專利名稱：：具有毒殺松材線蟲活性的化合物及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一類具有毒殺松材線蟲活性的化合物及其應用，屬生物農藥
技術領域：
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背景技術：
：松材線蟲(Sw^a//2e/e"c/zz^j^/o;/2z7^)原產北美，是中國重要的外來入侵種(alieninvasivespecies),由它引起的松材線蟲病對中國森林構成了嚴重的威脅。松材線蟲病又稱松樹萎蔫病，是由松材線蟲寄生在松樹體內導致松樹木質部組織細胞受到破壞，水分輸導受阻，呼吸作用加強，樹脂分泌減少直至最后停止，蒸騰作用減弱至松樹迅速死亡。松材線蟲病被稱為松樹的癌癥，是松樹的一種毀滅性病蟲害，通常感病后40天左右即可造成松樹枯死，35年可摧毀成片松林，被列為重要的危害性森林病害。中國大陸于1982年在南京中山陵的黑松上首次發現松材線蟲病，當時僅在1省1市1區發生，發生面積200hm2，病死樹僅256株。在短短20多年的時間里，疫區范圍大大地擴大了。據國家林業局在2006年2月的報告，疫區發生省市為江蘇、浙江、安徽、江西、山東、湖北、湖南、廣東、重慶、云南、貴州等ll個省、直轄市的95個縣、區、市，2005年發生面積達7.7萬hm2，當年致死松樹154萬多株。松材線蟲病的迅速擴散漫延，給我國的森林資源及生態環境、自然景觀造成嚴重破壞，并對廣大適生區的森林構成嚴重威脅。目前國內外對松材線蟲尚無有效的藥劑及防治方法，一些對植物寄生根結線蟲和胞囊線蟲有效的生物制劑，對松材線蟲則根本沒有活性。尋找對松材線蟲有效的防治方法和藥劑，已經迫在眉睫。在國內外專利文獻報道中，均未涉及化合物CerebrosideA和CerebrosideB殺松材線蟲的活性報道。
發明內容本發明的目的在于提供一種具有毒殺松材線蟲活性的化合物。為實現上述目的，本發明提供的具有毒殺松材線蟲活性的化合物，由擬青霉菌(P^cz7om;;cM)，采用固體發酵及提取分離的方法獲得；該化合物的結構式為HOH2S式中R的結構式如A或B所示oAR=B所述的化合物，其中，A式和B式的物化常數如下:分子式ESI-MSIR(Neat)vmax3279(br)，2955,2921,2851，1640，1534，AC41H75N09725，1467,1084cm'1BC4IH77N097273285(br),2955,2920，2851，1650，1542,1467，1079cm"本發明的化合物可應用于松材線蟲農藥制劑。具體實施例方式本發明在微生物次生代謝產物活性化合物的高通量篩選基礎上，發現了擬青霉菌(/^e"7om^")的大米發酵液具有殺松材線蟲活性，通過活性跟蹤，進一步分離純化，得到了具有殺線蟲活性的兩種化合物CerebrosideA和CerebrosideB。與專利文獻報道的其它類殺松材線蟲化合物相比，CerebrosideA具有很好的殺松材線蟲活性，而CerebrosideB具有弱的殺松材線蟲活性。本發明的生產菌株為擬青霉菌(尸ae"7omyc")，該菌已于2007年12月27日保藏在中國科學院微生物所，保藏號為AS6.34。本發明的具有毒殺松材線蟲活性的化合物是從生產菌株的固體發酵培養物中提取分離得到的化合物CerebrosideA和CerebrosideB，其結構式為H，OHN'ROHOH在化合物CerebrosideA中，結構式中的R為o2<化合物CerebrosideB中，結構式中的R為o本發明的該類活性化合物的物化常數、氫譜和碳譜數據分別見表1和表l.化合物A和B的物化常數分子式ESI-MSIR(Neat)vmaxAC41H75N09BC41H77N097257273279(br),2955，2921,2851，1640,1534,1467,1084cm-13285(br),2955,2920,2851,1650,1542,1467,1079cm-'表2.化合物A和B的氫譜和碳譜數據_^_positioni5Ha(mult.,>/hh)5cbla4.15,dd(10,5,2)69.7，CH2l卩3.71,dd(10，3.4)23.98,m54.6,CHB4.14,dd(10,5,2)69.7,CH23.72,dd(10，3.4)3.99，m54.6,CH<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發明的化合物在液體浸泡法的抗線蟲活性測試中，在處理時間為24小時，化合物A和B對松材線蟲的LCso分別為49.4pg/ml和543.8iig/ml。可見化合物A具有很好的殺松材線蟲活性，而化合物B具有弱的殺松材線蟲活性。其中化合物A可單獨或組合用于制備農藥制劑，化合物B也可組合用于制備農藥制劑。因此，本發明的化合物可作為制備農藥殺線劑應用。下面列舉實施例作詳細說明。實施例1化合物A和B的分離制備a)真菌擬青霉菌(Paec/fomyc^)的活化PDA培養基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1000mL，制成試管斜面，挑取菌絲體接種于試管斜面上，25。C培養7天；b)真菌擬青霉菌(尸m"7o^;cm)的固體發酵培養大米培養基(制備過程為將100g大米和100mL水加入500mL三角瓶中，浸泡過夜，滅菌冷卻待用)。將制備好的菌懸液(孢子濃度為1x1C)S個/mL)5mL接種于大米培養基上，25。C培養40天；c)待發酵完畢，將乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，減壓蒸干有機溶劑，得到粗提物。d)將粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇體系進行減壓硅膠柱層析。e)在活性跟蹤指導下，將活性組分(乙酸乙酯甲醇=10:1)通過Sephdex-LH20分離，將活性餾份通過HPLC制備得到化合物A和B。實施例2采用液體浸泡法檢測本發明的化合物的抗線蟲活性的試驗1)試驗用藥劑將2mg供試樣品先溶于1OOpL有機試劑丙酮中，再用純水稀釋成2000pg/mL、200^g/mL和20;/g/mL濃度的供試藥液。2)松材線蟲的培養與制備在PDA平板培養基上接種灰霉即葡萄孢菌于25。C下培養4-5天，灰霉基本長滿平皿；將松材線蟲(Swwfl;/^/enc/n^;qy/o;/H7z^)接種到長滿灰霉的PDA平皿中，在25"C條件下培養1周；待線蟲將菌落吃完，用貝曼淺盤法收集線蟲(即將培養好線蟲的PDA培養基用解剖刀切成塊，放入8層紗布中，將紗布包好，放入帶膠管的直徑為20cm的漏斗中，加入無菌水，靜置后收集)；將收集到的線蟲液離心去上清，在顯微鏡下用無菌純水將線蟲液調整到合適的濃度，立即使用。3)試驗方法取100//L本發現的化合物藥液(濃度分別為2000^g/mL、200^g/mL禾口20/^g/mL)加入到24孔板中，再加入100/^L松材線蟲(30-50條)懸液，使供試樣品的最終濃度分別為1000pg/mL、100//g/mL和10^g/mL，待藥液和線蟲液混和均勻，將培養板放置于25。C的培養間中，于黑暗條件下培養24小時后在倒置顯微鏡下計數活、死線蟲數目。線蟲死亡率。/^死線蟲數/總線蟲數x100。/。將含5%丙酮的水溶液作為對照，實驗三次重復，取三次的死亡率計算出平均死亡率。4)試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結果表明本發明的化合物A具有很好的殺松材線蟲活性，而化合物B具有弱的殺松材線蟲活性。其中化合物A可單獨或組合用于制備農藥制劑，化合物B也可組合用于制備農藥制劑。權利要求1、一種具有毒殺松材線蟲活性的化合物，由擬青霉菌(Paecilomyces)，采用固體發酵及提取分離的方法獲得；該化合物的結構式為式中R的結構式如A或B所示2、如權利要求1所述的化合物，其中，A式和B式的物化常數如下:分子式ESI-MSIR(Neat)vmaxAC41H75N09725BC41H77N097273279(br)，2955,2921，2851,1640，1534,1467,1084cm"3285(br)，2955,2920，2851，1650,1542,1467,1079cm-i3、權利要求l所述的化合物用作松材線蟲農藥制劑的應用。全文摘要本發明涉及一種具有毒殺松材線蟲活性的化合物及其應用，該化合物，由生產菌株，采用固體發酵及提取分離的方法獲得。其生產菌株為擬青霉菌(Paecilomyces)，該菌已于2007年12月27日保藏在中國科學院微生物所，保藏號為AS6.34。本發明的該類活性化合物由CerebrosideA和CerebrosideB兩種化合物組成。本發明的該類化合物，能有效的毒殺松材線蟲，可單獨或組合制備毒殺松材線蟲農藥的應用。文檔編號C12P13/02GK101481712SQ20081005578公開日2009年7月15日申請日期2008年1月9日優先權日2008年1月9日發明者劉杏忠,劉述春,向梅春,張永剛,車永勝申請人:中國科學院微生物研究所