專利名稱：用甲基營養酵母生產人淀粉樣蛋白Aβ_1-42的方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質的生產、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中 表達重組人淀粉樣蛋白(P-amyloidprotein, ApM2)，以及優化的大規模工業化發 酵生產重組人淀粉樣蛋白A(3m2的方法。
背景技術：
老年癡呆癥(Alzheimer's disease, AD)，由德國學者Alosi Alzheimer于1907年
首次提出，現已受到人們越來越多的重視。AD的主要病理特征是細胞外老年斑 的形成和細胞內神經纖維纏結的集聚。雖然AD的發病機制至今未明，但目前 普遍認為，老年斑的主要組成成分APw2具神經元毒性，是AD的主要致病原因。 Ap是由它的前體一淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)經裂解而 產生的。APP是一種跨膜多肽，由770個氨基酸組成，半衰期很短(在多種細 胞中僅存留45-60分鐘)，在APP由內質網分泌并轉運至細胞膜的過程中可經 歷多種裂解，裂解產物最終釋放至細胞外。APP裂解的兩種方式，多數情況下， APP首先進行a裂解，產生可溶性大片段a-APP，并釋放至細胞外，殘留含83 個氨基酸的羧基端片段(C83);少數情況下，APP先進行(3裂解，產生一個略 小于a-APP片段的P-APP，殘留含99個氨基酸的羧基端片段(C99)，之后， 兩種裂解產物c83和c99再經y裂解產生p3和a卩(可因不同的裂解部位 而產生A卩wq和ApW2)。在病理狀況下，P裂解或y裂解增強，產生高于生理
濃度的A|3 (主要是APm2)， A卩M2肽是構成老年斑的基本成分，并在細胞外沉
積形成老年斑。A(3M2 C端的10個氨基酸殘基33 42及17~21的5個氨基酸殘 基具有高度的疏水性,構成了 Apw2的疏水區;28 42氨基酸殘基形成e -折疊構象 的可能性較大，而9 21的氨基酸殘基也可能形成(3-折疊的構象。卩-折疊的構象有
利于ApM2肽的聚集而沉積形成老年斑。
由于缺乏合適的研究模型,目前人們對A(3肽的分解代謝和AP肽的清除機理認識得還很不清楚,因而阻礙了治療該疾病的有效藥物的研究與開發。最近科學 家們報道了與上述完全不同的治療AD的研究方法,即用PDAPP轉基因鼠做 A卩w2肽的免疫實驗。科學家們把人工合成的A卩M2分別注射到還未有AD病變 特征的幼鼠和已有AD病變特征的老齡鼠體內,結果發現注射APM2的幼鼠幾乎阻 止了 P-淀粉樣斑塊的進一步生成;老齡鼠則非常顯著地減輕了 AD的癥狀。這是 一個很有意義的發現,不僅意味著這種方法有可能同樣應用于人類,而且人們有可 能通過基因工程在人體內產生AP的抗體,從而阻止AD病的發生。
目前雖然有人曾利用大腸桿菌系統，成功地表達了 A(3w2，但由于表達產物 通常在宿主細胞內形成包涵體，所以致使產物的收率很低，或者純化困難，易于 污染內毒素，往往難于適應研究和臨床應用的需要。雖然也有研究者構建了真核 系統表達載體pcDNA3.1并在COS-7細胞中進行了瞬時表達，但不能用于Apw2 的大量制備。因此，有必要建立大量制備ApM2的體系，以便為其應用于動物模 型，制備抗體，研究清除老年斑的作用機理及預防和治療AD奠定基礎。
甲基營養酵母，特別是巴斯德畢赤酵母是已被深入研究的真核表達系統，并 已被用于表達許多有用的蛋白質。例如，美國專利5,324,639公開了在甲基營養 酵母特別是巴斯德畢赤酵母細胞中生產胰島素樣生長因子1的方法；美國專利 5,330,901公開了使用巴斯德畢赤酵母系統表達人血清白蛋白的方法；美國專利 5,965,389提供了在甲基營養酵母中表達L-谷氨酸脫羧酶(GAD65)的DNA構 建體以及由之制備純的GAD65的方法；美國專利公開了在巴斯德畢赤酵母中表 達血小板衍生的細胞因子(PDGF)的方法；美國專利6,780,615描述了使用重組 巴斯德畢赤酵母生產應樂果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未見關于使用巴斯德畢
赤酵母生產人A(3M2的報道。
發明目的
本發明的一個目的是提供一種使用甲基營養酵母生產重組人淀粉樣蛋白 ((3-amyloidprotein，ApL42)多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培 養基中培養甲基營養酵母，其中所說的甲基營養酵母是用包括下列可操作地連 接的元件的DNA構建體轉化的(l)甲基可誘導的轉錄啟動子；(2)編碼人淀粉樣 蛋白A(3M2的DNA片段；G)轉錄終止子和(4)可選擇標志，從而以至少150mg/L培養基的濃度產生人A卩m2多肽。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤 酵母，并且所說的甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母 A0X1基因。
本發明的另一個目的是提供用于表達重組人淀粉樣蛋白ApL42的甲基營養 酵母，該酵母能夠依靠作為碳源和能源的甲醇生長，并且是被包括甲基可誘導的
轉錄啟動子、編碼人淀粉樣蛋白APm2的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志 的DNA構建體轉化的。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵 母，并且甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母A0X1基因。 本發明的再一個目的是提供用于在巴斯德畢赤酵母中表達重組人淀粉樣蛋 白APL42多肽的DNA構建體，該構建體包括可操作地連接的元件甲基可誘導 的轉錄啟動子、編碼人淀粉樣蛋白ApL42的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤 酵母，并且所說的甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母 A0X1基因。
本發明的再一個目的是提供使用巴斯德畢赤酵母大規模生產重組人淀粉樣 蛋白ApM2多肽的優化的發酵培養條件，特征在于其中發酵溫度維持在28°C 30°C、所使用的pH值為3. 5 5. 0、發酵液的DO值(溶解氧)保持在20% 30%、 并且培養基中添加有0.5% (W/V)的蛋白胨。


圖1顯示合成的人A(3m2 DNA為模板的PCR電泳圖譜。其中泳道1和2是 PCR產物；泳道3是DNA分子量標志物。
圖2顯示重組質粒pPICZ a /h APl42特化酵母菌的PCR鑒定電泳圖譜。其中 泳道5和14是DNA分子量標志物；泳道20是空質粒載體轉化的酵母菌基因組 DNA的PCR產物；泳道1 4，6 13和15 19是不同酵母菌轉化子基因組DNA 的PCR擴增產物。
5圖3顯示純化的Ah."蛋白質的十二垸基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)結果(考馬斯亮藍染色)。其中泳道l， 2分別是純化中分部收集的 洗脫液；泳道3是空白對照；泳道4是6.5KDa分子量標準品。
圖4顯示純化ApM2的Western印跡分析結果。其中泳道1是空白對照；泳 道2 5是本發明制備并純化的APm2祥品。

發明內容
本發明涉及蛋白質生產、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達
人淀粉樣蛋白APw2的方法。
巴斯德畢赤酵母(P. Pastoris)是20世紀80-90年代發展起來的極具潛力的 酵母表達系統，由于其在蛋白質表達方面具有其它系統不可比擬的優點而得到越 來越廣泛的應用。
作為真核表達系統，巴斯德畢赤酵母具有許多其它蛋白表達系統所不具備的 優點①屬于單細胞生物，故保留了易于操作和生長速度快的特點(可高密度發 酵培養，在發酵罐中細胞干重可達130 g/L以上)；②營養要求低，培養基成分 簡單，生產成本低，特別適用于工業化大規模生產；③通過同源重組，可將表達 載體穩定地整合到宿主染色體中，連續傳代中不易丟失；.④具有強有力的乙醇 氧化酶基因(AOX)啟動子，可嚴格調控外源基因的表達；⑤表達量高，許多蛋白 的產率可達到每升克以上水平；⑥表達的蛋白質既可存在于胞內又可分泌至胞
外，巴斯德畢赤酵母自身蛋白質的分泌量很低，十分有利于目的產物純化；⑦作 為真核表達系統，可對表達的蛋白進行翻譯后的正確加工和修飾；⑧糖基化程度 低。
畢赤酵母表達系統由一個外源基因表達框和A0X1啟動子、多克隆位點 (MCS)和一個從A0X1基因上拷貝下來的終止序列(TT)組成。同時，大多數載 體都包含作為篩選標記的HIS4基因和為拷貝增殖而存在的序列(如ColEI復制起 始點和抗氨芐青霉素基因)。另外，還含有使外源基因能以替代或插入方式整合 到染色體的A0X1部位的AOX13'非編碼區序列。本發明所使用的載體是由啟 動子、終止子、選擇標記、報告基因、復制起點等元件構成。另外分泌型載體還 需要有信號序列。最常用的啟動子是A0X1啟動子，它的甲醇誘導性很強，因而它控制下的 外源基因能得到較高的表達。細胞中絕大多數乙醇氧化酶活力是由A0X1提供 的。當在以葡萄糖或甘油為碳源的培養基上生長時，A0X1轉錄受到抑制；而在
以甲醇為唯一生長碳源時，則可誘導A0X1基因的轉錄和蛋白質表達。選擇標 記(HIS4) —般是對應于營養缺陷型受體的野生型基因。
巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白質很少，所以分泌表達是一種理想的表達方 式。同時，胞外表達更有利于蛋白質的提取和純化。本發明優選的信號肽是a因 子(aMF)。 a因子信號序列由87個氨基酸組成，來自于啤酒酵母(S. cerevsia) 的a性成熟因子前導序列，并且已將這段序列編碼的信號肽插人到巴斯德畢赤酵 母的表達載體中。
本發明的巴斯德畢赤酵母表達載體可以是胞內表達的，也可以是分泌表達 的。這些載體都包括一個由0.9kb的5'A0X1序列片段和約0.3 kb的轉錄終止基 因的3'序列組成的表達盒。分泌型表達載體可以是pPIC9,pPIC9k、 pHIL-Sl、 pPICZ a 、 pYAM75P6E6等；胞內表達的載體可以是pHIL-D2、 pA0815、 pPIC3K， pPICZ， pHWO10E121， pGAPZ、 pGAPZa等。本發明優選的是pPICZ a 。
一般用于外源基因表達的巴斯德畢赤酵母菌株包括Y-11430、 M-6100-3 、 GS115、 KM71、 SMD1168等，本發明優選的是巴斯德畢赤酵母X-33菌株。
得到攜帶人APw2基因的重組表達載體后，可使用鋰鹽法、PEG法、原生質 球法和電穿孔法等方法轉化巴斯德畢赤酵母宿主細胞。其中，本發明優選的轉化 方法是電穿孑L法(如參見Sambrook, ed. Molecular Cloning: A Laboratory Manul (2nd.ed.)，Vols.l-3,Cold Spring Harbor Laboratory, 1998)。
導入酵母體內的重組表達載體只有與酵母染色體上的同源區發生重組，整合
到染色體上，外源基因才能夠穩定存在并得以表達。本發明中，為了穩定地表達 目的基因，可以在His或5'AOXl的單酶切位點將質粒載體線性化(Sac 1)，使 之通過單交換整合到酵母細胞染色體中，從而得到表型為Mut+并具有高甲醇利 用能力的轉化子。
用于本發明的巴斯德畢赤酵母含有典型高等真核生物的許多翻譯后修飾功 能。這些功能包括信號肽的加工、蛋白質折疊、二硫鍵的形成、O-及N-型糖基 化和酰化等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白質的糖基化鏈參與細胞識別、激素受體結合、蛋白質定位及宿主一微生物間相互作用。糖基化過程 是經一系列剪接并產生由Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)組成的寡核糖的反應。 巴斯德畢赤酵母能夠將碳水化合物連接到分泌表達的外源蛋白質上。巴斯德畢赤 酵母修飾糖鏈的平均長度為8 14甘露糖，而且外鏈不含ci-l,3甘露糖，所以其 表達的糖蛋白特別適于治療應用。
由于本發明中充分優化了溶解氧水平、通氣量、發酵pH值，攪拌速率、營 養補給等培養條件，所以可使酵母菌高密度生長，從而導致產物的高效表達。例 如，在發酵罐培養條件下，本發明的重組人淀粉樣蛋白APw2表達產率可達到 300mg/L。
絕大多數情況下，巴斯德畢赤酵母(P. Pastoris)中整合多拷貝外源基因會 提高重組蛋白表達產量，所以本發明優先選擇分泌型、高拷貝標記和易操作的穿 梭載體，特別是pPICZ a作為人淀粉樣蛋白的表達載體。
另外，由于在His位點整合時，染色體突變的His位點可與表達盒的HIS4 基因位點之間發生基因交換會導致表達盒的丟失，故一般優先選擇A0X1位點。
本發明中，發酵培養所使用的培養基可以是BMGY/BMMY, BMG/BMM， MGY/MM等培養基，但優選的是成分中含有緩沖液的BMGY/BMMY或 BMG/BMM培養基。
作為唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般為培養體積的0.5-1.0%(V/V)。
發酵培養過程中，可使用已知的方法檢測由被轉化細胞分離物所產生的人淀 粉樣蛋白APw2含量，并從中選擇有高產率的細胞分離物，用于放大生產。
可使用離子交換層析、疏水層析等方法分離并純化所需的人淀粉樣蛋白
ApM2。
本發明首次在酵母(畢赤酵母X-33)中高效分泌表達了人淀粉樣蛋白AP"2，
建立了穩定的人淀粉樣蛋白APL42畢赤酵母高效表達體系。與在大腸桿菌中的表
達相比，本發明的方法具有如下特點①表達體系穩定，含目的基因的表達盒通 過同源重組整合進入酵母的染色體中，菌種穩定，不存在質粒丟失的問題；②有 效的分泌表達，目的蛋白質的表達受醇氧化酶啟動子的嚴格控制，可在甲醇誘導 下啟動表達并將表達產物分泌到培養基中，而且畢赤酵母本身的蛋白很少分泌到 培養基中，使目的蛋白更易于純化；③表達產量高，人淀粉樣蛋白APw2在畢赤
8酵母中的搖瓶規模表達量可達200mg/L，在發酵罐中大規模高密度發酵培養時可 達到300mg/L;④不存在內毒素污染問題；⑤大規模發酵生產成本低。
在人淀粉樣蛋白ApM2純化方面，本發明建立了聯合使用陽離子交換層析和
反相疏水層析技術純化人淀粉樣蛋白A(3M2產物的方法。使用SDS-PAGE、 Western
印跡分析，證實按照本發明方法生產的人淀粉樣蛋白ApM2具有與天然人淀粉樣 蛋白A(3m2相同的分子質量和免疫反應性，從而為進一步檢測其體內外生物學活 性提供了必要條件。
在以上研究的基礎上，本發明進一步探討了畢赤酵母工程菌大規模發酵 (80L發酵罐)方法，優化了利用酵母菌大規模發酵產生人淀粉樣蛋白APm2的 條件，以及適合大規模生產的產物純化方法。其中所使用的優化條件包括發酵 溫度維持在28。C 3(TC、所使用的pH值為3.5 5.0、發酵液的DO值(溶解氧) 保持在20% 30%、并且培養基中添加有0. 5% (W/V)的蛋白胨。
結果顯示，本發明建立的畢赤酵母工程菌大規模發酵生產重組人淀粉樣蛋白 APw2的表達率約為300rag/L發酵液、產物回收率約為60%、產物的純度高達約 95%。本發明的這些研究結果無疑將為重組人淀粉樣蛋白Ap142的工業化生產和 臨床應用提供必要的基礎。
具體實施例方式
以下借助實施例描述本發明的最佳實施方式。這些實施例旨在進一步舉例 闡明本發明，而不是以任何方式限制本發明待批權利要求的范圍。
實施例l:人淀粉樣蛋白APM2基因的獲得和擴增 (1)人淀粉樣蛋白ApL42 DNA的制備 人工合成的方法將編碼人A卩W2氨基酸的遺傳密碼子全部換成了酵母偏愛的
密碼子，具體序列如下5， -GATGCTGAATTTAGACATGATTCTGGTTACGAAGTTCATCAT
GGTGTTGTTATTGCT-3， (SEQ ID NO. 1)。
取如上DNA，按如下比例建立PCR反應體系50y 1: 取上述合成的人A(3M2 DNA為模板1 u 1 (2pmol/ul);含Mg2+的10XPCR
9緩沖液5]il; dNTPs 2. 5 y 1 (各2. 5誦ol/L);在5'端引入酵母a因子信號肽的 部分序列，上游引物5， -CGCCTCGAGAAGAGAGATGCTGAATTTAG-3， (SEQ ID NO. 2) 1 u 1 (20pmol/u 1)含Xhol酶切位點；下游引物5， -CCACAACAATAACGAATTCTTAA GCGCGC-3, (SEQ ID NO. 3) 1 u 1 (20pmol/u 1)含EcoRI酶切位點；Pfu Taq酶 0.3iil (5U/iU);滅菌超純水至終體積50u 1。 PCR反應條件是94。C4分鐘； 94°C30秒，55°C 30秒，72°C 30秒，共30個循環，然后72°C 5分鐘。對擴增 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察片段大小，確定是否得到正確目的基因。 如附圖l所示。
(2) ApM2畢赤酵母分泌型表達載體PPICZa-hApM2的構建 回收PCR擴增的人淀粉樣蛋白APM2基因片段并進行l。/。瓊脂糖凝膠電泳分析。
而后，PCR擴增產物用XhoI和EcoRI酶切后，16。C連接過夜于用同樣酶切的載體 pPICZa上。連接反應體系包括ApL42PCR產物0.1 0.3pmol; pPICZa載體 0.03pmol; T4連接酶lyl; T4連接酶緩沖液lul;滅菌超純水至終體積IOw 1。
按照常規方法，從37'C培養16小時的XL廠Blue陰性培養板上(不含抗生素 的LB瓊脂平板)挑取單個菌落(直徑2 3mm)，接種于含有100ml LB培養基的 1L培養瓶中，以制備感受態大腸桿菌細胞，并于-8(TC凍存備用。
取一份凍存的感受態細胞融化后，加入上述連接產物，進行常規轉化。然后 取200u 1已轉化的感受態細胞涂布于含Zeocin (25u g/ml)的低鹽LB瓊脂平 板上，37'C培養箱中培養12 16小時。
(3) 重組載體的鑒定
隨機挑取轉化后的單菌落，接種于LB培養基中，37'C強烈震蕩培養過夜， 然后常規提取質粒DNA。取10 u 1溶解的DNA沉淀物進行瓊脂糖凝膠電泳定量分 析和酶切鑒定。37°C AflII消化3小時，1%瓊脂糖凝膠電泳后根據內切酶譜鑒 定正確克隆。挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質粒，用于DNA序列測定分析。
實施例2: pPICZa-hA(3M2轉化畢赤酵母X-33
取測序正確的培養菌液，按質粒提取試劑盒說明書提取質粒DNA并用瓊脂糖 凝膠電泳法進行定量分析。取20 25 u g pPICZa-hA(3M2，重組質粒經Sacl酶消 化(線性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質粒用10ul超純水
10溶解后置冰上備用。
從畢赤酵母X-33的YPD陰性培養板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取 單個菌落，接種于5mlYPD培養基中，250rpm， 3(TC震蕩培養8小時，以常規制 備酵母電轉化感受態細胞。
然后取80 n 1上述感受態菌，與20 25u g線性化的重組表達質粒混合，移 入0. 2cm電轉化杯內進行電轉化，而后加入lml冰上預冷的1M無菌山梨醇，混 勻后，30。C孵育l小時。取150yl轉化后的菌液涂布于含Zeocin (100iigM) 的YPD平板上，30'C培養箱培養2 3天，觀察轉化子的生長狀況，并挑取17 個克隆于YPD或BMGY培養液中，3(TC震蕩培養過夜。
取0.5ml培養物，離心回收菌體后，以玻璃珠法提取酵母基因組DNA并進行 PCR鑒定篩選轉化的酵母菌。所使用引物和反應條件同上，鑒定結果如附圖2所 示。
實施例3:重組人淀粉樣蛋白的表達
取上述鑒定結果陽性的克隆接種于10ml BMGY(pH6.0)培養基中，3(TC震蕩 培養24小時，至ODe。。達到2. 0 6. 0時收集細胞。用等體積GOml) BMMY(p服.0) 重懸細胞沉淀，30'C震蕩培養，誘導表達。誘導過程中，每24小時補充一次甲 醇至終濃度0.5%，同時補充滅菌超純水，使發酵液總體積保持不變。在培養的 第0、 24、 48、 72、 96、 120、 144和168小時等時間點各取0. 5ml發酵液，離心 取上清用于蛋白質分析(SDS-PAGE, Western Blot)。
實施例4: APM2多肽的理化性質鑒定 (1) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
用SDS-PAGE法進行蛋白質分子量測定和初步定量分析。方法如下 配制18%分離膠5%濃縮膠。分別取第48小時培養物上清按4:1比例加入5 XSDS樣品緩沖液，混勻后，煮沸3 5分鐘。取上述樣品，冷卻至室溫后，離 心(10000rpm) 30秒，取上清每孔加樣48ul。 60V電泳至濃縮膠與分離膠交界 處，調整電壓到90V，繼續恒壓電泳分離。考馬斯亮藍染色并脫色后，觀察分析 結果。(2)表達產物的Western印跡分析
按照常規方法將發酵液上清經SDS-PAGE后，轉印到硝酸纖維素(NC)膜上， 室溫干燥30 60分鐘。將上述NC膜置于平皿中，加入20ml封閉液(含0. 2% BSA 的TTBS)，室溫輕輕振蕩2 3小時或4'C封閉過夜。封閉結束后，將NC膜放入 雜交袋中按0. lml抗體溶液/cn^膜加入兔抗人A(3m2抗體，室溫振蕩1 4小時。 膜用TTBS漂洗3 5次后，用抗體稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗 體至1:200 1:1000，加入雜交袋中，與NC膜一起室溫振蕩2 4小時。加入 lml 0.3% (W/V) NiCl或CoCl2及10ul 30% &02溶液。洗膜后，將膜移入顯色 液中，室溫下輕輕搖動并觀察顯色反應。結果如附圖3所示。
實施例5: ApM2的大規模發酵制備及純化 (l)最佳pH值的確定
選取表達量較高的A卩w2畢赤酵母工程菌，在10ml YPD培養基中3(TC、 250rpm震蕩培養約24 36小時。分別取上述未加緩沖液的BMGY 8ml，按下示的 量加入不同的緩沖液，以配制成不同pH值的BMGY。混勻后各加入lml畢赤酵母 工程菌，30°C、 250rpm震蕩培養約30小時，使其0De。。^5。
pH值lmol.L—1 Na風(u 1)0. 5mol七—1檸檬酸(ul)
2.8158.5841.5
3.4285715
4. 0385.5614. 5
4. 6467.5532. 5
5.2536464
pH值lmol L—1 Na2HP04(u 1)lmol L一1 NaH2P04 (u 1)
5.879921
6.4255745
7.0577423
室溫離心(3000rpm) 5分鐘，棄去上清，并在菌體沉淀物中加入不含緩沖 液的B醒Y8ml。然后按如上所示的量加入不同的上述緩沖液，以配制成不同pH 值的BMMY， 30°C、 250rpm震蕩培養。誘導表達過程中，每24小時補充一次甲醇至終濃度0.5%，同時補充滅菌去離子水，使發酵液總體積保持不變。在培養的 第0、 24、 48、 72、 96、 120、 144、 168小時等時間點各取0. 5ml發酵液，離心 收集上清進行蛋白質定量分析(SDS-PAGE法)。 (2)其他發酵條件的優化
A) 將凍存的工程菌在YPD瓊脂(含Zeocin 100ug/ml)板上3(TC劃線培養。 至菌落直徑達到2mm左右，挑取單克隆菌落加入到10ml YPD培養液(種子培養 基)中，30°C、 250rpm震蕩培養16 24小時。然后將上述培養物加入到YPD培 養液(2L)中，30°C、 250rpm震蕩培養約24小時，OD,達到10左右。
B) 生物量的積累
配制40L FM21培養基，加入80L發酵罐中，高壓滅菌(121°C， 30分鐘)。 待發酵罐內培養基冷卻到室溫時，用氨水調節FM21培養基的pH至所需數值，而 后加入173. 6ml PTM1微量元素混合物和16ml生物素貯備液。在發酵罐中加入2 升上述培養的菌液，開始進行第一階段發酵罐培養(即甘油培養擴增菌體階段)。 此階段培養溫度為30°C、攪拌速度500rpm，罐內壓力10psi， DO值(溶解氧) 維持在20%以上，必要時通入純氧。在此階段，每6小時取樣1次，測OD6oo和 細胞濕重，分析酵母菌生長狀態，肉眼和鏡下觀察菌液。排除雜菌污染，并留取 上清用于蛋白分析。約24小時后D0值上升至接近10(m，表明培養基中甘油已 消耗殆盡。此時即轉入補充甘油階段，以進一步增加菌體密度。按照每升12ml PTM1微量元素的比例在高壓滅菌后的50%甘油中加入PTM1微量元素。混勻后， 將此混合物以18. 15ral/h/L初始發酵液(即726ml/h)的速率加入到發酵罐中， 至菌體濕重達到180 220g/L。 DO值上升至接近10(m后，繼續維持"甘油饑餓" 狀態30分鐘，然后進入甲醇誘導表達階段。 C)甲醇誘導A(3w2的合成
按照12ml/L的比例，在甲醇中加入PTM1微量元素，混勻后，以3. 6ml/h/L 初始發酵液(即144ml/小時)的速率加入到發酵罐中誘導表達。維持此低速率2 3小時，以使酵母逐漸適應以甲醇為唯一碳源的成長環境。DO值由波動較大變為 相對穩定后，繼續維持此低速率并補加甲醇l小時。
然后加大補充甲醇的速率(7. 2ml/h/L)，并將此速率維持2小時后將速率繼 續增加至11ml/h/L。同時，監測DO值和發酵液溫度并判斷甲醇是否過量。若停
13止補充甲醇后的D0值在1分鐘內上升幅度大于10%，說明碳源受限，反之說明 甲醇過量。在碳源受限的情況下，須加快補充甲醇的速率；如果甲醇過量則應調 慢補甲醇的速率。
開始誘導表達后，每隔6小時取樣，檢測0D60()和細胞濕重，借以分析酵母 菌的生長狀態。此期間留取培養物上清，用于蛋白定量分析。連續誘導發酵48 小時后，結束發酵。取各時間點的發酵液上清，進行SDS-PAGE分析。
實驗結果
1) 發酵液PH值對A(3L42發酵產量的影響
為了選擇發酵過程中最適PH，通過小試比較了不同pH對酵母生長以及
表達的影響。分別在pH3. 0， 3. 5， 4. 0， 4. 5， 5. 0， 5. 5， 6. 0， 6. 5, 7. 0的條件下進行 甲醇誘導表達。SDS-PAGE表明在pH4. 0時，甲醇誘導48h表達量最高為150mg \ 再延長發酵時間，上清液目的蛋白量不僅未增加反而減低，雖然小試時發現pH值 4. 5， 5. 0時表達量也較高，但其他雜蛋白量也高，而且APm2的等電點為5. 4。 PH 值3. 0, 3. 5時，pH值太低不適合菌體擴增，因此，我們選擇把pH4. 0作為發酵液 表達的PH,即可最大限度地保持A(3l42分泌，同時又有利于控制雜菌污染和抑制 蛋白水解酶的活性。
2) 溶解氧對A(3w2發酵表達產量的影響
在發酵過程中，氧的供應是發酵的重要限制因素之一，發酵液的DO值(溶 解氧)應保持在20% 30%之間。溶解氧過高對APM2的表達沒有任何有利的影 響，反而會增加生產成本。
3) 培養基成分對APM2發酵表達產量的影響
本實驗比較了 BSM培養基和FM21培養基，結果發現FM21比BSM培養基更適 于發酵生產APM2。而且，培養基中添加0.5% (W/V)的蛋白腺可使AI3m2的表 達量略有增加，特別是可使表達峰提前至甲醇誘導表達后的第30 36小時，且 雜蛋白含量減少。
4) 溫度對ApM2發酵表達產量的影響
畢赤酵母的最佳生長溫度為3(TC,溫度升高達到32t:對畢赤酵母是致命的。 有時降低發酵溫度可增加目的蛋白的產量。有報道稱在甲醇誘導階段，溫度從 3(TC降至25t:，可使克隆到巴氏畢赤酵母中的半乳糖氧化酶的產量增加4倍。對于A卩M2，在28。C 3(TC的溫度下發酵取得了很好的效果。
5)甲醇流加速度對APM2發酵表達的影響
畢赤酵母雖然可以以甲醇為唯一碳源生長增殖，但甲醇對畢赤酵母菌而言仍
是一種有毒物質，其在培養基中的濃度不可高于2%，否則對酵母菌將是致命的。 甲醇可嚴格控制A0X1啟動子，從而調控APM2的表達。本研究發現在流加甲醇進 行誘導時，盡管目的蛋白的表達量在一定范圍內與消耗甲醇的量呈正相關，但是
甲醇的流加速度并非欲快欲好，對發酵表達A(3M2而言，甲醇最終的流加速度在
8. 5 9mL七—、L'初始發酵液體積較為合適，過低會出現達到表達高峰所需誘導 時間延長，雜蛋白增加；過高也會出現表達量下降雜蛋白增加。 (3)大規模純化系統及純化方法
將60L的發酵液離心，上清用lmol丄—NaOH調pH4. 0。添加200mmol'L—'的 NaAc-HAc(pH4. 0)緩沖液和去離子水將發酵液上清稀釋3倍，NaAc-HAc終濃度 為20mmol'L—、采用SP S印harose XL陽離子交換柱，用5倍于柱床體積的緩沖液A (20mmol七—、aAc-HAc,pH4. O)平衡。然后連續加樣，待樹脂飽和后用3倍于柱體 積的緩沖液A洗柱。以緩沖液B (20mmol丄—iNaAc-HAc， lmol.L—1 NaClpH4.0)洗 脫，收集洗脫液。將洗脫液用Sourcem30 RPC反相疏水層析柱除鹽和濃縮。
SDS-PAGE分析確定純化后的蛋白質的純度和濃度，并用Bradford法精確定 量。結果表明，經反相疏水層析和陽離子交換層析純化后，A(3w2蛋白質的收率 約為60%，純度可達95%以上。結果如附圖4所示。序歹!j 表
<110>吉林圣元科技有限公司
<120〉用甲基營養酵母生產人淀粉樣蛋白AeM2的方法
<140> <141> <160> 3 <210> 1 <211> 126 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定氨基酸序列設計的編碼核苷酸序列。 <400> 1
GATGCTGAAT TTAGACATGA TTCTGGTTAC GAAGTTCATC ATCAGAAGTT GGTCTTCTTT GCTGAAGATG TTGGTTCTAA CAAGGGTGCT ATTATTGGTT TGATGGTTGGTGGTGTTGTT ATTGCT
<210>2 <211>29 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建表達載體的PCR擴增引物。 <400> 2
CGCCTCGAGA AGAGAGATGC TGAATTTAG
<210> 3 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建表達載體的PCR擴增引物。 <400> 3
CCACAACAAT AACGAATTCT TAAGCGCGC
1權利要求
1.一種使用甲基營養酵母生產重組人Aβ1-42蛋白的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養基中培養甲基營養酵母，其中所說的甲基營養酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構建體轉化的(1)甲基可誘導的轉錄啟動子；(2)編碼人Aβ1-42的DNA片段；(3)轉錄終止子和(4)可選擇標志，從而以至少150mg/L培養基的濃度得到重組人Aβ1-42蛋白。
2. 根據權利要求l的方法，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且所說的甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母A0X1基 因。
3. 用于表達重組人AP^42的甲基營養酵母培養物，該酵母能夠依靠作為碳 源和能源的甲醇生長，并且該酵母是被包括甲基可誘導的轉錄啟動子、編碼人 Apw2的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志的DNA構建體轉化的。
4. 用于在巴斯德畢赤酵母中表達重組人ApK蛋白的DNA構建體，該構 建體包括可操作地連接的元件甲基可誘導的轉錄啟動子、編碼人A卩w2的DNA 片段、轉錄終止子和可選擇標志。
5. 根據權利要求4的構建體，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母A0X1基因。
6. 使用巴斯德畢赤酵母大規模生產重組人ApM2蛋白的優化的發酵培養條 件，特征在于其中發酵溫度維持在28'C 3(TC、所使用的pH值為4.0、發酵液 的DO值(溶解氧)保持在20% 30%、并且培養基中添加有0.5% (W/V)的蛋白 胨。
7. 純化ApM2的方法，特征在于使用陽離子交換和反相疏水層析技術分離。
全文摘要
本發明涉及蛋白質的生產、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達重組人Aβ_1-42，以及優化的大規模工業化發酵生產和純化重組人Aβ_1-42的方法。
文檔編號C12N15/12GK101492674SQ20081005027
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月21日 優先權日2008年1月21日
發明者申茉函, 顏煒群 申請人:吉林圣元科技有限責任公司