專利名稱：：一種洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及植物脫毒組培快繁
技術領域：
，尤其涉及一種洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法。
背景技術：
：洋水仙(A^r/M")是從歐洲引入我國的水仙新品種的統(tǒng)稱，為石蒜科水仙屬多年生草本植物。20世紀80年代后進行較大規(guī)模的引入,主要用于春季花展，少量盆栽作為年宵花使用。洋水仙與中國水仙相比，具有花大色艷，清香宜人等特點；大部分品種副花冠成喇叭狀，且以黃色為多，因而又泛稱為"喇叭水仙"或"黃水仙"。洋水仙是優(yōu)良的園林地被花丼，可以盆栽觀賞和切花使用。洋水仙一般通過分蘗的子球進行繁殖，每個母鱗莖可分蘗24個小鱗莖。但是，由于病毒侵染導致逐年退化，鱗莖變小，開花能力下降。浙江省農(nóng)業(yè)科學院從英國引進洋水仙新品種，擬通過脫毒組培技術大量繁殖脫毒鱗莖，以滿足國內市場需要，同時克服病毒的危害和蔓延。我們在從英國引進栽培于溫室的洋水仙中發(fā)現(xiàn)，絕大部分植株均表現(xiàn)花葉和斑駁等癥狀。通過對病毒病原的普通生物學、血清學特征和基因組全序列的研究，鑒定了侵染水仙的主要線狀病毒有4個屬的8個成員，包括馬鈴薯Y病毒屬(genusPotyvirus)水仙黃條病毒(Narcissusyellowstripevirus,NYSV),水仙遲季黃化病毒(Narcissuslateseasonyellowsvirus，NLSYV),TK仙退化病毒(Narcissusdegenerationvirus,NDV),虎眼萬年青花葉病毒(Ornithogalummosaicvirus,OrMV)，香石竹潛隱病毒屬(genusCarlavirus)水仙普通潛隱病毒(Narcissuscommonlatentvirus,NCLV)，水仙無癥病毒(Narcissussymptomlessvirus,NSV)，柘橙病毒屬(genusMacluravirus)zK仙潛隱病毒(Narcissuslatentvirus，NLV)，馬鈴薯X病毒屬(genusPotexvirus)zK仙花葉病毒(Narcissusmosaicvirus,NMV)等8種病毒。這8種病毒單獨或復合侵染是引起洋水仙種質嚴重退化的重要原因之一。植物病毒的毒源保存特別是純種毒源保存是抗病毒育種和病毒檢測中制備抗血清及病毒的基礎研究必備的材料。傳統(tǒng)保存是在溫室內將病毒接種到指示植物或寄主植物上定期轉接進行保存，工作量大且效果不理想。由于多種病毒毒源植物在裸露的條件下保存在同一溫室內，易造成混雜；同時需一定的溫室面積，適宜的溫、濕條件，尤其寒區(qū)冬季的取暖，耗費人力、財力大；另外毒源植物在棚室內，易感染雜菌死亡，導致病毒丟失；同時此法保存的毒源亦不便攜帶和利用。因此，迫切需要選擇一種更佳的保存方法。
發(fā)明內容本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法。本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)這種洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，按如下步驟進行1)、洋水仙病毒病原種類的鑒定(1)取病樣取洋水仙花葉病害病樣，-8(TC儲存?zhèn)溆谩?2)電鏡觀察取病汁液經(jīng)負染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)。(3)病毒的提純利用差速離心和蔗糖階梯式密度離心的分離法，對感染葉片的有關病毒進行分離、純化。(4)病毒種類的鑒定利用RT-PCR檢測和鑒定洋水仙的病毒種類。2)、培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養(yǎng)基:選用MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖2040g/L，瓊脂79g/L，pH5.65.8;(2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基MS+BA0.1lmg/L和NAA0.050.5mg/L十蔗糖或白糖30g/L;(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基MS+BA0.050.5mg/L和NAA0.1lmg/L+蔗糖或白糖40g/L;(4)子鱗莖保存培養(yǎng)基1/2MS+BA0.010.lmg/L和NAA0.050.5mg/L+庶糖或白糖20g/L;(5)鱗莖生長培養(yǎng)基MS+BA0.010.lmg/L和NAA0.050.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L;(6)生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.10.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L。3)、洋水仙脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)，按如下步驟進行(1)鱗莖低溫處理鱗莖經(jīng)8'C低溫處理24周。(2)鱗莖萌芽將步驟(1)低溫處理過的鱗莖放在25'C培養(yǎng)室內培養(yǎng)12周，使鱗莖快速萌芽。(3)外植體的選取與滅菌取步驟(2)35cm的新芽為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；(4)莖尖培養(yǎng)將步驟(3)滅菌處理后的幼芽在無菌條件下，在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0.20.3腿大小的帶12個葉原基的莖尖，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，經(jīng)12個月后，從莖尖誘導形成幼芽或子鱗莖；(5)子鱗莖增殖培養(yǎng)將步驟(4)誘導形成的幼芽或子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天增殖出子鱗莖；每隔3045天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天再增殖出子鱗莖；(6)子鱗莖生長培養(yǎng)將步驟(5)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天使鱗莖長大到0.5lcm;(7)生根培養(yǎng)將步驟(6)長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，2030天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數(shù)根根系；(8)移栽當步驟(7)的生根子鱗莖苗高生長至35cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養(yǎng)12個月至成苗。(9)定植將步驟(8)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養(yǎng)610個月至植株。4)、病毒ELISA檢測應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，對步驟3)的洋水仙植株進行病毒ELISA檢測。5)、病毒摩擦接種按照裘維蕃的方法，將步驟1)分離純化的病毒通過汁液摩擦接種到步驟4)檢測為無病毒的洋水仙植株上。6)、病毒的鱗莖保存將步驟5)接種上病毒的洋水仙進行組培鱗莖的培養(yǎng)和保存，按如下步驟進行(1)鱗莖低溫處理鱗莖經(jīng)8'C低溫處理24周。(2)鱗莖萌芽將步驟(1)低溫處理過的鱗莖放在25'C培養(yǎng)室內培養(yǎng)12周，使鱗莖快速萌芽。(3)外植體的選取與滅菌取步驟(2)35cm的新芽為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為組培用的外植體；(4)幼芽培養(yǎng)將步驟(3)滅菌處理后的幼芽在無菌條件下，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，經(jīng)12個月后，誘導形成子鱗莖；(5)子鱗莖增殖培養(yǎng)將步驟(4)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天增殖出子鱗莖；每隔3045天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天再增殖出子鱗莖；(6)子鱗莖保存將步驟(5)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖保存培養(yǎng)基上，子鱗莖生長緩慢，保存培養(yǎng)1012個月，鱗莖長大到0.5lcm;(7)子鱗莖生長培養(yǎng)將步驟(6)保存的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天使鱗莖長出葉片；(8)生根培養(yǎng)將步驟(7)長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，2030天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數(shù)根根系；(9)移栽當步驟(8)的生根子鱗莖苗高生長至35cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養(yǎng)12個月至成苗。(10)定植將步驟(9)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養(yǎng)610個月至植株。所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養(yǎng)基:選用MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖2040g/L，瓊脂79g/L，pH5.65.8;(2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L和NAA0.lmg/L+蔗糖30g/L;(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基MS+BA0.lmg/L和NAA0.5mg/L+白糖40g/L;(4)子鱗莖保存培養(yǎng)基1/2MS+BAO.Olmg/L和NAA0.05mg/L十蔗糖或白糖20g/L;(5)鱗莖生長培養(yǎng)基MS+BA0,05mg/L和NAA0.lmg/L+白糖40g/L;(6)生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.25mg/L+白糖20g/L。所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的滅菌處理是經(jīng)體積比75%酒精浸泡0.51.0min,再用重量/體積比0.1%升汞溶液滅菌1015min，最后用無菌水沖洗35次。所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于，所述的各脫毒組培階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25土2'C，光照光強為IOOO2500Lx，光照時間為10h/d。所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于，所述的組培鱗莖保存的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為10土2'C，光照光強為5001000Lx，光照時間為8h/d。所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l:2:2配制而成。本發(fā)明的有益效果是(1)傳統(tǒng)保存毒源的方法易導致病毒污染混雜及感染雜菌丟失病毒，且保存的毒源不便攜帶利用。利用洋水仙脫毒組培鱗莖感染提純病毒，再進行洋水仙組培鱗莖保存病毒，克服了傳統(tǒng)保存的不足，可防止病毒混雜與丟失，且易提取制備高滴度病毒，為抗病毒育種和病毒檢測抗血清制備中提供高純度的病毒。(2)毒源洋水仙鱗莖在花盆栽培及用毒源洋水仙組培苗汁液接種指示植物均表現(xiàn)典型的病毒癥狀，說明組培鱗莖保存的病毒有侵染力。(3)利用洋水仙組培鱗莖保存病毒便于攜帶交流，為開展病毒研究提供了方便，降低了保存成本并提高了保存效果。具體實施方式通過以下實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明的內容并不局限于此。實施例1:1)、洋水仙病毒病原種類的鑒定(1)取病樣取洋水仙花葉病害病樣，-8(TC儲存?zhèn)溆谩?2)電鏡觀察取病汁液經(jīng)負染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)。(3)病毒的提純利用差速離心和蔗糖階梯式密度離心的分離法，對感染葉片的有關病毒進行分離、純化。(4)病毒種類的鑒定利用RT-PCR檢測和鑒定洋水仙的病毒種類。2)、培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖2040g/L，瓊脂79g/L，pH5.65.8;(2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基MS+BA0.llmg/L和NAA0.050.5mg/L十蔗糖或白糖30g/L;(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基MS+BA0.050.5mg/L和NAA0.1lmg/L十蔗糖或白糖40g/L;(4)子鱗莖保存培養(yǎng)基1/2MS+BA0.010.lmg/L和NAA0.050.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L;(5)鱗莖生長培養(yǎng)基^5+BA0.010.lmg/L和NAA0.050.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L;(6)生根培養(yǎng)基1/2.MS+NAA0.10.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L。3)、洋水仙脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)，按如下步驟進行(1)鱗莖低溫處理鱗莖經(jīng)8'C低溫處理24周。(2)鱗莖萌芽將步驟(1)低溫處理過的鱗莖放在25'C培養(yǎng)室內培養(yǎng)12周，使鱗莖快速萌芽。(3)外植體的選取與滅菌取步驟(2)35cm的新芽為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；(4)莖尖培養(yǎng)將步驟(3)滅菌處理后的幼芽在無菌條件下，在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0.20.3mm大小的帶12個葉原基的莖尖，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，經(jīng)12個月后，從莖尖誘導形成幼芽或，鱗莖；(5)子鱗莖增殖培養(yǎng)將步驟(4)誘導形成的幼芽或子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天增殖出子鱗莖；每隔3045天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天再增殖出子鱗莖；(6)子鱗莖生長培養(yǎng)將步驟(5)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天使鱗莖長大到0.5lcm;(7)生根培養(yǎng)將步驟(6)長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，2030天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數(shù)根根系；(8)移栽當步驟(7)的生根子鱗莖苗高生長至35cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養(yǎng)12個月至成苗。(9)定植將步驟(8)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養(yǎng)610個月至植株。4)、病毒ELISA檢測應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，對步驟3)的洋水仙植株進行病毒ELISA檢測。5)、病毒摩擦接種按照裘維蕃的方法，將步驟1)分離純化的病毒通過汁液摩擦接種到步驟4)檢測為無病毒的洋水仙植株上。6)、病毒的鱗莖保存將步驟5)接種上病毒的洋水仙進行組培鱗莖的培養(yǎng)和保存，按如下步驟進行(1)鱗莖低溫處理鱗莖經(jīng)8。C低溫處理24周。(2)鱗莖萌芽將步驟(1)低溫處理過的鱗莖放在25-C培養(yǎng)室內培養(yǎng)12周，使鱗莖快速萌芽。(3)外植體的選取與滅菌取步驟(2)35cm的新芽為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為組培用的外植體；(4)幼芽培養(yǎng)將步驟(3)滅菌處理后的幼芽在無菌條件下，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，經(jīng)12個月后，誘導形成子鱗莖；(5)子鱗莖增殖培養(yǎng):'將步驟(4)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天增殖出子鱗莖；每隔3045天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天再增殖出子鱗莖；(6)子鱗莖保存將步驟(5)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖保存培養(yǎng)基上，子鱗莖生長緩慢，保存培養(yǎng)1012個月，鱗莖長大到0.5lcm;(7)子鱗莖生長培養(yǎng)將步驟(6)保存的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天使鱗莖長出葉片；(8)生根培養(yǎng)將步驟(7)長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，2030天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數(shù)根根系；(9)移栽當步驟(8)的生根子鱗莖苗高生長至35cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養(yǎng)12個月至成苗。(10)定植將步驟(9)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養(yǎng)610個月至植株。所述的滅菌處理是經(jīng)體積比75%酒精浸泡0.51.0min，再用重量/體積比0.1%升汞溶液滅菌1015min，最后用無菌水沖洗35次。所述的各脫毒組培階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25土2X:，光照光強為10002500Lx，光照時間為10h/d。所述的組培鱗莖保存的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為10土2'C，光照光強為5001000Lx，光照時間為8h/d。所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l:2:2配制而成。實施例2:1)、洋水仙病毒病原種類的鑒定(1)取病樣取洋水仙花葉病害病樣，-8(TC儲存?zhèn)溆谩?2)電鏡觀察取病汁液經(jīng)負染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)。(3)病毒的提純利用差速離心和蔗糖階梯式密度離心的分離法，對感染葉片的有關病毒進行分離、純化。(4)病毒種類的鑒定利用RT-PCR檢測和鑒定洋水仙的病毒種類。2)、培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養(yǎng)基:選用MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖2040g/L，瓊脂79g/L，pH5.65.8;(2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L和NAA0.lrag/L+蔗糖30g/L;(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基MS+BA0.lmg/L和NAA0.5mg/L+白糖40g/L;(4)子鱗莖保存培養(yǎng)基1/2MS+BA0.Olmg/L和NAA0.05mg/L+蔗糖或白糖20g/L;(5)鱗莖生長培養(yǎng)基MS+BA0.05mg/L和NAA0.lmg/L+白糖40g/L;(6)生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.25mg/L+白糖20g/L。3)、洋水仙脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)，按如下步驟進行(1)鱗莖低溫處理鱗莖經(jīng)8'C低溫處理24周。(2)鱗莖萌芽將步驟(1)低溫處理過的鱗莖放在25-C培養(yǎng)室內培養(yǎng)12周，使鱗莖快速萌芽。(3)外植體的選取與滅菌取步驟(2)35cm的新芽為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；(4)莖尖培養(yǎng)將步驟(3)滅菌處理后的幼芽在無菌條件下，在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0.20.3mm大小的帶l2個葉原基的莖尖，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，經(jīng)12個月后，從莖尖誘導形成幼芽或.子鱗莖；(5)子鱗莖增殖培養(yǎng)將步驟(4)誘導形成的幼芽或子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天增殖出子鱗莖；每隔3045天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天再增殖出子鱗莖；(6)子鱗莖生長培養(yǎng)將步驟(5)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天使鱗莖長大到0.5lcm;(7)生根培養(yǎng)將步驟(6)長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，2030天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數(shù)根根系；(8)移栽當步驟(7)的生根子鱗莖苗高生長至35cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養(yǎng)12個月至成苗。(9)定植將步驟(8)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養(yǎng)610個月至植株。4)、病毒ELISA檢測應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，對步驟3)的洋水仙植株進行病毒ELISA檢測。5)、病毒摩擦接種按照裘維蕃的方法，將步驟1)分離純化的病毒通過汁液摩擦接種到步驟4)檢測為無病毒的洋水仙植株上。6)、病毒的鱗莖保存將步驟5)接種上病毒的洋水仙進行組培鱗莖的培養(yǎng)和保存，按如下步驟進行(1)鱗莖低溫處理鱗莖經(jīng)8'C低溫處理24周。(2)鱗莖萌芽將步驟(1)低溫處理過的鱗莖放在25T:培養(yǎng)室內培養(yǎng)12周，使鱗莖快速萌芽。(3)外植體的選取與滅菌取步驟(2)35cm的新芽為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為組培用的外植體；(4)幼芽培養(yǎng)將步驟(3)滅菌處理后的幼芽在無菌條件下，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，經(jīng)12個月后，誘導形成子鱗莖；(5)子鱗莖增殖培養(yǎng)將步驟(4)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天增殖出子鱗莖；每隔3045天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天再增殖出子鱗莖；(6)子鱗莖保存將步驟(5)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖保存培養(yǎng)基上，子鱗莖生長緩慢，保存培養(yǎng)1012個月，鱗莖長大到0.5lcm;(7)子鱗莖生長培養(yǎng)將步驟(6)保存的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3045天使鱗莖長出葉片；(8)生根培養(yǎng)將步驟(7)長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，2030天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數(shù)根根系；(9)移栽當步驟(8)的生根子鱗莖苗高生長至35cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養(yǎng)12個月至成苗。(10)定植將步驟(9)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養(yǎng)610個月至植株。所述的滅菌處理是經(jīng)體積比75%酒精浸泡0.51.0min，再用重量/體積比0.1%升汞溶液滅菌1015min，最后用無菌水沖洗35次。所述的各脫毒組培階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25土2。C,光照光強為10002500Lx，光照時間為10h/d。所述的組培鱗莖保存的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為10土2'C，光照光強為5001000Lx,光照時間為8h/d。所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l:2:2配制而成。試驗例(病毒檢測)1、對照材料從田間采集的洋水仙病葉為材料。2、處理材料以實施例1或實施例2獲得的脫毒組培鱗莖和保存的帶病毒組培鱗莖為材料。3、病毒ELISA檢測應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，供病毒ELISA檢測之用。4、檢測結果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權利要求1、一種洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于該方法按以下步驟進行1)、洋水仙病毒病原種類的鑒定2)、培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖20～40g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～5.8；(2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基MS+BA0.1～1mg/L和NAA0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基MS+BA0.05～0.5mg/L和NAA0.1～1mg/L+蔗糖或白糖40g/L；(4)子鱗莖保存培養(yǎng)基1/2MS+BA0.01～0.1mg/L和NAA0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L；(5)鱗莖生長培養(yǎng)基MS+BA0.01～0.1mg/L和NAA0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L；(6)生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L；3)、洋水仙脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)，按如下步驟進行(1)鱗莖低溫處理鱗莖經(jīng)8℃低溫處理2～4周；(2)鱗莖萌芽將步驟(1)低溫處理過的鱗莖放在25℃培養(yǎng)室內培養(yǎng)1～2周，使鱗莖快速萌芽；(3)外植體的選取與滅菌取步驟(2)3～5cm的新芽為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；(4)莖尖培養(yǎng)將步驟(3)滅菌處理后的幼芽在無菌條件下，在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0.2～0.3mm大小的帶1～2個葉原基的莖尖，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，經(jīng)1～2個月后，從莖尖誘導形成幼芽或子鱗莖；(5)子鱗莖增殖培養(yǎng)將步驟(4)誘導形成的幼芽或子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天增殖出子鱗莖；每隔30～45天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天再增殖出子鱗莖；(6)子鱗莖生長培養(yǎng)將步驟(5)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天使鱗莖長大到0.5～1cm；(7)生根培養(yǎng)將步驟(6)長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，20～30天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數(shù)根根系；(8)移栽當步驟(7)的生根子鱗莖苗高生長至3～5cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養(yǎng)1～2個月至成苗；(9)定植將步驟(8)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養(yǎng)6～10個月至植株；4)、病毒ELISA檢測應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，對步驟3)的洋水仙植株進行病毒ELISA檢測；5)、病毒摩擦接種按照裘維蕃的方法，將步驟1)分離純化的病毒通過汁液摩擦接種到步驟4)檢測為無病毒的洋水仙植株上；6)、病毒的鱗莖保存將步驟5)接種上病毒的洋水仙進行組培鱗莖的培養(yǎng)和保存，按如下步驟進行(1)鱗莖低溫處理鱗莖經(jīng)8℃低溫處理2～4周；(2)鱗莖萌芽將步驟(1)低溫處理過的鱗莖放在25℃培養(yǎng)室內培養(yǎng)1～2周，使鱗莖快速萌芽；(3)外植體的選取與滅菌取步驟(2)3～5cm的新芽為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為組培用的外植體；(4)幼芽培養(yǎng)將步驟(3)滅菌處理后的幼芽在無菌條件下，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，經(jīng)1～2個月后，誘導形成子鱗莖；(5)子鱗莖增殖培養(yǎng)將步驟(4)誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天增殖出子鱗莖；每隔30～45天，將增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天再增殖出子鱗莖；(6)子鱗莖保存將步驟(5)增殖的子鱗莖轉接到子鱗莖保存培養(yǎng)基上，子鱗莖生長緩慢，保存培養(yǎng)10～12個月，鱗莖長大到0.5～1cm；(7)子鱗莖生長培養(yǎng)將步驟(6)保存的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天使鱗莖長出葉片；(8)生根培養(yǎng)將步驟(7)長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，20～30天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數(shù)根根系；(9)移栽當步驟(8)的生根子鱗莖苗高生長至3～5cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養(yǎng)1～2個月至成苗；(10)定植將步驟(9)的移栽苗定植在溫室內的盆缽中，培養(yǎng)6～10個月至植株。2、根據(jù)權利要求1所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為-(1)基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖2040g/L，瓊脂79g/L，pH5.65.8;(2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L和NAA0.lmg/L+蔗糖30g/L;(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基MS+BA0.lmg/L和NAA0.5mg/L+白糖40g/L;(4)子鱗莖保存培養(yǎng)基1/2MS+BAO.Olmg/L和NAA0.05mg/L十庶糖或白糖20g/L;(5)鱗莖生長培養(yǎng)基MS+BA0.05mg/L和NAA0.lmg/L+白糖40g/L;(6)生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.25mg/L+白糖20g/L。3、根據(jù)權利要求1所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的滅菌處理是經(jīng)體積比75%酒精浸泡0.51.0min，再用重量/體積比0.1%升汞溶液滅菌1015min，最后用無菌水沖洗35次。4、根據(jù)權利要求1所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于，所述的各脫毒組培階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25士2'C，光照光強為10002500Lx，光照時間為10h/d。5、根據(jù)權利要求1所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于，所述的組培鱗莖保存的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為10士2'C，光照光強為5001000Lx，光照時間為8h/d。6、根據(jù)權利要求1所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積比h2:2配制而成。7、根據(jù)權利要求1所述的洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于所述的洋水仙病毒病原種類的鑒定包括如下步驟(1)取病樣取洋水仙花葉病害病樣，-S(TC儲存?zhèn)溆茫?2)電鏡觀察取病汁液經(jīng)負染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)；(3)病毒的提純利用差速離心和蔗糖階梯式密度離心的分離法，對感染葉片的有關病毒進行分離、純化；(4)病毒種類的鑒定利用RT-PCR檢測和鑒定洋水仙的病毒種類。全文摘要本發(fā)明涉及一種洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，屬植物病毒保存
技術領域：
，包括如下步驟病毒病原種類的鑒定、培養(yǎng)基的配制、脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)、病毒ELISA檢測、病毒摩擦接種、病毒的鱗莖保存。本發(fā)明的優(yōu)點是利用洋水仙脫毒組培鱗莖感染提純病毒，再進行洋水仙組培鱗莖保存病毒，克服了傳統(tǒng)保存的不足，可防止病毒混雜與丟失，且易提取制備高滴度病毒，為抗病毒育種和病毒檢測抗血清制備中提供高純度的病毒，降低了保存成本并提高了保存效果，并便于攜帶交流。文檔編號C12N7/00GK101215551SQ20081005930公開日2008年7月9日申請日期2008年1月16日優(yōu)先權日2008年1月16日發(fā)明者呂永平,剛徐,林林,汪一婷,牟豪杰,曄程,鄭紅英,陳劍平申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院