專利名稱：：一種用于篩選定向進化突變酶的快速質粒營救法的制作方法
技術領域：
：本發明涉及的是生物工程體外定向進化快速篩選技術，特別是一種用于篩選定向進化突變酶的快速質粒營救法，是一種快速高效篩選耐高溫和耐酸堿酶的方法。特別適合用于大規模的篩選工業用超高溫突變酶基因，能短時間內得到大量的突變基因。
背景技術：
：體外定向進化是近幾年新興起來的一種蛋白質改造新策略，它可以在尚不知道蛋白質的空間結構，或者根據現有的蛋白質結構知識尚不能進行有效的定點突變時，借鑒實驗室手段在體外模擬自然進化的過程(隨機突變、重組和選擇),使基因發生大量變異,并定向選擇出所需性質或功能,從而使幾百萬年的自然進化過程在短期內得以實現。用定向進化的方法改造工業用酶，提高酶在非天然環境(如有機溶劑)中的活性、耐熱穩定性、非天然底物的特異性、對映體選擇性等方面都有成功。但在構建突變體庫的策略日益成熟的今天，如何快速、高通量的篩選出適合工業用途的進化酶的篩選策略成為制約酶定向進化的瓶頸問題。現有技術中常規篩選定向誘變轉化子的方法A、將定點誘變和隨機誘變的重組質粒轉化大腸桿菌；B、構建目的基因的巨大突變文庫；C、將轉化子進行拷貝；E、對一個拷貝進行高溫(60-100'C)處理或酸堿(pH4~10)處理；F、在對應于相應的拷貝中，挑選在高溫、酸堿條件下有酶活的轉化子；G、對挑取的轉化子進行培養(16-18小時)；H、抽提質粒；I、采用快速轉化的方法進行轉化驗證；J、最后對轉化子進行鑒定直到獲得目的突變子。該方法對轉化子必須進行拷貝備份，費工費時，不能快速篩選出突變酶
發明內容本發明的目的是提出一種篩選定向進化突變酶的快速質粒營救法，可直接從加熱處理或耐酸處理后再加熱處理的平板中回收攜帶有突變基因的質粒，用于進一步的篩選和基因測序，篩選定向進化突變酶。本發明的步驟為-A、將定點誘變和隨機誘變的重組質粒轉化大腸桿菌；B、構建目的基因的巨大突變文庫；C、高溫60-100'C處理(10-30分鐘)構建的突變基因文庫；或者耐酸pH4"40處理(10-15分鐘)再高溫60-100'C處理(10-30分鐘)構建的突變基因文庫；D、直接挑選在高溫條件下有酶活的轉化子的部分死亡菌體；E、將挑出的少量死亡的菌體和大腸桿菌的高效感受態細胞進行混合，采用快速轉化的方法進行轉化；F、最后對轉化子進行鑒定直到獲得目的突變子。本發明具體做法為1.質粒的轉化將定點誘變和隨機誘變的不同大小重組質粒分別轉化到大腸桿菌XL-GOLD，涂布帶有氨芐抗性的LB平板Amp50u/ml，37'C培養過夜，到轉化子單菌落直徑大小約為12mm，選取質粒，構建突變體文庫。2.將突變體文庫分別置于60~100'C，加熱處理10~30min;或者用pH為4.0~10.0的緩沖液分別對文庫平板處理10~15min后再分別置于60^100T，加熱處理10~30min;3.營救質粒轉化從加熱處理后的培養基上隨機選擇3個克隆，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態細胞中。將混合液按照常規轉化步驟進行轉化。然后分別將轉化反應液涂布于含Amp50u/ml的LB培養基，倒置培養至單菌落出現。4.細菌質粒的提取驗證挑取轉化克隆，接種于1ml含Amp50u/ml的LB培養液，37"C培養過夜，按試劑盒說明抽提細菌質粒，然后用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測轉化的質粒分子量。本發明的基本原理和特點本發明打破了常規篩選的方法必須拷貝的思路，不對突變文庫進行拷貝，將建庫的轉化子直接加熱，采用轉化子游離出的質粒直接轉化，節省了大量時間，提高了篩選效益。本發明實驗過程簡單，易操作。可把一輪的篩選過程縮短1-2天。大大減少人力、物力和財力的支出。本發明適合于質粒大小在3-IOKB范圍的載體，篩選作用溫度60-100'C、PH范圍為4-IO的突變體酶。本發明和常規的方法如影印法和拷貝法相比，減少了影印和拷貝過程中的操作及培養菌體和抽提質粒的操作，最少節約時間l-2天；同時還能避免影印法造成的混亂，不能正確挑取對應菌落的不良現象。本發明和直接涂板加碘檢驗透明圈后，然后刮取可以產生透明圈的那部分菌進行質粒的抽提相比，避免了由于菌體太少抽不到質粒，以及在操作過程中造成污染的不良現象。圖1是不同條件對質粒營救效率的影響A:不同處理溫度對快速營救的轉化子的影響，從60度到100度，溫度越高轉化子數越少。B:在70度的溫度條件下，高溫處理從10分鐘到30分鐘對快速營救的轉化子的影響。C:經PH4-10的處理，然后采用70度處理30分鐘，對快速營救的轉化子的影響，結果顯示隨pH升高，轉化子數量增加。D:不同大小質粒對對快速營救的轉化子的影響，結果顯示質粒從3-lOKb，質粒越大轉化子越小。圖2是轉化子質粒抽提電泳圖，它是對圖1D的驗證，顯示我們確實得到了從3-10Kb大小的質粒。圖3是耐高溫淀粉酶突變基因的篩選平板，A加熱前淀粉酶基因的轉化平板；B加熱后顯示水解圈的轉化平板。從B看出，經高溫處理后，轉化子顯示出的酶活，我們直接挑取有酶活的轉化子進行下一步的驗證研究。具體實施方式A材料l.菌種和質粒大腸桿菌菌株XL10"COLD，本發明所用質粒(見表l)均由實驗室保存和構建。pBluescriptKS是原始質粒，在TaKaRa等公司有售，其他質粒是本實驗室按常規方法構建。高效感受態細胞XL10"GOLD的制備方法參考分子克隆手冊方法(1989)。2.試劑0.2mol/L醋酸緩沖液(pH4.0)，磷酸緩沖液(pH6.0)，磷酸緩沖液(pH8.0)，和NaOH-磷酸緩沖液(pH10.0)，LB培養基用于五.//的生長和保存。耐高溫瓊脂(Phytage,Sigma)，氨芐青霉素(Amp)，DNAMaiker，質粒抽提試劑盒、感受態制備試劑等分別購自TaKaRa、Sigma等公司，其它常規試劑采用進口分裝或國產分析純。表l本發明用的菌株和質粒<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例1篩選耐高溫的酶A高溫處理選取質粒大小為6.0kb的pGEX-amy為材料，構建突變體文庫，將文庫平板分別置于60"C，70。C，80°C，90°C，100°C，加熱處理10~30min。B.營救質粒轉化從加熱處理后的培養基上對每個處理選擇3個酶活有變化的克隆(見圖3顯示處理后的結果)，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態細胞中。將混合液按照常規轉化步驟進行轉化。然后分別將轉化反應液涂布于含Amp50u/ml的LB培養基，倒置培養至單菌落出現。C.處理結果處理溫度越高，轉化子越少(見說明書附圖1A);但不影響我們對獲得的轉化子的下一步研究。能夠迅速的篩選到編碼耐高溫的基因。D.結果驗證最后對轉化子進行鑒定直到獲得目的突變子。實施例2篩選耐酸和堿酶的編碼基因A.pH條件對質粒營救效率的影響選取質粒大小為4.0kb的pET23A-h3e為材料，構建突變體文庫；用pH為4.0，6.0，8.0，10.0的緩沖液分別對文庫平板處理lOmin，倒掉多余的緩沖液。B.高溫處理將經不同pH處理過的文庫置于70"C，加熱處理l(^30min。c:.營救質粒轉化從加熱處理后的培養基上隨機選擇3個克隆，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態細胞中。將混合液按照常規轉化步驟進行轉化。然后分別將轉化反應液涂布于含Amp50u/ml的LB培養基，倒置培養至單菌落出現。D.處理結果隨酸堿度不一樣，轉化子數量有變化(見說明書附圖l-C);但不影響我們對獲得的轉化子的下一步研究。能夠迅速的篩選到編碼耐酸堿的酶的基因。E.結果驗證最后對轉化子進行鑒定直到獲得目的突變子。實施例3篩選不同大小的質粒A質粒大小為研究質粒大小對質粒營救轉化效率的影響，選取單菌落分散良好的pBluescriptKs(2.9kb)，pET23A(4.0kb)，pGEX-amy(6.0kb)，pYES2/NTA(8.0kb)，pPIC9K-xamy(10.0kb)轉化平板，B高溫處理70'C，加熱處理30min。C.營救質粒轉化從加熱處理后的培養基上分別隨機選擇3個克隆，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態細胞中。將混合液按照常規轉化步驟進行轉化。然后分別將轉化反應液涂布于含Amp50u/ml的LB培養基，倒置培養至單菌落出現。D.處理結果質粒大小不一樣，轉化子數量有變化，(見說明書附圖l-D);但不影響我們對獲得的轉化子的下一步研究。能夠迅速的篩選到分子量大小從3-10KB的質粒(見說明書附圖2)。E.結果驗證最后對轉化子進行鑒定直到獲得目的突變子。權利要求1.一種用于篩選定向進化突變酶的快速質粒營救法，其特征在于步驟為A、將定點誘變和隨機誘變的重組質粒轉化大腸桿菌；B、構建目的基因的巨大突變文庫；C、高溫60-100℃處理(10-30分鐘)構建的突變基因文庫；或者酸堿pH4～10處理(10-15分鐘)后，再高溫60-100℃處理(10-30分鐘)構建的突變基因文庫；D、直接挑選在高溫條件下有酶活的轉化子的部分死亡菌體；E、將挑出的少量死亡的菌體和大腸桿菌的高效感受態細胞進行混合，采用快速轉化的方法進行轉化；F、最后對轉化子進行鑒定直到獲得目的突變子。2、根據權利要求1所述的一種用于篩選定向進化突變酶的快速質粒營救法，其特征在于步驟為1.質粒的轉化將定點誘變和隨機誘變的不同大小重組質粒分別轉化到大腸桿菌XL-GOLD,涂布帶有氨芐抗性的LB平板Amp50u/ml，37"C培養過夜，到轉化子單菌落直徑大小約為l2mm，選取質粒，構建突變體文庫；2.將突變體文庫分別置于60~100'C，加熱處理10~30min;或者用pH為4.0~10.0的緩沖液分別對文庫平板處理10~l5min后，再高溫60-100'C處理(10-30分鐘)；3.營救質粒轉化從加熱處理后的培養基上隨機選擇3個克隆，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態細胞液中，進行快速轉化，然后分別將轉化反應液涂布于含Amp50u/nd的LB培養基，倒置培養至單菌落出現J4.細菌質粒的提取驗證挑取轉化克隆，接種于1ml含Amp50u/ml的LB培養液，37'C培養過夜，按試劑盒說明抽提細菌質粒，然后用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測轉化的質粒分子量。全文摘要本發明提出了一種篩選定向進化突變酶的快速質粒營救法，可直接從加熱處理或酸堿處理后再加熱處理的平板中回收攜帶有突變基因的質粒，用于進一步的篩選和基因測序，篩選出定向進化突變酶。本發明實驗過程簡單，易操作。可把一輪的篩選過程縮短1-2天。大大減少人力、物力和財力的支出。本發明適合于質粒大小在3-10KB范圍的載體，篩選作用溫度60-100℃、pH4-10。快速定向篩選出耐高溫和耐酸堿酶進化突變酶。文檔編號C12Q1/02GK101302559SQ200810047900公開日2008年11月12日申請日期2008年6月3日優先權日2008年6月3日發明者濤柯,馬向東申請人:湖北大學