專利名稱：一類具有毒殺線蟲活性的化合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一類具有毒殺線蟲活性的化合物及其應用，屬微生物生物農藥技術領域。
背景技術：
線蟲危害嚴重，它不僅給人類和動物帶來嚴重的疾病，而且每年給農作物造成相當于1044億美元的損失。目前對線蟲的防治仍然以化學防治為主，但由于化學殺線蟲劑多數是高毒、高殘留農藥，對人蓄和環境造成嚴重的威脅。有的化學殺線蟲劑，如用作土壤熏蒸劑的溴甲烷類等，已經在全球多數國家禁止使用或已經規定使用的最后期限。隨著人們環境意識的增強，化學殺線劑的應用受到限制，因此對線蟲的生防研究自然成為重點和焦點問題。在線蟲的生防研究中，目前已有直接利用菌體的第一代商品生防劑問世，并已有相當范圍的大田應用。由于這一代產品是活菌體，土壤存在著不同程度的抑菌作用，導致在不同國家不同土壤中試用的不穩定性和不一致。這是活體生防制劑的共同通病，為克服這一難題，人們更加關注線蟲生防第二代產品的開發，即菌株次生代謝產物的研究與開發。
近30年的研究中，已從50多株菌中分離到90多種對線蟲有活性的化合物，其結構類型多樣，主要有醌類、生物堿類、萜類、肽類、吡喃類、脂肪酸類和萘類等。但由于各種原因，在這些化合物中目前具有潛力開發成線蟲生防制劑的很少，因此加緊篩選獲得對線蟲有活性的物質或組分，將其開發成生防制劑是一項具有重要意義。
5-甲基-3-呋喃羧酸是一種呋喃的羧酸衍生物，CAS No.21984-93-0，CA名稱3-Furancarboxylic acid，5-Methyl，分子式C6H6O3，分子量126.10，結構式如下 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮是一種呋喃類的衍生物，CASNo.14300-72-2，CA名稱2(5H)-Furanone，-5-hydroxy-3，5-dimethyl，分子式C6H8O3，分子量128.21，結構式如下
國內外文獻檢索表明，5-甲基-3-呋喃羧酸常被用作有機合成的前體，但未見有關活性和天然來源的報道，也未見5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮用于制備殺線蟲制劑應用的公開文獻報道。

發明內容
本發明的目的是提供5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮及其在制備殺線蟲制劑中的應用。
本發明是這樣實現的本發明使用的真菌是毛頭鬼傘(Coprinus comatus LHA-7)，LHA-7菌株已于2003年5月26日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.0932。
毛頭鬼傘屬擔子菌，主要形態特征是子實體較大。菌蓋呈圓柱形，當開傘后限快邊緣菌褶溶化成墨汁狀液體。菌蓋直徑3-5cm，高達9-11cm，表面褐色至淺褐色，并隨著菌蓋長大而斷裂成較大型鱗片。菌肉白色。菌柄白色較細長，圓柱形且向下漸粗，長7-25cm，粗1-2cm，光滑，橢圓形12.5-16×7.5-9μm。具囊體，無色，棒狀頂部鈍圓24-60×10-12.3μm。菌絲無色，具明顯鎖狀聯合。
本發明將毛頭鬼傘(Coprinus comatus LHA-7)通過常規發酵培養，將發酵液低壓濃縮后，用甲醇提取。將甲醇提取物經反復硅膠柱，氯仿/甲醇洗脫，得到本發明的化合物，化合物經核磁共振波譜，質譜，紅外光譜和紫外光譜確定為5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮，結構式依次為 5-甲基-3-呋喃羧酸5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮實驗表明5-甲基-3-呋喃羧酸具有顯著的毒殺腐生線蟲和花生根結線蟲的活性，對腐生線蟲的ED50(半致死率)為125ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)為500ppm。對花生根結線蟲的ED50(半致死率)為125ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)為250ppm。5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對腐生線蟲的ED50(半致死率)為250ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)為500ppm。對花生根結線蟲的ED50(半致死率)為250ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)為500ppm。
本發明將從Coprinus comatus LHA-7中用現有方法分離得到的5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮作為制備殺線蟲制劑的應用。
本發明亦可將0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亞砜，再用Tween-20水溶液稀釋，得具殺線蟲活性物質的乳濁液；乳濁液中，二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％；該乳濁液作為制備殺線蟲制劑的應用。
本發明與現有的殺植物寄生線蟲藥相比，具有高效、低毒及低殘留等優點。
具體實施例方式本發明化合物的發酵生產方法1、將LHA-7的菌絲體接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，20-30℃下培養4-8天，獲得試管種；2、將試管種接種到250ml三角瓶中(每瓶裝50ml)液體培養基中，培養基配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，自然pH。培養溫度20-30℃；搖床培養，轉速為100-300rpm；培養時間4-12天。
3、將含菌絲的發酵液將發酵液低壓濃縮后，用甲醇反復溶解，把溶解物合并低壓濃縮后得甲醇提取物。用甲醇溶解提取物上樣，經正相硅膠柱層析，氯仿反復洗脫。活性跟蹤檢測所分離到的組分，將具有活性的部分合并低壓濃縮，經反復硅膠柱層析，氯仿/甲醇洗脫，洗脫液經活性檢測，活性部分經TLC檢測(展開劑氯仿∶甲醇5∶1；硫酸顯色)，將只具有同一個單點的部位合并得到化合物5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮。
本發明化合物對植物寄生線蟲的藥效試驗1、試驗用藥劑將化合物溶于少量二甲亞砜，用無菌蒸餾水稀釋為適用濃度，二甲亞砜的終濃度不超過3％。
將未接種的發酵培養基低壓濃縮后，用甲醇提取。將甲醇提取物濃縮后用二甲亞砜溶解，再用無菌蒸餾水稀釋為適用濃度作為對照。
2、制備試驗用線蟲(1)制備Panagrellus redivivus線蟲將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養基上，于28℃下培養6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
(2)花生根結線蟲(Meloidogyne arenaria)的培養將溫室培養的帶有花生根結線蟲的蕃茄根用無菌水洗凈，用解剖針挑取根結線蟲的卵囊置于0.4M的KCl溶液中，在5ml離心管中依次用4ml無菌水(三次)、1ml無菌青-鏈霉素雙抗溶液、3ml 0.1％的NaClO溶液洗滌和消毒，每一步驟均通過短暫離心(8000轉30秒)除去上清液。洗滌好的蟲卵置于0.4M的ZnCl2溶液中孵化48小時，二齡幼蟲用移液器收集于1.5ml離心管，通過短暫離心(5000轉30秒)富集備用。
3、試驗方法將本發明化合物稀釋為不同濃度供試藥液，將藥液200μl于20孔板中，加入活線蟲100-150條，置于25℃下，分別于4小時、12小時、24小時在光學顯微鏡下檢查計算線蟲的死亡率。
鑒定死亡的方法為在處理板孔中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
死亡率％＝(死亡線蟲數/(死亡線蟲數+存活線蟲數))×100％校正死亡率％＝樣品死亡率-對照死亡率實施例1化合物對線蟲的毒殺作用將0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于少量二甲亞砜，用無菌蒸餾水稀釋為500ppm溶液，二甲亞砜的終濃度不超過3％。
按上述試驗方法進行藥效試驗。列表所示為校正死亡率。
表15-甲基-3-呋喃羧酸對P.redivivus線蟲的毒殺作用重復次數 4小時 12小時24小時135.3％ 81.1％100％243.7％ 82.8％100％352.1％ 98.3％100％結果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸500ppm水溶液對P.redivivus線蟲的致死率在12小時達到80％以上，24小時達到100％。具有明顯的殺線蟲活性。
表2 5-甲基-3-呋喃羧酸對M.arenaria線蟲的毒殺作用重復次數 4小時 12小時24小時l40.7％ 90.7％100％248.8％ 93.5％100％353.6％ 88.9％100％結果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸500ppm水溶液對M.arenaria線蟲的致死率在12小時達到90％以上，24小時達到100％。具有明顯的殺線蟲活性。
表3 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對P.redivivus線蟲的毒殺作用重復次數 4小時 12小時 24小時145.2％ 87.1％ 100％233.1％ 72.4％ 100％342.1％ 78.3％ 100％結果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮500ppm水溶液對P.redivivus線蟲的致死率在12小時達到70％以上，24小時達到100％。具有明顯的殺線蟲活性。
表4 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對M.arenaria線蟲的毒殺作用重復次數 4小時 12小時24小時152.1％ 91.1％100％255.4％ 92.5％100％352.2％ 91.0％100％結果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮500ppm水溶液對M.arenaria線蟲的致死率在12小時達到90％以上，24小時達到100％。具有明顯的殺線蟲活性。
實施例2化合物對線蟲的半致死率ED50實施例2方法同實施例1，不同之處為將2.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于少量二甲亞砜，配制為1000ppm的水溶液，隨后倍半稀釋，測定ED50(半致死率)和ED90(90％致死率)，待測溶液中二甲亞砜的終濃度不超過3％。
表5 5-甲基-3-呋喃羧酸對P.redivivus線蟲的ED50和ED90濃度ppm4小時 12小時24小時1000 86.5％ 97.3％100％50078.8％ 92.1％100％25067.9％ 75.4％89.6％12545.8％ 60.7％83.4％60 9.34％ 11.3％18.2％30 7.90％ 15.6％17.6％15 6.86％ 10.8％17.3％表6 5-甲基-3-呋喃羧酸對M.arenaria線蟲的ED50和ED90濃度ppm4小時 12小時24小時1000 81.7％ 97.7％100％50068.6％ 87.8％100％25051.5％ 86.5％98.8％
125 23.5％ 45.7％ 64.2％6021.6％ 31.3％ 45.5％3011.7％ 12.8％ 20.9％1510.7％ 13.5％ 15.6％結果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸對M.arenaria線蟲的ED50(半致死率，24hr)為125ppm，ED90(90％致死率，24hr)為250ppm。
表7 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對P.redivivus線蟲的ED50和ED90濃度ppm 4小時 12小時24小時1000 71.2％ 89.4％100％500 60.8％ 76.6％100％250 47.2％ 55.4％72.1％125 33.3％ 40.7％46.9％6011.2％ 12.1％27.6％309.08％ 15.6％19.5％1510.1％ 12.55 18.7％結果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對P.redivivus線蟲的ED50(半致死率，24hr)為250ppm，ED90(90％致死率，24hr)為500pm。
表8 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對M.arenaria線蟲的ED50和ED90濃度ppm4小時 12小時24小時1000 76.5％ 97.3％100％50072.1％ 82.1％100％25065.8％ 65.4％70.8％12534.8％ 47.7％49.4％60 19.2％ 28.3％33.9％30 11.9％ 16.6％28.9％15 11.2％ 10.8％17.3％結果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對M.arenaria線蟲的ED50(半致死率，24hr)為250ppm，ED90(90％致死率，24hr)為500ppm。
實施例3化合物與乳化劑混合對線蟲的毒殺作用實施例3方法同實施例1，不同之處為將0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亞砜，再用0.3％濃度的Tween-20水溶液稀釋，稀釋濃度為500ppm，得具殺線蟲活性物質的乳濁液。在該乳濁液中，二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％。
表9 5-甲基-3-呋喃羧酸乳化制劑對P.redivivus線蟲的毒殺作用重復次數4小時 12小時 24小時1 52.5％ 99.8％ 100％2 62.4％ 98.4％ 100％3 58.6％ 97.8％ 100％結果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸與乳化劑混合后可以提高毒殺P.redivivus線蟲活性，提高率為12-20％。
表10 5-甲基-3-呋喃羧酸乳化制劑對M.arenaria線蟲的毒殺作用重復次數4小時 12小時 24小時1 61.3％ 99.0％ 100％2 62.4％ 98.7％ 100％3 65.8％ 96.7％ 100％結果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸與乳化劑混合后可以提高毒殺M.arenaria線蟲活性，提高率為7-10％。
表11 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮乳化制劑對P.redivivus的毒殺作用重復次數4小時 12小時 24小時1 51.382.41002 52.291.21003 57.680.7100結果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮與乳化劑混合后可以提高毒殺P.redivivus線蟲活性，提高率為7-10％。
表12 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮乳化制劑對M.arenaria的毒殺作用重復次數4小時 12小時 24小時1 72.398.51002 65.291.21003 68.495.8100結果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮與乳化劑混合后可以提高毒殺M.arenaria線蟲活性，提高率為4-6％。
權利要求
1.一類具有毒殺線蟲活性的化合物，由生產菌株和輔料經發酵培養、甲醇提取、反復硅膠柱及氯仿/甲醇洗脫工序后分離得到，其特征在于(1)生產菌株為毛頭鬼傘(Coprinus comatus LHA-7)，LHA-7菌株已于2003年5月26日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.0932；(2)分離得到的化合物經核磁共振波譜，質譜，紅外光譜和紫外光譜確定為5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮，結構式依次為
2.權利要求1所說的化合物，其特征在于(1)5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮作為制備殺線蟲制劑的應用；(2)將0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亞砜，再用Tween-20水溶液稀釋，得具殺線蟲活性物質的乳濁液；乳濁液中，二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％；該乳濁液作為制備殺線蟲制劑的應用。
全文摘要
本發明涉及一類具有毒殺線蟲活性的化合物及其應用，屬微生物生物農藥技術領域。本發明由毛頭鬼傘(Coprinus comatus)LHA－7菌株和輔料經常規工序后分離得到5－甲基－3－呋喃羧酸和5－羥基－3，5－二甲基－2(5H)呋喃酮。5－甲基－3－呋喃羧酸具有顯著的毒殺線蟲活性，對腐生線蟲的ED
文檔編號C12P17/02GK1631885SQ20041004079
公開日2005年6月29日 申請日期2004年9月30日 優先權日2004年9月30日
發明者劉亞君, 張克勤 申請人:云南大學