專利名稱：嗜熱脂肪酶基因、工程菌和嗜熱脂肪酶及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種來源于超嗜熱細(xì)菌 FemVfo6a"m'ww c/w"g6m'o/w CBS-1的嗜熱脂肪酶基因、由該基因重組載體在常 溫宿主中表達(dá)的嗜熱脂肪工程菌，以及利用該工程菌構(gòu)建的嗜熱脂肪酶及該嗜熱 脂肪酶在工業(yè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物催化技術(shù)的深入研究與廣泛應(yīng)用，是繼生物制藥和生物科技農(nóng)業(yè)之后， 生物技術(shù)發(fā)展的"第三次浪潮"和重要支柱，這一技術(shù)的核心就是生物催化劑的開 發(fā)。而酶作為生物催化劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)等領(lǐng)域。但 是工業(yè)生產(chǎn)所需的苛刻條件和酶穩(wěn)定性之間的矛盾，長久以一直在制約著酶技術(shù) 的發(fā)展和應(yīng)用。近些年來隨著人們對(duì)極端環(huán)境和微生物的深入研究，發(fā)現(xiàn)來源于 超嗜熱微生物的嗜熱酶在高溫下顯示了良好的熱穩(wěn)定性和活性。因此，嗜熱酶的 研究開發(fā)與應(yīng)用可以很大程度的緩解現(xiàn)代工業(yè)中的苛刻反應(yīng)條件和酶穩(wěn)定性之 間的矛盾。嗜熱酶將在現(xiàn)代工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域呈現(xiàn)巨大的應(yīng)用潛力，將會(huì)大大推動(dòng)生 物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。自1985年第一種嗜熱酶即TaqDNA聚合酶被成功地用于 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)后，生長在特殊高熱環(huán)境下的微生物正日益引起人們的 重視。在美國、日本、德國等地有20多個(gè)研究課題組正活躍于尋找嗜極菌及極 端酶。近些年來，許多水解酶類的嗜熱酶相繼得到了開發(fā)，并在許多領(lǐng)域發(fā)揮了 重要作用。嗜熱酶不僅具有化學(xué)催化劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如催化效率高和底物專 一性強(qiáng)，而且酶的穩(wěn)定性極好。它可以克服中溫酶(mesophilicenzyme, 20-55°C) 及低溫酶(psychrophilic enzyme, -2-20°C)在應(yīng)用過程中常常出現(xiàn)的生物學(xué)性 質(zhì)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，從而使很多高溫化學(xué)反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)，這將極大地促進(jìn)生物技術(shù) 產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，帶動(dòng)技術(shù)水平和生活質(zhì)量的提高。利用嗜熱酶作為生物催化劑有如下優(yōu)點(diǎn)(1)酶制劑的制備成本降低。因?yàn)?嗜熱酶的穩(wěn)定性高，因而可以在室溫下分離提純和包裝運(yùn)輸，并且能長久地保持 活性；(2)加快動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。隨著反應(yīng)溫度的提高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，酶催化 能力加強(qiáng)；(3)減少了能耗。因?yàn)樵诟邷厍闆r下反應(yīng)，因此對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)降低；(4)提高了產(chǎn)物的純度。在嗜熱酶催化反應(yīng)條件下(超過7(TC)， 很少有雜菌生存，從而減少了細(xì)菌代謝物對(duì)最終產(chǎn)物的污染。由于嗜熱酶的高溫 反應(yīng)活性，以及對(duì)有機(jī)溶劑、去污劑和變性劑的較強(qiáng)抗性，使它在食品、醫(yī)藥、 制革、石油開采及廢物處理等方面都有廣泛的應(yīng)用潛力。脂肪酶(lipase，E.C.3.1丄3)全稱為三酰基甘油酯水解酶(triacylglycerol acylhydrolase)，是指能在油水界面上水解脂肪的酶。脂肪酶催化三酰基甘油酯 反應(yīng)式月旨肪酶 月旨脈脇 三酰基甘油酯^=^二酰基甘油酯+脂肪酸:氣月旨肪酵單酰基甘油酯+脂肪酸^——^甘油+脂肪酸因?yàn)橹久冈诠まr(nóng)及醫(yī)藥等很多方面有十分重要的作用，脂肪酶基因的研 究引起人們的關(guān)注，迄今為止，人們己經(jīng)對(duì)多種脂肪酶的基因進(jìn)行了克隆和研 究。但不同菌屬細(xì)菌的脂肪酶基因差別很大。即使同一屬各種之間的同源性也 很差。目前研究結(jié)果表明，脂肪酶是一種絲氨酸酶類，其發(fā)揮生物活性需要通 過Ser， Asp禾卩His或Ser， Glu和His組成的三聯(lián)體電子中繼網(wǎng)來完成。除此 之外，有些種類的脂肪酶還需要一個(gè)額外的Ala的存在才能發(fā)揮高催化活性。 雖然脂肪酶蛋白的氨基酸序列總體的同源性不高，但底物結(jié)合部位的氨基酸序 列的同源性較高，絕大多數(shù)已知序列的脂肪酶蛋白均含有Gly-Xxx-Ser-Gly這 樣一小段保守序列，而有的如枯草桿菌的脂肪酶含有Ala-Xxx-Ser -Xxx-Gly這 樣一段序列。第一個(gè)Xxx為His或Gly，第二個(gè)Xxx為Met、 Glu、 Leu或是 Ala。同時(shí)這五個(gè)氨基酸附近的十個(gè)氨基酸具有較高的同源性。迄今為止，絕大多數(shù)脂肪酶都來源于常溫微生物或一般嗜熱微生物，很多 脂肪酶盡管具有較好的催化活性，但是卻無法適應(yīng)工業(yè)上較高溫度的反應(yīng)體 系，而來源于超嗜熱微生物的脂肪酶具有良好的熱穩(wěn)定性和高溫發(fā)揮催化活性 的特性，因此，嗜熱脂肪酶的開發(fā)研究具有非常好的工業(yè)應(yīng)用前景。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種具有酯水解功能的嗜熱脂肪酶基因； 本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用上述嗜熱脂肪酶基因通過生物工程技術(shù)構(gòu)建一 種嗜熱脂肪酶工程菌；本發(fā)明的再一個(gè)目的是利用上述嗜熱脂肪酶工程菌制備一種穩(wěn)定性好、耐熱 性強(qiáng)、催化效率高的嗜熱脂肪酶；本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過對(duì)嗜熱脂肪酶的理化性質(zhì)的研究，提供嗜熱脂 肪酶在工業(yè)生產(chǎn)中的多種用途。超嗜熱細(xì)菌Fen;zWo6ac^7'wm c/wf"gkn'cwm CBS-1來源于中國長白山溫泉水 的沉積物，最適生長溫度為75 8(TC。在前期工作中我們發(fā)現(xiàn)該菌在胞內(nèi)和胞外 所表達(dá)的蛋白都具有酯水解的活力，因此推斷該菌的基因組中含有多個(gè)具有酯水 解功能的基因。但是，由于超嗜熱細(xì)菌屬于高溫厭氧型細(xì)菌，生長條件苛刻，人 工培養(yǎng)困難，生長周期相對(duì)較長，而且其菌體密度低(OD600S1.0),表達(dá)的嗜 熱脂肪酶含量非常低，因此從成本上來講直接利用超嗜熱細(xì)菌培養(yǎng)物來生產(chǎn)嗜熱 脂肪酶是不可行的。然而，將嗜熱脂肪酶基因轉(zhuǎn)入可快速繁殖、培養(yǎng)條件簡單的 常溫宿主如大腸桿菌內(nèi)，能夠有效地解決上述問題。對(duì)來源于中國長白山溫泉的超嗜熱細(xì)菌FemWo6a"m'ww ctong^Zcww CBS-1通過菌體培養(yǎng)、目的基因釣取，則得到本發(fā)明所述的嗜熱脂肪酶基因，我 們委托寶上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果如圖2所示，核酸 序列如SEQ ID NO.l所示。將本發(fā)明的嗜熱脂肪酶基因與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)載體，本發(fā)明不 限于特定的表達(dá)載體(pET-lla, pET-28a或pET-20b等系列pET表達(dá)載體)，優(yōu) 選的表達(dá)載體采用真核或原核表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選的為pET-15b表達(dá)載體。上述重組表達(dá)載體可按生物學(xué)常規(guī)方法導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞，適宜的宿主細(xì) 胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠 表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用五.co// BL21(DE3) codonplus (BLp,購買于Stratagene公司)菌株或BL21(DE3)菌株。我們將上述嗜熱脂肪酶基因裝載在pET表達(dá)系統(tǒng)載體上，然后轉(zhuǎn)入到大腸 桿菌宿主中，得到一株工程菌FCL1。該工程菌菌株已于2007年10月15日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京巿朝陽區(qū)大屯路，中國 科學(xué)院微生物研究所，100101)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2195。分類命名大腸 埃希氏菌(foc/ e"'c/n'" co//)。工程菌表達(dá)產(chǎn)物分為細(xì)胞可溶性蛋白和細(xì)胞膜結(jié)合蛋白兩部分。有以下兩種處理方法 一、通過細(xì)胞超聲破碎和加熱失活大腸桿菌雜蛋白即可分離純化得到 細(xì)胞可溶性嗜熱蛋白，再以0.2%脫氧膽酸鈉(DOC)溶解超聲破碎后細(xì)胞碎片和加熱失活大腸桿菌雜蛋白即可得到與膜結(jié)合的嗜熱蛋白；二、通過大腸桿菌直 接熱破碎的方法釋放嗜熱蛋白，可以得到50%以上純度的嗜熱蛋白。在本專利工 程菌發(fā)酵的后處理中，我們推薦第二種方法，操作簡單可節(jié)約成本。應(yīng)用大腸桿菌工程菌(FCL1)表達(dá)的嗜熱蛋白經(jīng)活性實(shí)驗(yàn)鑒定，它具有水 解系列甘油三酯和單酯活力，而且還具有催化聚酯合成和酯交換等多種脂肪酶相 關(guān)的反應(yīng)。該嗜熱蛋白即為本發(fā)明所述的嗜熱脂肪酶，它是首例報(bào)道的來自超嗜 熱微生物的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ IDN(X2所示。相比一般來源的脂肪 酶，它具有非常明顯的穩(wěn)定性優(yōu)勢，6(TC保溫48小時(shí)仍然保持90。/。以上活力， 7(TC的半衰期為8.5小時(shí)，而一般脂肪酶在7(TC中的半衰期都小于2小時(shí)；另外 該嗜熱脂肪酶能在高溫下(70~85°C)催化反應(yīng)，運(yùn)用到生產(chǎn)中，有儲(chǔ)運(yùn)成本低、 加快動(dòng)力學(xué)反應(yīng)、對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)要求標(biāo)準(zhǔn)低等優(yōu)點(diǎn)。以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南"(第 三版，科學(xué)出版社，2002年)。本發(fā)明的嗜熱脂肪酶催化反應(yīng)所利用的底物范圍不局限于任何指定的酯類 和脂肪類、有機(jī)酸和醇類等物質(zhì)，只要能參與酯水解、酯合成、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)發(fā)生的 化學(xué)物質(zhì)都可以。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用對(duì)硝基苯酚脂肪酸酯和三甘油脂肪酸酯作為底物，進(jìn)一步優(yōu)選的底物為對(duì)硝基苯酚癸酸酯和十二垸酸甘油三 酯。


圖1:嗜熱脂肪酶基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜； 圖2:嗜熱脂肪酶基因測序圖譜； 圖3:重組表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；圖4:純化得到的嗜熱脂肪酶的SDS-PAG電泳圖譜；圖5:嗜熱脂肪酶的溫度-活力曲線；圖6:嗜熱脂肪酶的pH-活力曲線；圖7:嗜熱脂肪酶的溫度曲線；圖8:嗜熱脂肪酶的8pH穩(wěn)定性曲線。如圖1所示，左道為DNA分子Marker DL2000，右道為嗜熱脂肪酶基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，右道在分子量950bp處有明顯亮帶，與預(yù)期的分子量945bp相符，所以我們通過PCR方法所釣取的基因即為本專利所述嗜熱脂肪酶基因。如圖2所示，此圖為上海生工生物技術(shù)有限公司提供的嗜熱脂肪酶基因的測 序文件，圖(a)為下游測序結(jié)果，圖(b)為上游測序結(jié)果，測序時(shí)上游和下游各測 一個(gè)反應(yīng)(約600bp)，進(jìn)一步可以用Gene-man軟件組裝得到全長的嗜熱脂肪酶 基因(945bp)。如圖3所示，將pET-15b載體(A)和嗜熱脂肪酶基因的PCR產(chǎn)物(B)都用 限制性內(nèi)切酶Nde I， BamH I進(jìn)行雙酶切(載體另需去磷酸化)，然后在16'C應(yīng) 用T4DNA連接酶來連接已酶切的脂肪酶基因片段和載體片段，即得到含有嗜熱脂 肪酶基因的重組載體(C)。如圖4所示，從左往右依次NI親和層析所得的純酶、蛋白質(zhì)分子量Marker 和熱破碎粗酶。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:嗜熱脂肪酶工程菌的構(gòu)建及其酶的表達(dá)(1)超嗜熱細(xì)菌Fen;/ctoto"en'wm c&awg6a/cwm CBS-1的培養(yǎng)及其染色體 DNA的提取。每升Ferv/(io6fl"eWMW c/^"gkn'cww CBS-1的培養(yǎng)基組成成分如下 (NH4)2S04,1.3 g; KH2P04, 0.28 g; MgS04'7H20, 0.25 g; CaCl2， 0.07 g; FeS04-7H20， 0.028 g; MnCl2， 1.8 mg; Na2B407,4.5 mg; ZnS04.7H20， 0.22 mg; CuS04-2H20,0.05 mg; NaMo04-2H20， 0.03 mg; CoCl2， 0.01 mg;酵母抽提物，1 g;蛋白胨，2 g; 0.1 %(v/v)刃天青(resazurin)。培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后分裝，每100ml培養(yǎng)基中注射加入0.5ml己滅菌的 10%Na2S (營養(yǎng)鹽)溶液。Fen;Wo6""m'ww cte"g6m'CMw CBS-1 (菌種保藏號(hào)DSM17883, JCM13353) 的干細(xì)胞加入1ml上述培養(yǎng)基，重懸后轉(zhuǎn)移至裝有10mL新鮮上述培養(yǎng)基的培養(yǎng) 管中，稍微旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管以混勻；通入氮?dú)?分鐘以除盡培養(yǎng)管內(nèi)的氧氣，之后置 于高溫培養(yǎng)箱中80。C靜止培養(yǎng)2天。然后轉(zhuǎn)移至裝有100ml上述培養(yǎng)基的厭氧 培養(yǎng)瓶中80。C靜止培養(yǎng)2天，8000rpm離心20分鐘收集上述嗜熱菌體，-40°。保 存菌體備用。取0.2g上述收集的菌體，用200nL的25mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0,含50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA)重懸菌體，加入50^1的50mg/ml溶菌酶，4°C 消化1小時(shí)；加入50^1的SDS溶液(終濃度為2%)反應(yīng)10分鐘；加入與上述溶 液等體積(300^1)的酚氯仿異戊醇(體積比為25: 24: 1)，上下顛倒充分 混勻，12000rpm離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到另一支離心管中；向上清中加入 2倍體積的無水乙醇，沉淀菌體DNA， 12000rpm離心5分鐘，倒去上清后，用 70%的乙醇洗滌DNA，再用95%乙醇洗滌DNA后37。C放置5分鐘以除盡乙醇； 最后用100ul pH8.0的lxTE溶液重新溶解，取5ul溶液用0.8%的瓊脂糖核酸凝 膠電泳鑒定所得染色體DNA的濃度和大小，在分子量20Kb左右有一條亮帶， 為所得的染色體DNA，即本專利所述的嗜熱脂肪酶基因的PCR擴(kuò)增模板，-20°C 冰箱中備用。(2)引物設(shè)計(jì)及用PCR法釣取酶的基因制備重組載體本專利所述的嗜熱脂肪酶基因通過PCR方法從步驟(1)所得染色體DNA 中擴(kuò)增而得到。兩個(gè)引物是根據(jù)該基因的序列及表達(dá)載體的多酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì) 的，委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。上游引物GCACTACATATGTCAAGAATAGTAGAGTATG，劃線部分為Nde I位點(diǎn)；下游引物AGTCTAGGATCCTCACTCCAGAATATCGATGAG，劃線部分為 BamHI位點(diǎn)。兩個(gè)引物所設(shè)置的酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體pET15b的Ndel和BamHI相匹配， 適合于在大腸桿菌中高效表達(dá)。PCR反應(yīng)在IOO[U反應(yīng)體系中含lpl Ex-Taq DNA聚合酶，10^1 Ex-Taq DNA 聚合酶緩沖液，1.5^1 dNTP混合物(每種核苷酸濃度25nmol/L)， 4pl染色體 DNA， lpl上游引物，1^1下游引物，81.5^1超純水。每循環(huán)中94X:變性0.5分 鐘，55'C退火1分鐘，72'C延伸1分鐘，最后一次循環(huán)延至10min,共35個(gè)循 環(huán)。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，分子量與預(yù)期的(945bp) —致， 如圖1所示。使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Bay Gene公司生產(chǎn)的PCR Clean-up Kit,步驟 如下向PCR溶液中加入三倍體積的Buffer PCR-A，混勻；將上述溶液加入到 DNA-prep柱子中，12000rpm離心30秒；向DNA-prep柱子中加入500n舊uffer W2， 12000rpm離心1分鐘，再重復(fù)一次；把DNA-prep柱子轉(zhuǎn)移到干凈的1.5ml microfogetube，加入滅菌的去離子水，室溫放置一分鐘后12000rpm離心1分鐘即得到純化的PCR產(chǎn)物)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，-20匸保存?zhèn)溆谩⒓兓腜CR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH I酶切(20ul反應(yīng)體系10ul上 述PCR產(chǎn)物，5ul去離子水，2ul 10xK緩沖液，lul BamH I酶)，37。C下保溫1 小時(shí)后，直接加入1^1 Nde I ，再在37'C下保溫1小時(shí)。酶切完畢，在1.0 %的 瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用DNA凝膠檢測試劑盒回收酶切后的DNA片段。1.0% 的瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測凝膠回收的DNA片段大小約950bp，與目的DNA片 段945bp大小相符，說明所得DNA為目的DNA。將pET-15b載體(大腸桿菌表達(dá)載體，含有T7強(qiáng)啟動(dòng)子、N-末端組氨酸標(biāo) 簽以及氨芐青霉素抗性基因等)用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切(20ul反應(yīng)體系 10ulpET-15b載體，5ul去離子水，2ull0xK緩沖液，lulBamHI酶)，37。C下保 溫1小時(shí)后，直接加入1^1 Nde I ，再在37匸下保溫1小時(shí)。酶切完畢，再用堿 性去磷酸化酶(CIAP)處理，在0.8%瓊脂糖凝膠中檢測線性載體并提純酶切后 的載體。在16'C應(yīng)用T4DNA連接酶來連接已酶切的脂肪酶基因片段和載體片 段，得重組載體。將重組載體轉(zhuǎn)入Eco// BL21(DE3) Codon Plus中，用含氨芐青霉素的瓊脂糖 平板進(jìn)行單克隆菌株的篩選和鑒定。從菌落中提取重組子，用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I作用重組子質(zhì)粒，得到不同大小兩個(gè)片段，其分別與脂肪酶基因(945bp)禾G pET15b/Ndel+BamHI酶切(約5700bp)的片段大小一致，表明挑 取的重組子為陽性轉(zhuǎn)化菌，重組載體的構(gòu)建過程如圖3所示。 (3)重組載體在宿主細(xì)菌中的表達(dá) 重組載體可轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)和BL21 (DE3) Codon Plus等宿 主細(xì)胞中，都能高效表達(dá)嗜熱脂肪酶，其中在Eco"BL21 (DE3) CodonPlus中 表達(dá)的嗜熱脂肪酶含量較高。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及其載體轉(zhuǎn)化方法參照"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南" 一書。挑取步驟2中已經(jīng)鑒定的陽性轉(zhuǎn)化菌，置5 ml含 氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)液(含1.6% (w/v)蛋白胨，1% (w/v)酵母抽提物和 0.5% (w/v) NaCl)中37'C振蕩培養(yǎng)過夜，次日接種到100ml新鮮2YT培養(yǎng)基 中，37。C繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將初步放大的種子液以1% (v/v)的比例接入2 L的2YT 培養(yǎng)液中，在空氣搖床震蕩培養(yǎng)G7'C， 120rpm/min)。待菌體生長到00600為 0.6 1.0時(shí)，加入100mM的異丙基硫代P-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為lmM， 降低培養(yǎng)溫度至27'C，對(duì)菌體進(jìn)行誘導(dǎo)使其產(chǎn)生大量目的蛋白，培養(yǎng)10-12小時(shí) 后收獲菌體，得到本發(fā)明所述工程菌。該工程菌菌株已于2007年10月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.2195。分類命名大腸埃希氏菌(&c/2en'cWaco/0。 本發(fā)明提供的CGMCC No. 2195菌株的特征如下1. 菌體形態(tài)特征菌體為短桿狀，革蘭氏染色陰性，無芽孢。2. 培養(yǎng)特征菌落為白色，有明顯突起，邊緣整齊。液體培養(yǎng)可以在普通 搖床中進(jìn)行，發(fā)酵液渾濁，液面不產(chǎn)生膜。3. 生理生化特征生長pH值為5.0 9.0;生長溫度為10 42°C。可利用葡 糖糖，麥芽糖，乳糖，甘露糖，山梨醇，甘露醇，玉米槳等糖醇類物質(zhì)作為唯一 碳源。4. 菌株培養(yǎng)條件平板培養(yǎng)需在含1.5V。瓊脂糖的2YT培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)可 以在普通搖床中進(jìn)行，最適培養(yǎng)溫度37'C，最適pH7.0。5. 培養(yǎng)基固體純化培養(yǎng)基2YT瓊脂培養(yǎng)基，包括蛋白胨16.0g，酵母抽提物10.0g， NaC15.0g， 15g瓊脂糖，蒸餾水1000mL。液體增殖培養(yǎng)基2YT培養(yǎng)基，包括蛋白胨16.0g，酵母抽提物10.0g， NaCl 5.0g，蒸餾水1000mL。根據(jù)"伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)"(Bergy's Manual of Systematic Bacteriology)第 八版提供的鑒定方法和上述試驗(yàn)結(jié)果表明，上述菌株仍屬大腸埃希氏種。把菌體于-40'C冷凍1小時(shí)，融化，加入菌體6倍體積的50mM磷酸緩沖液 (pH8.0)，重懸混勻；將菌液于7(TC加熱處理20分鐘，離心除去變性的大腸桿菌 雜蛋白(12000rpm， 20min)，收集上清得重組酶的粗酶液。因?yàn)橹亟M嗜熱酶N-末端含有His-Tag，應(yīng)用鎳親和柱(Ni-Chelating Column) 對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離，用lOOmM咪唑洗脫與層析柱結(jié)合得到純的嗜熱酶。應(yīng)用 SDS-PAGE (10%)電泳檢測重組蛋白的純度，可見在33000Da附近可見一電泳 條帶，結(jié)果如圖4所示。實(shí)施例2:重組嗜熱脂肪酶的特性 (1)最適反應(yīng)溫度反應(yīng)溫度是影響酶催化活力的重要因素。 一般而言，嗜熱脂肪酶在高溫下的 反應(yīng)活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低溫，但是在最適溫度附近的穩(wěn)定性卻大大地降低，對(duì)本專利所述嗜熱脂肪酶的催化活力檢測的溫度范圍為20~90°C。以對(duì)硝基苯酚辛酸酯作為反應(yīng)底物，在20 90'C的溫度范圍內(nèi)測定脂肪酶活 力，以酶活的相對(duì)活力對(duì)溫度作圖。由圖5可見，其活力在20 78'C溫度范圍內(nèi) 隨溫度的升高而提高，在78'C以上，活力下降，最適溫度為78'C。酶活性的檢測以對(duì)硝基苯酚辛酸酯作為脂肪酶水解底物，反應(yīng)體系為lml, 緩沖體系為50mM磷酸緩沖液(pH8.0)，對(duì)硝基苯酚辛酸酯的終濃度為0.2mM， 加入5ul 0.1mg/ml的酶，78'C測定1分鐘內(nèi)OD4()5的增加值，求出直線的斜率， 即為酶的活力。1個(gè)酶活力單位定義為1分鐘水解底物生成lfimol對(duì)硝基苯酚 (s-O.OM^UV^.cm-1)所需要的酶量。(2) 最適pH環(huán)境pH值會(huì)影響酶分子中帶電氨基酸的解離狀態(tài)和酶的構(gòu)象，進(jìn)而影響酶 的催化活力。酶的最適pH是在寬范圍pH緩沖液體系中測定，其成分如下乙 酸、N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPS)、 N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸 (TAPS)、 3-環(huán)已胺基丙磺酸(CAPS)和2-碼啉乙磺酸(MES)。在78。C條件下 精確配制100mM不同pH的緩沖液，以對(duì)硝基苯酚辛酸酯作為底物，在78'C下 測定嗜熱酶在pH 5.5-10范圍內(nèi)的活力，以酶活的相對(duì)活力對(duì)pH作圖。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果如圖6所示，在pH值7.0至8.5之間能夠有效地催化對(duì)硝基苯酚辛酸酯的水 解，且表明本專利所述的嗜熱脂肪酶最適pH為8.0。(3) 底物特異性稱取各種對(duì)硝基苯酚脂肪酸酯，將它們分別溶于乙腈配成1Ommol/L的底物 溶液，參照(1)所述脂肪酶測定條件進(jìn)行酶活力測定。甘油三酯底物的測定方法如下以4%的聚乙烯醇為乳化液，分別配制 100mM的各種甘油三酯底物的溶液，在10ml反應(yīng)體系中加入5ml乳化的底物溶 液、4ml磷酸緩沖液(pH8.0)和lml (濃度1.0mg/ml)酶液。70。C反應(yīng)10分鐘 后，立即將反應(yīng)液放入冰上并加入10ml乙醇終止反應(yīng)，再加入100ul 0.1%酚酞 溶液作為指示劑，以已標(biāo)定的50MmNaOH滴定到微紅為止，記錄消耗的NaOH 體積，根據(jù)公式計(jì)算得出脂肪酶的活力。1個(gè)酶活力單位定義為1分鐘水解底物 生成lpmol脂肪酸所需要的酶量。由表1可知，嗜熱脂肪酶對(duì)系列對(duì)硝基酯和甘油三酯都表現(xiàn)出不同程度的活 力，相對(duì)偏嗜中長碳鏈的底物，以對(duì)硝基苯酚辛酸酯和十二垸酸甘油三酯作為底 物是催化活力最高。因此可見，中長鏈的脂肪酸酯是酶的適宜底物。中長鏈的脂肪酸酯廣泛存在于油脂及化工產(chǎn)品中，因此本發(fā)明所述酶在生物化工、生物柴油、 油脂加工、工具酶等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。表l.嗜熱酶的底物特異性底物相對(duì)活力(°/。)對(duì)硝基苯酚已酸酯3.08對(duì)硝基苯酚辛酸酯1.03對(duì)硝基苯酚癸酸酯29.42對(duì)硝基苯酚月桂酸酯100對(duì)硝基苯酚肉豆蔻酸酯4.32對(duì)硝基苯酚軟脂酸酯1.02對(duì)硝基苯酚硬脂酸酯—丁酸三甘油酯10.57己酸三甘油酯15.69辛酸三甘油酯25.20癸酸三甘油酯59.35十二烷酸三甘油酯訓(xùn)十四垸酸三甘油酯19.51十六烷酸三甘油酯24.96橄欖油5.36注對(duì)硝基苯酯底物以對(duì)硝基苯酚月桂酸酯為100%，甘油三酯底物以十二 垸酸三甘油酯為100%。(4)溫度及pH穩(wěn)定性 將濃度為0.5mg/ml的純酶液置于不同溫度(60°C， 70'C和75"C)下緩沖液 (50mMpH8.0磷酸緩沖液)保溫，測定不同保溫時(shí)間的殘余活力。結(jié)果如圖7 所示，表明該酶在6(TC保溫10小時(shí)后仍然保持100。/。活力，而且70'C的半衰期 也達(dá)到8.5小時(shí)，而75。C保溫3小時(shí)后活力基本消失。這說明該酶在7(TC以下 具有非常好的熱穩(wěn)定性。將濃度為0.5mg/ml的純酶液放置于50 mM不同pH的寬范圍緩沖液(乙酸、 N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPS)、 N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-環(huán)己胺基丙磺酸(CAPS)和2-碼啉乙磺酸(MES)中，在室溫放置1小時(shí)， 70'C測其殘余活力。由圖8可以看出，該酶在pH5-10范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高，殘余 酶活力在80%以上。本發(fā)明所公開的內(nèi)容，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此 前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明 的范圍。本領(lǐng)域研究人員在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種 變更和改進(jìn)。附本發(fā)明所涉及嗜熱脂肪酶基因核苷酸序列表和由該基因表達(dá)的嗜熱脂肪酶氨基酸序列表 (1) SEQ ID NO. 1 嗜熱脂肪酶基因核苷酸序列表 〈110〉吉林大學(xué)<120>嗜熱脂肪酶基因、工程菌和嗜熱脂肪酶及應(yīng)用 <160> 2 <210> 1 <211> 945 <212> DNA<213>真細(xì)菌(Anaerobic Hyper-thermophilic bacterium, Fervidobacterium changbaicum CBS-l)<220〉<221〉 CDS<222〉 (l)... (945)<柳〉1ATGGAGAATAATACCTTCGTGAGCTTTCTCAAAGTTTTGTTACTAGGAMetGluAsnAsnThrPheValSerPheLeu!>ysValLeuLeuLeuGly151015ACGATTGTGTTTTACATCTCAACACACCTATCAACATCAAGAATAGTAThrlieValPheTyrlieSerThrHisLeuSerThrSerArglieVal202530GAGTATGTTTCACAAGATGCAAAAAAACTCACAATCGAGGGAATTCAAGluTyrValSerGinAspAlaLysLysLeuThrlieGluGlylieGin354045GTTGCTTACAGAGAATACGGAAAAGGTAACTTTGAAACTATAGTGTTCValAla丁yrArgGluTyrGlyLysGlyAsnPheGluThrlieValPhe505560CTACATGGATTCGCCGGTTCTTCTTACGATTGGAAGGTGCTAATTGATLeuHisGlyPheAlaGlySerSerTyrAspTyrLysValleulieAsp65707580GTGCTTTCGGAAAATTATCACTGCATAGCATTTGATATACCACCATTTValLerSerGluAsnTyrHisCyslieAlaPheAsplieProProPhe859095GGTTTATCTGAAAAGAAAAACGACTTTGATTATTCTGACGAATCGATTGlyLeuSerGluLysLysAsnAspPheAspTyrSerAspGluSerlie100105110GTAAGACTCTTAATAAAGTCTTTAGATTCCCTGGGAATAGAG(MTTCValArgLerLerlieLysSerLerAspSerLerGlylieGluGinPhe105120125ACTCTCGTTGGTCATTCGATGGGTGGATACCTTTCACTTGCGATAGCAThrLeuValGlyHisSerMetGlyGlyTyrLeuSerLeuAlalieAla130135140AGCATTATTCCAAAAAGAGTGGAAAGGCTCATTTTATTTGACGCTGCGSerlielieProLysArgValGiuArgLerlieLeuPheAspAlaAla145150155160TACGATGTTAACAGTGAAGATTTACAAAACCCAGGCCCTCCGTTTTyrAspViaAsnSerGluAspLeuGinAsnProGlyProProPheLys165170175CTAAAAGACGAGCACCTACTTAAGTTTTACCAAATATTTCTGGATGTALeuLysAspGluHisLeuLeuLysPheTyrGinliePheLeuAspVia180185190GGTTTGAAAACCTATCCGCTGTTCAAATTCGTTTACCGAAATTCATTAGlyLeuLysThrTyrProLeuPheLysPheValTyrArgAsnSerLeu195200205GCAGAAGGTGJVGATTCTGAATGCCGAAacTTCGACTACTTGTTTTCAAlaGluGlyGlulieLeuAsnAlaGluHisPheAspTyrLeuPheSer210215220CAAAATTACTTTCTACCTGCGGAAATACTCATAAAGTTCACAAAAGACGinAsnTyrPheLeuProAlaGlulieLeulieLysPheThrLysAsp225230235240AAAGCAGCACAGAAACCTTTAAAAATTGATCTTGAGGGTATAACCGCCLysAlaAlaGinLysProLeuLyslieAspLeuGluGlylieThrAla245250255AAAACTCTTATTATTTACGGTGAAAAAGATCAGATAACCCCTCCGTCGLysThrLeulielieTyrGlyGluLysAspGinlieThrProProSer260265270ATAGGTGAGTATTTATCCAAATCAATAAAGAACTCGAAATTTATGTTGlieGlyGluTyrLeuSerLysSerlieLysAsnSerLysPheMetLeu275280285ATTCCAAACGAAGGGCACATGCCTTTATCAAACAGATTAGTTATAGAAlieProAsnGluGlyHisMetProLeuSerAsnArgLeuVallieGlu290295300CTGGTCAGGAAATTCCTCATCGATATTCTGGAGTAG(945)Leu Val Arg Lys Phe Leu lie Asp lie Leu Glu承 305 310 315(2)SEQIDN0.2 嗜熱脂肪酶氨基酸序列表<210〉 2<211〉 157<212〉 PRT<213〉古生菌(Aerobic Hyper—thermophilic crenarchaeon, Aeropymm pernix Kl)<400> 2MetGluAsnAsnThrPheValSerPheLeuLysValLeuLeuLeuGly151015ThrlieValPhe 20TyrlieSerThrHis 25LeuSerThrSerArg 30lieValGluTyrVal 35SerGinAspAlaLys 40LysLeuThrlieGlu 45GlylieGinValAla 50TyrArgGluTyrGly 55LysGlyAsnPheGlu 60ThrlieValPheLeuHisGlyPheAlaGlySerSerTyrAspTyrLysValLeulieAsp65707580ValLerSerGluAsnTyrHisCyslieAlaPheAsplieProProPhe859095GlyLeuSerGlu 100LysLysAsnAspPhe 105AspTyrSerAspGlu 110SerlieValArgLer 105LerlieLysSerLer 120AspSerl_erGlylie 125GluGinPheThrLeu 130ValGlyHisSerMet 135GlyGlyTyrLeuSer 140LeuAlalieAlaSerlielieProLysArgValGluArgLerlieLeuPheAspAlaAla145150155160TyrAspViaAsnSer 165GluAspLeuGinAsn 170ProGlyProProPhe 175LysLeuLysAspGluHisLeuLeuLysPheTyrGinliePheLeuAspVia180185190GlyLeuLys 195ThrTyrProLeuPhe 200LysPheValTyrArg 205AsnSerLeuAlaGluGlyGlulieLeuAsnAlaGluHisPheAspTyrLeuPheSer210215220GinAsnTyrPheLeuProAlaGlulieLeulieLysPheThrLysAsp225230235240LysAlaAlaGinLysProLeuLyslieAspLeuGluGlylieThrAla245250255LysThrLeulielieTyrGlyGluLysAspGinlieThrProProSer260265270lieGlyGlu 275TyrLeuSerLysSer 280lieLysAsnSerLys 285PheMetLeulieProAsnGluGlyHisMetProLeuSerAsnArgLeuVallieGlu290295300LeuValArgLysPheLeulieAsplieLeuGlu氺305 310 31權(quán)利要求
1、一種嗜熱脂肪酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、 如權(quán)利要求1所述的嗜熱脂肪酶基因，其特征在于與表達(dá)載體pET-lla、 pET-28a或pET-20b重組，構(gòu)成重組表達(dá)載體。
3、 如權(quán)利要求2所述的嗜熱脂肪酶基因，其特征在于表達(dá)載體為pET-15b。
4、 如權(quán)利要求2或3所述的嗜熱脂肪酶基因，其特征在于重組表達(dá)載體導(dǎo)入 五.co// BL21(DE3) codon plus宿主細(xì)胞或BL21(DE3)宿主細(xì)胞，得到嗜熱工程菌。
5、 如權(quán)利要求4所述的嗜熱脂肪酶基因，其特征在于宿主細(xì)胞為 BL21(DE3) codon plus。
6、 如權(quán)利要求5所述的嗜熱脂肪酶基因，其特征在于得到的嗜熱工程菌為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，其于2007年10月15日保藏在中國微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 2195。
7、 一種嗜熱脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
8、 權(quán)利要求7所述的嗜熱脂肪酶在中長鏈的脂肪酸酯催化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來源于超嗜熱細(xì)菌Fervidobacterium changbaicum CBS-1的嗜熱脂肪酶基因、由該基因重組載體在常溫宿主中表達(dá)的嗜熱脂肪工程菌，利用該工程菌構(gòu)建的嗜熱脂肪酶及該嗜熱脂肪酶在生物化工、生物柴油、油脂加工、工具酶等領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。本發(fā)明所得嗜熱脂肪酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，嗜熱脂肪酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，嗜熱脂肪工程菌于2007年10月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.2195，分類命名大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101215571SQ200810050250
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月14日
發(fā)明者雁 馮, 搏 宋, 蔡錦剛, 淵 謝 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)