATACATGTGTGAAACA-3'2、PCR產物的純化、克隆和測序PCR產物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，于70'C溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產物純化試劑盒(購QPromega公司)純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是在每300pl融化的凝膠中加入1mlResin,混勻20s,將Resin/DNA混合物裝入注射器，使漿液通過Minicolumn擠出。再在注射器中加入80%的異丙醇2ml，輕推活塞使異丙醇通過Minicolumn擠出，取下Minicolumn裝入1.5mlEpendorff管中，lO，OOOg離心2min以干燥Resin，將Minicolumn裝入另一個干凈的1.5mlEpendorff管中，加入30~50pl滅菌水，靜置lmin，10,000g離心20s，以洗脫DNA存于Ependorff管中。連接反應:將純化的PCR產物與pGEM-T載體連接，連接反應總體積是5pl，其中包括2.5nl2xbuffer，0.5nl的T載體(購自Promega公司)，0.5的純化PCR產物，0.5的T4連接酶，最后加入1pl滅菌水置4'C水浴過夜。感受態細胞的制備從37。C培養了16~20h的新鮮平板上挑取一個DH5a單菌落接種于2mlLB中，于37'C振蕩培養3h，轉接1ml菌液于含有30mlLB的鹽水瓶中，繼續在37'C振蕩培養約4h，待OD600達到0.30.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10-15min，然后將菌液轉入離心管中于4°C4，000g離心10min以收集細胞，將離心管倒置以棄凈培養液，用10ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復4°C4，000g離心10min—次，用4ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4'C保存備用。轉化無菌狀態下取100~120pl感受態細胞于1.5mlEpendorff管中，將5pl的連接產物加入混勻，在冰上放置30min,42°C熱激卯s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴34min，加入400nl無抗生素的LB液體培養基，37。C振蕩培養45min。取100pl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Is叩ropy他io-e-D-galactoside，中文名稱為異丙基硫代—0-D—半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37。C平放1h后倒置培養。質粒的小量制備挑取平板上的單菌落，接種于2—3mlLB中，37'C300r/min培養過夜。用1.5mlEP管12000r/min離心數秒收集菌體。每管加入用冰預冷的溶液I[50mM葡萄糖,25mMTris.Cl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)]，渦旋振蕩至菌體充分懸浮。加入新配制的溶液II200pl，快速顛倒混勻，冰浴5min，然后加入預冷的溶液III[5M乙酸鉀，冰乙酸11.5ml，H2028.5ml]150^1，混勻后冰浴5min，12000r/min離心5min，將上清轉至另一EP管中，加入苯酚氯仿異戊醇500nl，渦旋振蕩，離心后小心吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，—2(TC沉淀30min，12000r/min離心5min，沉淀用70%乙醇洗滌2次，抽干，加入含有RNA酶的TE2(Hxl。重組質粒的酶切鑒定取3W質粒DNA與適量的雙蒸水混勻，使其總體積為15pl，加入2—3U限制性內酶EcoRI及2^1相應的10X限制性內切酶反應緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置37'C水浴1—2小時，取2—3jil反應液于瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切結果與預計完全相同者，即為目的重組質粒。重組質粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上進行測序，序列測定由北京奧科生物技術有限公司完成。用GeneTooll.O軟件中的ASSEMBLY程序進行拼接，得到一條長度為919bp的DNA序列(見SEQIDNO:1所述)。DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov)網站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數據庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。檢索結果表明所測序列與人CO尸S7基因DNA(GenBank收錄號NC_000011)的部分序列同源性達77。/。。實施例2、COPS/基因的定位1、用于基因定位的引物序列CO，P-MF5'-GTGTTTTGTGCATTGGAAGCA國3'P-MR-ACCACATCAACCATGAAACCA-3z該引物擴增片段長度為285bp。2、用于基因定位的實驗材料用法國Minnesota大學構建的豬輻射雜種板(INRA-Minnesotaporcineradiationhybridpanel,IMpRH)進行染色體精確定位，該雜種板由法國MartinYote博士(丄a6orato!'recfeGe>je!々weCe///c>e,INRA,Castanet-Tolosan,France)翻曾。IMpRH使用的輻射劑量是7,000-rad。IMpRH包括118個豬x倉鼠輻射雜種細胞系，以及倉鼠和豬基因組DNA陽性對照，用757個標記的鑒定結果表明IMpRH中的平均標記存留率為29.3%,包含有128個連鎖群，覆蓋了18對常染色體及X染色體，用于估計標記間距離的kb/cR比值是70kb/cR(lRay爿00cR),理論分辨率是145kb。各細胞系中所包含的豬染色體及染色體片段信息可從WWW(http:〃www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)獲得。3、PCR分型條件進行擴增的PCR反應總體積為10pi,其中模板DNA為20ng，含1Xbuffer(Promega),1.5mmol/LMgCl2，dNTP終濃度為150pmol/L，引物終濃度為0.4pmol/L，2UTaqDNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是94°C3min,循環35次94°C30s,62°C30s，然后72。C20s，最后72°C延伸5min。PCR反應產物用2%瓊月旨糖凝膠電泳檢觀lJ。IMpRH分型結果是0000010000010000100001000011010010000000100001000010010001011100000100001001001101000010000000010001010110110011011110(其中0和1分別表述擴增結果為陰性和陽性)。將以上的檢測結果提交網站(http:〃www.toulouse.inra.fr/kc/lgc.html"統計分析結果，CO尸S7基丙與豬2號染色體上的基因/T/O緊密連鎖，LOD值為17.51,RH圖距是0.2Ray。實施例3、PCR-RFLP診斷方法的建立1、引物序列C0尸5/P-SF5'-GGGCTTACTGGACTCCAACAT-3'P-SR5'-TGGTCTTGA丁ACATGTGTGAAACA-3'2、PCR擴增條件PCR反應總體積20pl，其中豬基因組DNA約100ng，含IXbuffer(Promega),1.5翻ol/LMgCl2，dNTP終濃度為150pmol/L,引物終濃度為0.4nmol/L,2Ur叫DNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是94。C3min，循環35次94°C30s，59。C30s,然后72。C20s，最后72°C延伸5min。PCR反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。得到205bp特異擴增片段，該片段位于第22外顯子內(如圖2)。測序的結果發現在該205bp片段中存在一個^al酶切位點(GTiAC)，其中第28bp處為多態性切點，位于外顯子22中。3、PCR-RFLP檢測條件PCR產物酶切反應體積是10nl,其中lxbuffer1nl，PCR產物3~5pl，限制性內切酶&al為0.3(10U),用H2O補足10pl，將樣品混勻后離心，37'C水浴4h,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。對該位點兩個純合子的測序結果顯述，當第28bp位置是T28時，則該iwI酶切位點不存在，i^I酶切后檢測結果只有1個片段，長度是205bp(定為等位基因T);但存在C28—T28的替換時，其結果導致第28bp處一個Wral酶切位點的產生，得到2個片段，長度分別為177bp和28bp(定為等位基因G)，三種基因型CC,CT，TT如圖5所述。4、PCR—RFLP—&al多態性在各豬品種中的分布情況利用PCR-RFLP-/^I檢測了6個不同中外豬品種其中具有國外豬血緣的豬種分別是大白豬和杜洛克豬，具有中國地方豬血緣的豬種分別是通城豬、清平豬、大花白豬和小梅山豬。該突變位點在不同豬種中的基因型和基因頻率如表1所示，結果顯示CO尸萬/基閃各基因型在通城豬、大花白豬、小梅山豬、大白豬和杜洛克豬都有分布，清平豬中沒有檢測到TT基肉型。x2檢驗6個不同中外豬品種間基兩型頻率差異如表1所示，結果顯示6個不同品種間基因頻率分布存在著一定的差異。表1:幾個豬品種CO/W7基因多態性的基因型和基因頻率<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注"表示PO.Ol,'表示P《.05。5、本發明的分子標記在豬生長速度標記性狀關聯分析中的應用試驗共檢測了169個豬個體中國地方豬通城純種27頭，外來豬大白純種25頭，長白純種26頭，中國地方豬與外來豬的雜交豬大長通(大白X(長AX通城))48頭、長大通(長白X(大白X通城))43頭的多態，確定其基因型，并進行基因型與生產性狀(出生至上市平均日增重、胴體直長、胴體斜長、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率、皮脂重、失水率、肌內脂肪含量、肉色、眼肌面積、臀部膘厚)的關聯分析。建立如下所述的最小—乘模型yijk=|i+GENOTYPE;+SEX,COMBINATIONk+Eijk,其中，y,jk是性狀觀察值，n為總體均數，GENOTYPE,為基因型效應，SEXj為性別效應，COMBlNATIONk為組合的效應，ej」k為隨機誤差，假定服從N(0，cj2)分布。基因型檢測結果表明在169個個體中CC基因型，有60個，CT基因型有72個個體，TT基因型有37個個體。基因型與性狀關聯分析的結果如表3所示。表3COil8/基因WsflI-RFLP多態不同基因型與部分生產性狀的關聯分析<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注"表示PO.Ol,'表示P0.05。由表3可知，CO/^B/基因SNP位點對出生至上市日增重和胴體直長有顯著影響(PO.05)，此位點對其它生產性狀沒有顯著影響。對出生至上市日增重和胴體直長有顯著影響(PO.05)的C(9/^/基因的SNP位點基因型的最小二乘均數如表4所示。表4:SNP位點(CO/，57)基因型出生至上市平均日增重和胴體直長的最小二乘均數<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注'表示PO.Ol，表示P0.05。表4表明，CT基肉型個體的出生直上市日增重、胴體直長都顯著高于CC基因個體的對應值，TT基因型個體出生至上市日增重居中。因此可以看出CT基因型個體生長速度較快。序列表<110〉華中農業大學<120〉一種作為豬標記輔助選擇的與生長速度相關的分子標記的克隆及應用<130〉<141〉2008-05-09<160〉1<170〉Patetrtlnversion3.1<210〉1<211〉919<212〉DNA<213〉豬(Susscrofa)<220〉<221〉gene<222〉(1)..(919)<223〉<220〉〈221>prime:r_bind<222〉(896)..(919)<223><220><221〉primer一bind<222>(l)..咖<223〉<220><221>primer—bind<222〉(896)..(919)<223〉<220〉<221〉primer_bind<222>(715)..(735)<223><220><221>primer—bind<222〉(467)..(487)<223><220〉<221〉primer_bind<222〉(203),.(223)<223〉<220〉<221>mutation<222〉(744)..(744)<223〉<400>1gcactttctggmttgtggctttatggcagccaacctctcaattcagca60ggg3CC卿ggcccctgttactggccacatgca3ag8gtceiggt犯C3ct120tctttatttgagatgctctc3gaMtt3tgtctctcttat180ttctgtatgtggtatcgtactagtgttttgtgC3ttgg犯gcatatatat240aatatccttgtaattttccttcattaaaatggcccactttgagggccttt300tgttctgatttacttgcttaaa8tC3g2Lttaattcctgtggggtgtttgtg犯atggatt360cttcagagatcaagctgcaaatctagtgactttgta肌tatagcact肌a420agtacttaatac3gt犯tgttstggtgagtctattttgtatatccttggtttcatggttg480atgtggtgtcattg組gggggcttggttaacctaccggt540tatgtaataataattataaatatcttcattctttcttaca600ggg幼tggccttaagtcttgcaacttgtctctagt3tata660agaataaacaagttcttgcagCttt3C3gttaagatttaggt3tgggt兆gtstgggctt720actggactccaacatcttttgtaytctttcatgctttatgtctgagttca780tgctgaatgcattccagccaat犯tttatagcctttccctttgattttaa840aattatagttgtcttttgtcttaacagttctgaatgctgtcctca肌gtatataatgttt■cacacatgta919權利要求1、一種作為豬標記輔助選擇的與生長速度相關的分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2、根據權利要求1所述的分子標記，其特征在于，序列表SEQIDNO:l所示序列的第744位堿基處有一個C744-T744的堿基突變，導致RsaI-RFLP多態性。3、檢測權利要求2所述堿基突變的引物對的DNA序列如下所示正向5，-GGGCTTACTGGACTCCAACAT-3，，反向5'-TGGTCTTGATACATGTGTGAAACA-3'。4、一種實現權利要求1或2所述的分子標記的制備方法，其特征按照以下步驟從豬血液基因組中提取DNA，用人Q9/^7基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性80%以上的表達序列標簽(EST);然后拼接豬EST-重疊群，設計引物擴增中間未知片段，純化，克隆，測序，獲得如序列表SEQIDNO:1所述的DNA序列。5、權利要求1或2所述的分子標記在豬分子標記輔助選擇中的應用。全文摘要本發明屬于家畜基因工程
技術領域：
，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇應用的與生長速度性狀相關的分子標記及應用。所述的分子標記由COPB1基因克隆得到，它的DNA序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO1的第744bp處有一個C744-T744的堿基突變，導致RsaI-RFLP多態性。本發明還公開了擴增COPB1基因部分DNA序列所用的引物以及用于多態性檢測方法，為豬的標記輔助選擇提供了一個新的分子標記。文檔編號C12N15/11GK101343663SQ20081004764公開日2009年1月14日申請日期2008年5月9日優先權日2008年5月9日發明者梅余,榜劉,彭中鎮,徐學文,朱猛進,斌樊,趙書紅,邱海芳申請人:華中農業大學