專利名稱：一種浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法
技術領域：
本發明涉及植物脫毒組培快繁技術領域，尤其涉及一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養方法。
背景技術：
浙貝母(^Wri//fli7'aA""6wg//Miq.)是百合科貝母屬植物，其干燥鱗莖是著名中藥材"浙 八味"之一，是化痰止咳、治療氣管炎、感冒等呼吸道疾病的常用良藥。浙貝母原產象山縣， 故又稱象貝母。據傳清康熙年間，象山農民開始將貝母從野生轉入家種。 一直以來，浙貝母 以磐安、鄞州為主產地，約占全國浙貝母總產量的70%，江蘇、江西、上海、湖北和湖南省 亦有栽培。隨著種植業結構調整的深入，近年來浙江省浙貝母的栽培面積迅速擴大。但在人工栽培中，浙貝母生產由于采用大鱗莖作種，其繁殖系數極低，約為1.6 1.8倍， 用種量極大，用種500kg/畝，種子地下休眠期長，約4個月。浙貝母如此低的繁殖系數和如 此高的耗種量，導致生產用地和留種地面積的增加及生產成本增加。同時，長期的營養繁殖 導致浙貝母種質嚴重退化，鱗莖產量和品質下降，已成為嚴重地阻礙了浙貝母產業的發展的 重要問題之一。近年來的研究揭示，植物病毒的侵染是引起浙貝母種質退化的主要原因之一。 最近我們在浙江磐安縣田間對浙貝母進行調査發現，絕大部分植株均表現花葉和斑駁等典型 的馬鈴薯Y病毒科成員侵染癥狀。通過對該病毒病原的普通生物學、血清學特征和基因組全 序列的研究，結果表明存在二種新的復合侵染， 一種是浙貝母花葉病毒(Thunberg fritillary mosaic Virus, TFMV)，另一種命名為貝母Y病毒(尸ritj77ar/virus Y， FVY)。 該病毒病害普遍發生是引起浙貝母種質嚴重退化的重要原因之一。植物病毒的毒源保存特別是純種毒源保存是抗病毒育種和病毒檢測中制備抗血清及病毒 的基礎研究必備的材料。傳統保存是在溫室內將病毒接種到指示植物或寄主植物上定期轉接 進行保存，工作量大且效果不理想。由于多種病毒毒源植物在裸露的條件下保存在同一溫室 內，易造成混雜；同時需一定的溫室面積，適宜的溫、濕條件，尤其寒區冬季的取暖，耗費 人力、財力大；另外毒源植物在棚室內，易感染雜菌死亡，導致病毒丟失；同時此法保存的 毒源亦不便攜帶和利用。因此，迫切需要選擇一種更佳的保存方法。發明內容本發明要解決上述現有技術的缺陷，提供一種浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法。 本發明目的通過以下技術方案來實現這種浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，按如下步 驟進行1)、浙貝母病毒病原種類的鑒定 (1)取病樣取浙貝母花葉病害病樣，-8(TC儲存備用。(2) 電鏡觀察取病汁液經負染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態。(3) 病毒種類的鑒定利用RT-PCR檢測和鑒定浙貝母的病毒種類。2) 、培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為(1) 基本培養基選用MS培養基，蔗糖或白糖20 40g/L，瓊脂7 9 g/L， pH5. 6 5. 8;(2) 子鱗莖誘導培養基MS+2,4-D 0.5 1.5mg/L和ZT 1 3mg/L+蔗糖或白糖30g/L;(3) 子鱗莖增殖培養基MS+ BA l 3mg /L和NAA 1 3mg/L+蔗糖或白糖40g/L+鹽酸 硫胺素(VB! ) 4mg/L;(4) 壯苗培養基MS+ BA 0. 5 1.5mg /L和NAA 0. 5 1. 5mg/L十蔗糖或白糖40g/L + 鹽酸硫胺素(VB! ) 4mg/L;(5) 子鱗莖保存培養基1/2MS+ BA 0.05 0. lmg /L和NAA 0. 05 0. lmg/L+蔗糖或白 糖20g/L+鹽酸硫胺素(VB! ) 4mg/L;(6) 鱗莖生長培養基:'MS+ BA 0. l lmg /L和NAA 0. 1 lmg/L+蔗糖或白糖40g/L + 鹽酸硫胺素(VBi ) 4mg/L+水解酪蛋白(CH) 500 mg/L;(7) 生根培養基1/2MS+ NAA 0. 1 lmg/L+蔗糖或白糖20g/L+鹽酸硫胺素(VB! ) 4mg/L。3) 、浙貝母脫毒組培鱗莖的培養，按如下步驟進行(1) 外植體的選取與滅菌取浙貝母新生長的鱗莖或嫩莖或花梗為外植體，經滅菌處理， 作為脫毒組培用的外植體；(2) 子鱗莖誘導培養將步驟(1)滅菌處理后的鱗莖或嫩莖或花梗在無菌條件下，切 成0.3 0.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，經1 2個月后，從鱗莖或嫩莖或花梗 外植體上誘導形成子鱗莖；.(3) 子鱗莖增殖培養將步驟(2)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培 養30 45天增殖出子鱗莖；(4) 壯苗培養將步驟(3)增殖的子鱗莖經4'C低溫處理l周，然后培養30 45天后 長成壯苗；(5) 熱處理將步驟(4)長成的壯苗經35i:、 2 4周處理后，供莖尖培養用。(6) 莖尖培養將步驟(5)熱處理過的組培苗在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0. 2 0. 5mra 大小的帶1 2個葉原基的莖尖作為脫毒培養的外植體。(7) 子鱗莖誘導培養將步驟(6)摘出的莖尖接種在子鱗莖誘導培養基上，經1 2個 月后，誘導形成子鱗莖；(8) 子鱗莖增殖培養將步驟(7)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培養30 45天增殖出子鱗莖；每隔30 45天，將步驟10)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培 養基上，培養30 45天再增殖出子鱗莖；(9) 子鱗莖生長培養將步驟(8)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，培養30 45天使鱗莖長大到0. 5 lcm。(10) 生根培養將步彈(9)長大的子鱗莖接種在生根培養基中進行生根培養，20 30 天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數根根系；(11) 移栽當步驟(10)的生根子鱗莖苗高生長至3 5cm以上、根長出5根以上時， 移栽基質培養1 2個月至成苗。(12) 定植將步驟(11)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養6 10個月至植株。4) 、病毒ELISA檢測應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小 鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，供病毒ELISA檢測之用。5) 、病毒摩擦接種按照裘維蕃的方法，將步驟1)分離純化的病毒通過汁液摩擦接種 到步驟4)檢測為無病毒的浙貝母植株上。6) 、病毒的鱗莖保存將步驟5)接種上病毒的浙貝母進行組培鱗莖的培養和保存，按如下步驟進行U)外植體的選取與滅菌取浙貝母新生長的鱗莖或嫩莖或花梗為外植體，經滅菌處理， 作為組培用的外植體；(2) 子鱗莖誘導培養將步驟(1)滅菌處理后的鱗莖或嫩莖或花梗在無菌條件下，切 成0.3 0.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，經1 2個月后，從鱗莖或嫩莖或花梗 外植體上誘導形成子鱗莖；(3) 子鱗莖增殖培養將步驟(2)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培 養30 45天增殖出子鱗莖；每隔30 45天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上， 培養30 45天再增殖出子鱗莖；(4) 子鱗莖保存將步驟(3)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖保存培養基上，保存培養10 12個月，子鱗莖生長緩慢，鱗莖長大0. 3 0. 6cm;每隔10 12個月，將保存的子鱗莖轉接 到新鮮的子鱗莖保存培養基上，繼續進行保存培養；(5) 子鱗莖生長培養將步驟(4)保存的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，培養30 45天使鱗莖長大到0. 5 lcm。(6) 生根培養將步驟(5)長大的子鱗莖接種在生根培養基中進行生根培養，20 30 天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數根根系；(7) 移栽當步驟(6)的生根子鱗莖苗高生長至3 5cm以上、根長出5根以上時，移 栽基質培養1 2個月至成苗。(8) 定植將步驟(7)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養6 10個月至植株。 所述的一種浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的培養基，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為(1) 基本培養基選用MS基本培養基，蔗糖或白糖20 40g/L，瓊脂7 g/L， pH5.8;(2) 子鱗莖誘導培養基MS+2，4-D lmg/L和ZT 2mg/L+蔗糖30g/L;(3) 子鱗莖增殖培養棊MS+BA2mg/L和NAA ^g/L+白糖40g/L+鹽酸硫胺素(VBi ) 4mg/L;(4) 壯苗培養基MS+ BA lmg /L和NAA lmg/L +白糖40g/L +鹽酸硫胺素(VB! ) 4 mg/L;(5) 子鱗莖保存培養基1/2MS+ BA 0. lmg /L和NAAO. lmg/L +蔗糖或白糖20g/L+鹽酸 硫胺素(VB1 ) 4 mg/L;(6) 鱗莖生長培養基MS+ BA 0. 5mg /L和NAA 0. 5mg/L +白糖40g/L +鹽酸硫胺素(VB1 ) 4 mg/L+水解酪蛋白(CH) 500 mg/L;(7) 生根培養基1/2MS+ NAA 0.5mg/L+白糖20g/L+鹽酸硫胺素(VB! ) 4mg/L。 所述的浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的滅菌處理是經體積比75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用重量/體積比0.1%升汞溶液滅菌10 15min，最后用無菌水沖洗3 5次。所述的浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于，所述的各脫毒組培階段的培養條 件是，培養溫度為23土2。C，光照光強為2000 3000 Lx,光照時間為12h/d。所述的浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于，所述的組培鱗莖保存的培養條件 是，培養溫度為8 10'C，光照光強為1000 2000Lx，光照時間為10h/d。所述的浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的移栽基質由泥炭珍珠巖 蛭石按體積比l: 2: l配制而成。本發明的有益效果是-(1) 傳統保存毒源的方法易導致病毒污染混雜及感染雜菌丟失病毒，且保存的毒源不便 攜帶利用。利用浙貝母脫毒組培鱗莖感染提純病毒，再進行浙貝母組培鱗莖保存病毒，克服 了傳統保存的不足，可防止病毒混雜與丟失，且易提取制備高滴度病毒，為抗病毒育種和病 毒檢測抗血清制備中提供高純度的病毒。(2) 毒源浙貝母鱗莖在花盆栽培及用毒源浙貝母組培苗汁液接種指示植物均表現典型的病毒癥狀，說明組培鱗莖保存的病毒有侵染力。(3)利用浙貝母組培鱗莖保存病毒便于攜帶交流，為開展病毒研究提供了方便，降低了 保存成本并提高了保存效果。
具體實施方式
通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明，但本發明的內容并不局限于此。 實施例11) 、浙貝母病毒病原種類的鑒定(1) 取病樣取浙貝母花葉病害病樣，-8(TC儲存備用。(2) 電鏡觀察取病汁液經負染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態。(3) 病毒種類的鑒定:.利用RT-PCR檢測和鑒定浙貝母的病毒種類。2) 、培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為(1) 基本培養基選用MS培養基，蔗糖或白糖20 40g/L，瓊脂7 9g/L， pH5. 6 5. 8;(2) 子鱗莖誘導培養基MS+2，4-D 0. 5 1.5mg/L和ZT 1 3mg/L+蔗糖或白糖30g/L;(3) 子鱗莖增殖培養基MS+ BA l 3mg /L和NAA 1 3mg/L+蔗糖或白糖40g/L+鹽酸 硫胺素(VBi ) 4mg/L;(4) 壯苗培養基MS+ BA 0. 5 1.5mg /L和NAA 0. 5 1. 5mg/L+蔗糖或白糖40g/L + 鹽酸硫胺素(VBi ) 4mg/L;(5) 子鱗莖保存培養基1/2MS+ BA 0. 05 0. lmg /L和NAA 0. 05 0. lmg/L +蔗糖或白 糖20g/L+鹽酸硫胺素(VB! ) 4mg/L;(6) 鱗莖生長培養基MS+ BA 0.1 lmg /L和NAA 0. 1 lmg/L十蔗糖或白糖40g/L + 鹽酸硫胺素(VB! ) 4mg/L+水解酪蛋白(CH) 500 mg/L;(7) 生根培養基1/2MS+ NAA 0. 1 lmg/L+蔗糖或白糖20g/L+鹽酸硫胺素(VBi ) 4mg/L。3) 、浙貝母脫毒組培鱗莖的培養，按如下步驟進行(1) 外植體的選取與滅菌取浙貝母新生長的鱗莖或嫩莖或花梗為外植體，經滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；(2) 子鱗莖誘導培養將步驟(1)滅菌處理后的鱗莖或嫩莖或花梗在無菌條件下，切成0. 3 0. 6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，經1 2個月后，從鱗莖或嫩莖或花梗 外植體上誘導形成子鱗莖；'(3) 子鱗莖增殖培養將步驟(2)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培養30 45天增殖出子鱗莖；(4) 壯苗培養將步驟(3)增殖的子鱗莖經4'C低溫處理l周，然后培養30 45天后 長成壯苗；(5) 熱處理將步驟(4)長成的壯苗經35'C、 2 4周處理后，供莖尖培養用。(6) 莖尖培養將步驟'(5)熱處理過的組培苗在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0. 2 0. 5mra 大小的帶1 2個葉原基的莖尖作為脫毒培養的外植體。(7) 子鱗莖誘導培養將步驟(6)摘出的莖尖接種在子鱗莖誘導培養基上，經1 2個 月后，誘導形成子鱗莖；(8) 子鱗莖增殖培養將步驟(7)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培 養30 45天增殖出子鱗莖；每隔30 45天，將步驟10)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培 養基上，培養30 45天再增殖出子鱗莖；(9) 子鱗莖生長培養將步驟(8)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，培養30 45天使鱗莖長大到0. 5 lcm。(10) 生根培養將步驟(9)長大的子鱗莖接種在生根培養基中進行生根培養，20 30 天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數根根系；(11) 移栽當步驟(10)的生根子鱗莖苗高生長至3 5cm以上、根長出5根以上時， 移栽基質培養1 2個月至成苗。(12) 定植將步驟(11)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養6 10個月至植株。4) 、病毒ELISA檢測應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小 鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，供病毒ELISA檢測之用。5) 、病毒摩擦接種按照裘維蕃的方法，將步驟1)分離純化的病毒通過汁液摩擦接種 到步驟4)檢測為無病毒的浙貝母植株上。6) 、病毒的鱗莖保存將步驟5)接種上病毒的浙貝母進行組培鱗莖的培養和保存，按如下步驟進行(1) 外植體的選取與滅菌取浙貝母新生長的鱗莖或嫩莖或花梗為外植體，經滅菌處理， 作為組培用的外植體；(2) 子鱗莖誘導培養將步驟(1)滅菌處理后的鱗莖或嫩莖或花梗在無菌條件下，切成0.3 0.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，經1 2個月后，從鱗莖或嫩莖或花梗 外植體上誘導形成子鱗莖；(3) 子鱗莖增殖培養將步驟(2)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培養30 45天增殖出子鱗莖；每隔30 45天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上， 培養30 45天再增殖出子鱗莖；(4) 子鱗莖保存將步驟(3)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖保存培養基上，保存培養10 12個月，子鱗莖生長緩慢，鱗莖長大0. 3 0. 6cm;每隔10 12個月，將保存的子鱗莖轉接 到新鮮的子鱗莖保存培養基上，繼續進行保存培養；(5) 子鱗莖生長培養將步驟(4)保存的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，培養30 45天使鱗莖長大到0.5 lcm。(6) 生根培養將步驟(5)長大的子鱗莖接種在生根培養基中進行生根培養，20 30 天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數根根系；(7) 移栽當步驟(6)的生根子鱗莖苗高生長至3 5cm以上、根長出5根以上時，移 栽基質培養1 2個月至成苗。(8) 定植將步驟(7)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養6 10個月至植株。 所述的滅菌處理是經體積比75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用重量/體積比0.1%升汞溶液滅菌10 15min，最后用無菌水沖洗3 5次。所述的各脫毒組培階段的培養條件是，培養溫度為23士2。C，光照光強為2000 3000Lx， 光照時間為12h/d。所述的組培鱗莖保存的培養條件是，培養溫度為8 10。C，光照光強為1000 2000Lx， 光照時間為10h/d。所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l: 2: 1配制而成。實施例2:1) 、浙貝母病毒病原種類的鑒定(1) 取病樣取浙貝母花葉病害病樣，-8(TC儲存備用。(2) 電鏡觀察取病汁液經負染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態。(3) 病毒種類的鑒定利用RT-PCR檢測和鑒定浙貝母的病毒種類。2) 、培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為(1) 基本培養基選用MS基本培養基，蔗糖或白糖20 40g/L,瓊脂7 g/L， pH5.8;(2) 子鱗莖誘導培養基MS+2，4-D lmg/L和ZT 2mg/L+蔗糖30g/L;(3) 子鱗莖增殖培養基MS+ BA 2mg /L和NAA 2mg/L+白糖40g/L +鹽酸硫胺素(VB!) 4 mg/L;(4) 壯苗培養基MS+ BA lmg /L和NAA lmg/L +白糖40g/L +鹽酸硫胺素(VB! ) 4 mg/L;(5) 子鱗莖保存培養基1/2MS+ BA 0. lmg /L和NAAO. lmg/L +蔗糖或白糖20g/L+鹽酸 硫胺素(VBl ) 4 mg/L;(6) 鱗莖生長培養基MS+ BA 0. 5mg /L和NAA 0. 5mg/L +白糖40g/L +鹽酸硫胺素(VBl ) 4 mg/L+水解酪蛋白(CH) 500 mg/L;(7) 生根培養基1/2MS+ NAA 0.5mg/L+白糖20g/L+鹽酸硫胺素(VB! ) 4mg/L。3) 、浙貝母脫毒組培鱗莖的培養，按如下步驟進行(1) 外植體的選取與滅菌取浙貝母新生長的鱗莖或嫩莖或花梗為外植體，經滅菌處理， 作為脫毒組培用的外植體；(2) 子鱗莖誘導培養將步驟(1)滅菌處理后的鱗莖或嫩莖或花梗在無菌條件下，切 成0.3 0.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，經1 2個月后，從鱗莖或嫩莖或花梗 外植體上誘導形成子鱗莖；(3) 子鱗莖增殖培養將步驟(2)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培 養30 45天增殖出子鱗莖；(4) 壯苗培養將步驟(3)增殖的子鱗莖經4t低溫處理l周，然后培養30 45天后 長成壯苗；(5) 熱處理將步驟(4)長成的壯苗經35'C、 2 4周處理后，供莖尖培養用。(6) 莖尖培養將步驟(5)熱處理過的組培苗在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0. 2 0. 5ram 大小的帶1 2個葉原基的莖尖作為脫毒培養的外植體。(7) 子鱗莖誘導培養將步驟(6)摘出的莖尖接種在子鱗莖誘導培養基上，經1 2個 月后，誘導形成子鱗莖；'(8) 子鱗莖增殖培養將步驟(7)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培 養30 45天增殖出子鱗莖；每隔30 45天，將步驟10)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培 養基上，培養30 45天再增殖出子鱗莖；(9) 子鱗莖生長培養將步驟(8)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，培養30 45天使鱗莖長大到0. 5 lcm。(10) 生根培養將步驟(9)長大的子鱗莖接種在生根培養基中進行生根培養，20 30 天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數根根系；(11) 移栽當步驟(10)的生根子鱗莖苗高生長至3 5cm以上、根長出5根以上時， 移栽基質培養1 2個月至成苗。(12) 定植將步驟(11)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養6 10個月至植株。4) 、病毒ELISA檢測應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小 鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，供病毒ELISA檢測之用。5) 、病毒摩擦接種按照裘維蕃的方法，將步驟1)分離純化的病毒通過汁液摩擦接種到步驟4)檢測為無病毒的浙貝母植株上。6) 、病毒的鱗莖保存將步驟5)接種上病毒的浙貝母進行組培鱗莖的培養和保存，按如下步驟進行(1) 外植體的選取與滅菌取浙貝母新生長的鱗莖或嫩莖或花梗為外植體，經滅菌處理，作為組培用的外植體；(2) 子鱗莖誘導培養將步驟(1)滅菌處理后的鱗莖或嫩莖或花梗在無菌條件下，切 成0. 3 0. 6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，經1 2個月后，從鱗莖或嫩莖或花梗 外植體上誘導形成子鱗莖；(3) 子鱗莖增殖培養將步驟(2)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培 養30 45天增殖出子鱗莖;.每隔30 45天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上， 培養30 45天再增殖出子鱗莖；(4) 子鱗莖保存將步驟(3)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖保存培養基上，保存培養10 12個月，子鱗莖生長緩慢，鱗莖長大0. 3 0. 6cm;每隔10 12個月，將保存的子鱗莖轉接到新鮮的子鱗莖保存培養基上，繼續進行保存培養；(5) 子鱗莖生長培養將步驟(4)保存的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，培養30 45天使鱗莖長大到0. 5 lcm。(6) 生根培養將步驟(5)長大的子鱗莖接種在生根培養基中進行生根培養，20 30 天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數根根系；(7) 移栽當步驟(6)的生根子鱗莖苗高生長至3 5cm以上、根長出5根以上時，移 栽基質培養1 2個月至成苗。(8) 定植將步驟(7)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養6 10個月至植株。 所述的滅菌處理是經體積比75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用重量/體積比0.1%升汞溶液滅菌10 15min，最后用無菌水沖洗3 5次。所述的各脫毒組培階段的培養條件是，培養溫度為23土2。C，光照光強為2000 3000 Lx， 光照時間為12h/d。所述的組培鱗莖保存的培養條件是，培養溫度為8 1(TC，光照光強為1000 2000Lx， 光照時間為10h/d。所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l: 2: 1配制而成。試驗例(病毒檢測)1、 對照材料從田間采集的浙貝母病葉為材料。2、 處理材料以實施例1或實施例2獲得的脫毒組培鱗莖和保存的帶病毒組培鱗莖為材料。3、 病毒ELISA檢測應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，供病毒ELISA檢測之用。4、 檢測結果如下表所示處理檢測的結果對照陽性保存的帶病毒組培鱗莖陽性脫毒組培鱗莖陰性
權利要求
1、一種浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于該方法按以下步驟進行1)、浙貝母病毒病原種類的鑒定2)、培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養基選用MS培養基，蔗糖或白糖20～40g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～5.8；(2)子鱗莖誘導培養基MS+2，4-D 0.5～1.5mg/L和ZT 1～3mg/L+蔗糖或白糖30g/L；(3)子鱗莖增殖培養基MS+BA 1～3mg/L和NAA 1～3mg/L+蔗糖或白糖40g/L+鹽酸硫胺素(VB1)4mg/L；(4)壯苗培養基MS+BA 0.5～1.5mg/L和NAA 0.5～1.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L+鹽酸硫胺素(VB1)4mg/L；(5)子鱗莖保存培養基1/2MS+BA 0.05～0.1mg/L和NAA 0.05～0.1mg/L+蔗糖或白糖20g/L+鹽酸硫胺素(VB1)4mg/L；(6)鱗莖生長培養基MS+BA 0.1～1mg/L和NAA 0.1～1mg/L+蔗糖或白糖40g/L+鹽酸硫胺素(VB1)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L；(7)生根培養基1/2MS+NAA 0.1～1mg/L+蔗糖或白糖20g/L+鹽酸硫胺素(VB1)4mg/L；3)、浙貝母脫毒組培鱗莖的培養，按如下步驟進行(1)外植體的選取與滅菌取浙貝母新生長的鱗莖或嫩莖或花梗為外植體，經滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；(2)子鱗莖誘導培養將步驟(1)滅菌處理后的鱗莖或嫩莖或花梗在無菌條件下，切成0.3～0.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，經1～2個月后，從鱗莖或嫩莖或花梗外植體上誘導形成子鱗莖；(3)子鱗莖增殖培養將步驟(2)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培養30～45天增殖出子鱗莖；(4)壯苗培養將步驟(3)增殖的子鱗莖經4℃低溫處理1周，然后培養30～45天后長成壯苗；(5)熱處理將步驟(4)長成的壯苗經35℃、2～4周處理后，供莖尖培養用；(6)莖尖培養將步驟(5)熱處理過的組培苗在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0.2～0.5mm大小的帶1～2個葉原基的莖尖作為脫毒培養的外植體；(7)子鱗莖誘導培養將步驟(6)摘出的莖尖接種在子鱗莖誘導培養基上，經1～2個月后，誘導形成子鱗莖；(8)子鱗莖增殖培養將步驟(7)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培養30～45天增殖出子鱗莖；每隔30～45天，將步驟10)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培養30～45天再增殖出子鱗莖；(9)子鱗莖生長培養將步驟(8)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，培養30～45天使鱗莖長大到0.5～1cm；(10)生根培養將步驟(9)長大的子鱗莖接種在生根培養基中進行生根培養，20～30天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數根根系；(11)移栽當步驟(10)的生根子鱗莖苗高生長至3～5cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養1～2個月至成苗；(12)定植將步驟(11)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養6～10個月至植株4)、病毒ELISA檢測應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，供病毒ELISA檢測之用；5)、病毒摩擦接種按照裘維蕃的方法，將步驟1)分離純化的病毒通過汁液摩擦接種到步驟4)檢測為無病毒的浙貝母植株上；6)、病毒的鱗莖保存將步驟5)接種上病毒的浙貝母進行組培鱗莖的培養和保存，按如下步驟進行(1)外植體的選取與滅菌取浙貝母新生長的鱗莖或嫩莖或花梗為外植體，經滅菌處理，作為組培用的外植體；(2)子鱗莖誘導培養將步驟(1)滅菌處理后的鱗莖或嫩莖或花梗在無菌條件下，切成0.3～0.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，經1～2個月后，從鱗莖或嫩莖或花梗外植體上誘導形成子鱗莖；(3)子鱗莖增殖培養將步驟(2)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培養30～45天增殖出子鱗莖；每隔30～45天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，培養30～45天再增殖出子鱗莖；(4)子鱗莖保存將步驟(3)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖保存培養基上，保存培養10～12個月，子鱗莖生長緩慢，鱗莖長大0.3～0.6cm；每隔10～12個月，將保存的子鱗莖轉接到新鮮的子鱗莖保存培養基上，繼續進行保存培養；(5)子鱗莖生長培養將步驟(4)保存的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，培養30～45天使鱗莖長大到0.5～1cm；(6)生根培養將步驟(5)長大的子鱗莖接種在生根培養基中進行生根培養，20～30天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數根根系；(7)移栽當步驟(6)的生根子鱗莖苗高生長至3～5cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養1～2個月至成苗；(8)定植將步驟(7)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養6～10個月至植株。
2、 根據權利要求1所述的浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的培養基， 包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為(1) 基本培養基選用MS基本培養基，蔗糖或白糖20 40g/L，瓊脂7 g/L， pH5. 8;(2) 子鱗莖誘導培養基MS+2，4-D lmg/L和ZT 2mg/L+蔗糖30g/L;(3) 子鱗莖增殖培養基MS+BA2mg/L和NAA 2mg/L+白糖40g/L+鹽酸硫胺素(VB!) 4mg/U(4) 壯苗培養基MS+ BA lmg /L和NAA lmg/L +白糖40g/L +鹽酸硫胺素(VB! )4 mg/L;(5) 子鱗莖保存培養基1/2MS+ BA 0. lmg /L和NAAO. lmg/L +蔗糖或白糖20g/L+鹽酸 硫胺素(VB1 ) 4 mg/U(6) 鱗莖生長培養基'MS+ BA 0. 5mg /L和NAA 0. 5mg/L +白糖40g/L +鹽酸硫胺素(VB1 ) 4 mg/L+水解酪蛋白(CH) 500 mg/L;(7) 生根培養基1/2MS+ NAA 0.5mg/L+白糖20g/L+鹽酸硫胺素(VB! ) 4mg/L。
3、 根據權利要求1所述的浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的滅菌處 理是經體積比75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用重量/體積比0.1%升汞溶液滅菌10 15min, 最后用無菌水沖洗3 5次。
4、 根據權利要求1所述的浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于，所述的各脫毒 組培階段的培養條件是，培養溫度為23±2°C ，光照光強為2000 3000 Lx，光照時間為12h/d。
5、 根據權利要求1所述的浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于，所述的組培鱗 莖保存的培養條件是，培養溫度為8 10'C，光照光強為1000 2000Lx，光照時間為10h/d。
6、 根據權利要求1所述的浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l: 2: 1配制而成。
7、 根據權利要求1所述的浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的浙貝母 病毒病原種類的鑒定包括如下步驟(1) 取病樣取浙貝母花葉病害病樣，-8(TC儲存備用；(2) 電鏡觀察取病汁液經負染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態；(3) 病毒種類的鑒定利用RT-PCR檢測和鑒定浙貝母的病毒種類。
全文摘要
本發明涉及一種浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，屬植物病毒保存技術領域，包括如下步驟病毒病原種類的鑒定、培養基的配制、脫毒組培鱗莖的培養、病毒ELISA檢測、病毒摩擦接種、病毒的鱗莖保存。本發明的優點是利用浙貝母脫毒組培鱗莖感染提純病毒，再進行浙貝母組培鱗莖保存病毒，克服了傳統保存的不足，可防止病毒混雜與丟失，且易提取制備高滴度病毒，為抗病毒育種和病毒檢測抗血清制備中提供高純度的病毒，降低了保存成本并提高了保存效果，并便于攜帶交流。
文檔編號C12N7/00GK101215550SQ20081005930
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月16日 優先權日2008年1月16日
發明者呂永平, 剛 徐, 林 林, 汪一婷, 牟豪杰, 曄 程, 鄭紅英, 陳劍平 申請人:浙江省農業科學院